Понимание физиологических процессов, происходящих в неповрежденной слезной железе (СЖ), определение нормального морфологического строения, исследование клеток-предшественников, идентификация и характеристика отдельных типов клеток имеют первостепенное значение для изучения механизмов ее различных заболеваний. В обзоре представлен анализ результатов прогресса, достигнутого в отношении изучения клеточных культур СЖ.
Слезная железа представляет собой трубчато-ацинарную экзокринную железу, состоящую из ацинарных, протоковых и миоэпителиальных клеток. СЖ, являясь результатом реципрокных эпителиальных и мезенхимальных взаимодействий, имеет общий вектор эмбрионального развития с такими репрезентативными эктодермальными органами как слюнные железы, волосяные фолликулы и зубы.
Выделяют три стадии морфогенеза органа:
1. Стадия презумптивной железы (на 7—8-й неделе гестации) характеризуется утолщением эпителия конъюнктивы верхнего свода и уплотнением окружающей мезенхимы.
2. Стадия зачатка характеризуется появлением узелковых образований в зоне верхнего конъюнктивального свода и завершается формированием просветов внутри эпителиальных зачатков.
3. Стадия созревания железы происходит на 9—16-й неделе гестации. На этом этапе СЖ морфологически начинает напоминать железу взрослого человека [1].
Для эффективного функционирования органа необходимо трехмерное распределение долек ацинусов, протоков и миоэпителиальных клеток. Первичный секреторный аппарат состоит на 80% из ацинарных клеток. Люминальные стороны ацинарных клеток соединены с секреторными протоками, которые составляют 10—12% от общей популяции клеток СЖ [2].
Подобно ацинарным клеткам поджелудочной и слюнных желез, в ацинарных клетках СЖ имеются плотные соединения, которые разделяют плазматическую мембрану на апикальную и базолатеральную части. Эти плотные соединения ответственны за создание поляризации клетки, которая обеспечивает однонаправленную секрецию белков [3]. Базолатеральная часть ацинарных клеток, обладающая рецепторами для нейротрансмиттеров и нейропептидов, содержит транспортные белки и ионные каналы, используемые для диффузии электролитов и секреции воды. Ядро, аппарат Гольджи и эндоплазматический ретикулум располагаются в основном в базальной части ацинарной клетки, в то время как в апикальной имеются многочисленные секреторные гранулы, содержащие белки. Протоки СЖ выстланы кубовидным эпителием. Подобно ацинарным, клетки, выстилающие протоки, также содержат люминальные плотные соединения, создающие поляризацию клетки. Протоковые клетки не имеют большого количества секреторных пузырьков, секретируя ограниченное количество белка [4].
Другой тип клеток СЖ — миоэпителиальные клетки. Они окружают ацинарные и протоковые клетки и, обладая множественными отростками с базальной стороны, способствуют вытеснению первичного ацинарного секрета в просвет протоков. Поскольку отростки содержат актин гладких мышц, считается, что они участвуют в сокращении протока и продвижении водного компонента слезы на глазную поверхность. Доказательством этому является экспрессия миоэпителиальными клетками рецепторов для нескольких нейротрансмиттеров, которые стимулируют секрецию белка ацинарными клетками [5, 6]. Сделано предположение, что миоэпителиальные клетки выполняют структурную функцию, помогая железе поддерживать свой «каркас» [7].
Помимо ацинарных, протоковых и миоэпителиальных клеток СЖ содержит различные типы лимфоцитов, экспрессирующих иммуноглобулины IgA, IgG, IgE, IgM и IgD, а также плазматические, тучные клетки и макрофаги [8]. K. Kett и соавторы показали, что в СЖ человека более 50% мононуклеарных клеток составляют плазматические клетки, большинство из которых являются IgA-позитивными [9].
Слезная железа является основным органом иммунного надзора системы глазной поверхности. Она секретирует белки IgG, IgM, мономерные и полимерные IgA, SIgA и IgE, лактоферрин, лизоцим, пероксидазу и секреторную фосфолипазу A2, дефенсины и фактор, ускоряющий распад C3-конвертазы [10]. Из сосудистой сети СЖ в слезную жидкость поступают плазматические клетки, лимфоциты, дендритные клетки и макрофаги, которые обеспечивают иммунную защиту глазной поверхности. Функциональная слезная единица, в состав которой входит СЖ, находится под контролем афферентных нервов роговицы и конъюнктивы, а также парасимпатических и симпатических эфферентных нервных волокон, что обеспечивает оптимальный объем и качество секреции слезы в ответ на экзогенные факторы [3]. СЖ вырабатывает также ряд факторов, таких как эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста-α/β, основной фактор роста фибробластов (FGF), гепатоцитов и тромбоцитов, необходимых для развития и функционирования органа в онтогенезе [11, 12].
Эмбриогенез СЖ связан с взаимодействием эмбрионального конъюнктивального эпителия и периокулярной мезенхимы [13]. Высвобождение фактора роста фибробластов-10 (FGF-10) повышает экспрессию гена PAX6 и ведет к развитию СЖ из утолщения эмбрионального конъюнктