Для сегодняшней системы здравоохранения и кардиологических служб одним из ключевых разделов коррекции постинфарктного периода является регенеративная терапия, которая, в отличие от медицины традиционной, стимулирует и часто создает буквально с «нуля» способность миокардиальной ткани к самовосстановлению. Актуальной задачей является поиск наиболее адекватного пути введения, способов доставки и протоколов использования продуктов клеточной технологии или биопрепаратов с таргетным ресурсом вместо химических или рекомбинантных лекарственных препаратов. Большая роль при клеточной терапии острого инфаркта миокарда (ОИМ) отводится технологическим платформам. В связи с этим биоинформатика как современный виток информационных технологий применяется в различных отраслях регенеративной биомедицины для моделирования и оптимизации поведения биологических систем, в том числе для своевременной и правильной терапии постинфарктного состояния.

В течение последних нескольких лет терапия с использованием стволовых клеток (СК) показала себя как многообещающее направление, позволяющее восстановить утраченные вследствие инфаркта миокарда (ИМ) функции сердца. Зарегистрировано большое количество случаев, подтверждающих эффективность применения СК. В настоящее время активно разрабатываются пути восстановления и замены поврежденных клеток миокардиальной ткани вследствие ОИМ. Для этого требуются новые протоколы инструментария и способы таргетной доставки СК к поврежденному органу. Путь введения лекарственного вещества в организм может во многом определять его эффективность, силу и длительность воздействия. Проблема наиболее адекватного пути введения сохраняет свою актуальность и при использовании химических и рекомбинантных лекарств, потеря активности которых часто происходит в результате метаболизирования или связывания с белками, и при приеме биопрепаратов на основе клеток или их производных. Подходы по регенерации пораженной инфарктом миокарда ткани требуют обязательной проработки оптимального способа введения продуктов клеточных технологий или биопрепаратов с таргетным ресурсом. До сих пор ни один современный метод лечения не может обратить неизбежный процесс утраты сердечной функции. Поэтому новые стратегии исследования регенерации сердца вызывают повышенный интерес. Для современной медицины важнейшим этапом развития терапии ИМ становится регенеративная биомедицина, включающая в себя биомаркерный мониторинг изменений миокарда и трансплантацию стволовых кардиомиоцитов в зону поражения миокарда.

В секторе реальной практики ощутимо присутствуют три альтернативных пути восстановления или замены поврежденных тканей или клеток и клеточных систем: трансплантация; имплантация; клеточная и тканевая инженерия. Цель последней является конструирование и выращивание вне организма человека живых, функциональных клеток для последующей трансплантации пациенту или лицу из группы риска, у которых на месте первичного дефекта восстанавливается трехмерная биоструктура (например, сеть кардиомиоцитов в зоне постинфарктного рубца), т. е. происходит регенерация ткани, а не простое замещение ее синтетическим материалом.

Существуют следующие способы доставки СК в поврежденную область:

— внутривенный метод. Инъекции назначают избирательно, только у пациентов после ИМ, поскольку этот метод доставки основан на физиологических хоуминг-сигналах, отсутствующих в случае хронической сердечной недостаточности (ХСН);

— интрамиокардиальный метод посредством чрескожных катетеров является достаточно инвазивным, но вместе с тем самым прямым, точным и эффективным методом доставки [4];

— интракоронарный метод доставки обеспечивает прямой доступ клеток через коронарные сосуды к интересуемой области сердца. Данный метод является безопасным и эффективным, но имеет одно главное ограничение — клетки не могут достигнуть областей миокарда, которые плохо перфузируются [9].

Интракоронарные инъекции клеток, предшественников кардиомиоцитов, пациентам с дисфункцией левого желудочка (ДЛЖ) после оперативной реваскуляризации увеличили фракцию выброса левого желудочка (ФВ ЛЖ) на 12,3% по сравнению с исходными данными, сократив размер рубца и улучшив качество жизни пациентов [5].

Особое значение в последнее время уделяется протоколам программирования и репрограммирования СК (в том числе с помощью переноса генетического материала, нокдауна генов или воздействия специальными индукторами/ингибиторами сигнальных каскадов). Однако практически каждый успешный подход по программированию стволовых клеток имеет негативные аспекты, причиной которых могут являться сложные и взаимосвязанные сети сигнальных реакций клетки. Так или иначе, любое воздействие на клетку оказывает влияние на ее поведение. Отрицательные и положительные петли обратной связи и высочайшая чувствительность СК к сигнальным факторам обязательно приводят к побочным, нежелательным эффектам, которые могут, с одной стороны, аннулировать или уменьшать силу программируемого эффекта, а с другой — приводить к частичной дерегуляции процессов жизнедеятельности клетки, ее гибели или трансформации.

Подходы по регенерации пораженной ИМ ткани требуют обязательной проработки оптимального способа введения продуктов клеточных технологий или биопрепаратов с таргетным ресурсом.

Среди таких способов доставки особое место занимают экзосомы — лабильные частицы, эффекты которых на целевые клетки и орган могут меняться при колебаниях рН (условия ишемии и стресса).

Внутриэкзосомальный способ адресной доставки молекул имеет ряд ключевых преимуществ: большая емкость экзосом, отсутствие эффекта вторичного воздействия (снижение действия при повторном применении), высокая точность доставки и возможность оперативного выбора наиболее подходящего типа экзосом с учетом индивидуальных особенностей и изменений в состоянии пациента в ходе лечения.

Экзосомы могут выступать в роли посредников в сигнальных реакциях между клетками, причем состав экзосом контролируется клеткой-продуцентом. При этом любые значительные изменения в микроокружении экзосом-продуцирующих клеток сказываются на их свойствах и поведении, начиная с высвобождения нановезикул, их транспорта и селективности слияния с клеткой и заканчивая характером возбуждаемых в клетках-реципиентах сигнальных реакций.

Экзосомы могут действовать и как переносчики β-катенина — основного регулятора активности канонического сигнального пути Wnt/β-катернин и важного участника в межклеточных взаимодействиях и адгезии. Сигнальный путь Wnt является важнейшим регулятором фундаментальных процессов клетки и остается, пожалуй, самой противоречивой и перспективной мишенью для разработки препаратов с регенерирующим ресурсом при ИМ [1].

Доказано, что активность пути Wnt повышается после инфаркта и участвует в регенерации ткани миокарда, активируясь в эндотелиальных клетках, фибробластах, прогениторных клетках сердца [6]. Избыточность функций сигнальных путей Wnt и неопределенность в проявлении эффектов при одних и тех же воздействиях на их компоненты связана с чрезвычайной сложностью этих сигнальных путей, наличия десятков факторов и ко-факторов на каждом этапе трансдукции сигнала. Тем самым различия в их окружении и состоянии самих клеток становятся причиной преобладания одних воздействий пути Wnt над другими.

Трансплантированные клетки приживаются с трудом (более 90% введенных клеток теряются) — это ключевая проблема при их трансплантации, учитывая плохое кровоснабжение после сердечного приступа и активный воспалительный процесс. Благодаря научным достижениям в области биоматериалов, СК и биомиметики были созданы уникальные возможности для изготовления в лаборатории из комбинаций внеклеточных матриц («скаффолдов») тканей, клеток и биологически активных молекул.

Важным аспектом является наличие необходимого количества функционально активных клеток, способных дифференцироваться, поддерживая соответствующий фенотип и выполняя конкретные биологические функции. При этом источником клеточной массы могут быть клетки-предшественники различных ростков, различного происхождения и уровня дифференцировки.

Используемые клетки часто классифицируют по их происхождению:

— из аутологичных клеток из того же индивидуума, которому они будут реимплантированы. Аутологичные клетки имеют наименьшее количество проблем с отторжением и патогенностью передачи, но в некоторых случаях могут быть недоступны;

— из аллогенных клеток, получаемых из организма донора того же вида. Например, применение кожных фибробластов крайней плоти человека было продемонстрировано иммунологически безопасным и, таким образом, подходящим выбором тканевой инженерии кожи;

— из ксеногенных клеток, выделенных от особей другого вида. В частности, клетки животных широко использовали в экспериментах, направленных на строительство сердечно-сосудистых имплантатов;

— из сингенных клеток, выделяемых из генетически идентичных организмов, таких как близнецы, клоны или в исследованиях инбредных моделей животных;

— СК — недифференцированные клетки, способные к делению в культуре, приводят к возникновению различных форм специализированных клеток. СК используются для репарации пораженной ткани или для выращивания нового органа.

СК — важнейший восстановительный резерв в организме в связи со способностью давать множество разнообразных клеточных типов, в отличие от первичных клеток, которые имеют низкий потенциал к росту и размножению. СК используются для замещения дефектов, в том числе фиброзных (рубцовых), формируемых в постинфарктном периоде. Это в значительной степени приостанавливает процесс (эффект превенции), предупреждая его прогрессирование и переход на стадию клинической манифестации.

Клетки часто имплантируются или «затравливаются» в искусственную структуру (скаффолды), способную поддерживать формирование трехмерной ткани. Скаффолды обычно применяют для: 1) обеспечения прикрепления клеток; 2) сохранения клетки и биохимических факторов; 3) оказания механических и биологических влияний для изменения протекания клеточной фазы; 4) защиты трансплантированных клеток от иммунологической атаки.

Для достижения цели реконструкции тканей скаффолды должны соответствовать некоторым специфическим требованиям: хорошая растворимость в контактирующей ткани; высокая пористость, размер пор, достаточный для диссеминации клеток и проникновения по всей структуре как клеток, так и питательных веществ; биоразлагаемость; скорость, с которой происходит разложение, должна, насколько это возможно, совпадать со скоростью формирования ткани. В то время как клетки создают собственную структуру матрицы вокруг себя, скаффолд обеспечивает структурную целостность, а, в конечном итоге, разлагается, оставив неоткань. Примерами таких материалов являются коллаген или некоторые линейные алифатические полиэфиры — полилактидная кислота (PLA), полигликолиевая кислота (PGA) и поликарполактон (PCL), обладающие идеальными свойствами и функциональными требованиями (синтетическое производство, биосовместимость, нон-иммуногенность, наноразмерные волокна, низкая концентрация, скорость реабсорбции и т. д.). Скаффолды можно изготавливать из природных биоматериалов — различных производных ECM. Белковые вещества, такие как коллаген или фибрин, и полисахаридные материалы, как хитозан или гликозаминогликаны (GAGs), оказались подходящими с точки зрения совместимости клеток, но все еще остаются некоторые проблемы с потенциальной иммуногенностью. Замещенные группы скаффолда могут быть полезны в доставке небольших молекул (ЛП) в определенные ткани.

Необходимость получения функционально активных клеток (в частности, кардиомиоцитов) заставляет формулировать принципиально новые технологические платформы, ориентированные на получение иммуносовместимых популяций, пригодных для прямого использования в целях регенеративной терапии.

Важным направлением развития способов поиска новых ЛП из клеточных семейств являются протоколы «рационального дизайна», где активная роль отводится методам функциональной биоинформатики (виртуальный скрининг и др.), позволяя существенно снижать издержки на стадии первичного скрининга и минимизировать процедурные этапы поиска и селекции финальной версии продукта. Идентификация фрагментов молекул, составляющих синтетические матрицы, закладывает основу для рационального дизайна субстратов при создании культур клеток, где дальнейшее улучшение их созревания с использованием растворимых факторов или трехмерного дизайна происходит управляемо, без влияния малоизученных или случайных факторов из биоматриц. Стала реальностью и смена исходов лечения — с хронизации и инвалидизации на полное выздоровление, что радикально меняет качество жизни реабилитантов.

Существующие в мире технологические платформы пока лишены возможности получать специализированные клетки надлежащего качества для прямого клинического применения. В этой связи появляется еще одно новое направление — технология направленного перепрограммирования, или трансдифференцировки, иллюстрирующая один из наиболее вероятных путей получения специализированных клеток. Сегодня чрезвычайно активно идут исследования по трансдифференцировке клеток легкодоступных типов в клинически значимые популяции, избегая при этом промежуточные стадии дифференцировки.

Для повышения терапевтической активности адресных популяций разрабатывают методы модифицирования клеток с целью придания им определенных терапевтических свойств. Для этого используют гены факторов роста, цитокинов или сигнальных молекул, стимулирующих клетки к продукции биологически активных соединений и увеличивающих их жизнеспособность и выживаемость после трансплантации в поврежденные ткани. Ожидается, что использование этих технологий позволит уже в ближайшие годы заметно повысить эффективность клеточной терапии ОИМ.

Биоинформатика находит свое применение во множестве аспектов регенеративной медицины, помогая при помощи компьютерных моделей прогнозировать и оптимизировать поведение реальных биологических систем, позволяя выбрать приемлемую тактику поведения для лечения постинфарктного состояния, подходя к каждому пациенту индивидуально, что осуществляет идею предиктивно-превентивной и персонифицированной медицины (ПППМ). Преимуществом такого подхода является экономичность — нет необходимости проводить множественные клинические испытания, достаточно лишь подтвердить или опровергнуть наиболее успешные компьютерные модели in vitro и затем in vivo. Кроме того, in silico эксперимент позволяет экономить время на исследование. Некоторые приемы биоинформатики и их применение в изучении стволовых клеток рассмотрены на примерах следующих исследований. Одной из главных задач в начале исследования применения стволовых клеток является их обнаружение. Множество исследований последних лет направлено на обнаружение набора генов, также названного признаком «стволовости», позволяющего определить СК. В 2015 г. группой исследователей [8] был разработан новый инструмент для анализа «стволовости»  — StemChecker. Принцип его работы основан на исследовании наличия у клетки около 50 известных признаков “стволовости”, выявленных по данным экспрессии геном, РНК-скрининга, сайтов связывания транскрипционных факторов, данным литературы и компьютерных анализов. Выходным результатом программы являются результаты анализов по трем направлениям:

 — перекрытие исходных генов с генами «стволовости» и их статистическая значимость (p-значение);

—  наличие отдельных генов в найденном наборе «стволовости»;

—  наличие мишеней для плюрипотент-ассоциированных факторов транскрипции.

Показано также применение математических моделей в разработке синтетического субстрата для культуры СК [6]. Материалы с наилучшими признаками в данном исследовании предоставили воспроизводимую и экономически выгодную альтернативу биологическим матрицам.

Моделирование взаимосвязи между давлением и объемом в условиях сжатия ткани позволило рассчитать индекс удержания клеток и определить, какой дизайн иглы будет обеспечивать наиболее приемлемый профиль удерживания в присутствии сжатия. В этих условиях отмечено, что по сравнению с прямой иглой с отверстием на конце или прямой иглой с боковыми отверстиями, изогнутые иглы с боковыми отверстиями обеспечивают высокую степень удержания, позволяя увеличить время введения инъекции, не достигнув пределов соотношения давления и объема в ткани. А. Behfar и соавт. [2] при помощи компьютерного моделирования показали, что равномерное распределение СК по длине подающей иглы при их инъекционном введении в тандеме с изменением направления инъекции может являться стратегией для ограничения ранней потери клеток.

Стоит также упомянуть про базы данных и предоставляемые ими веб-инструменты по СК, содержащим упорядоченную и актуальную информацию по различным аспектам, связанным с применением СК в регенеративной медицине.

LifeMap [3] содержит большой набор данных, полученных в результате анализа генной экспрессии и источников литературы и относящихся к дифференцировке СК, эмбриональному развитию и регенеративной медицине. Информация доступна для разных типов клеток, например ЭСК, ПСК, взрослых СК и полностью дифференцированных соматических клеток человека и мышей.

ESCAPE (The Embryonic Stem Cell Atlas from Pluripotency Evidence) [10] — база данных, разработанная на основании анализа опубликованных экспериментов с участием ЭСК человека и мышей. Она содержит различные типы данных, включая данные белок-белковых и ДНК-белковых взаимодействий. Также ESCAPE предоставляет инструменты для построения подсетей, позволяющих на основе известных сетей отображать взаимодействия выбранных молекулярных структур.

StemCellNet [7] является по большей части инструментом создания сети в области биологии стволовых клеток. Наборы данных включают физические белковые взаимодействия, ген-белковые, наборы генов «стволовости». Функциональная возможность инструментов построения сетей является наиболее широкой из известных в настоящее время.

Использование этих технологий (в том числе, предлагаемой нами модели транспортируемых экзосом) позволит уже в ближайшие годы заметно повысить эффективность клеточной терапии ОИМ, а возможно, и успешность фармакопревентивных и фармакореабилитационных мероприятий среди лиц из групп особого риска по атеросклерозу и ИБС.

Таким образом, регенеративная терапия сегодня — это восстановление поврежденных тканей посредством клеточных манипуляций, один из активно продвигаемых трендов медицинской науки и практики. Более того, сложно обойти стороной и тот факт, что предложенный проект актуален в концепции ПППМ — новой модели практического здравоохранения, позволяющей осуществлять адресный контроль за состоянием здоровья популяции и диктующей необходимость рождения алгоритмов диагностики, прогнозирования и профилактики принципиально новых генераций.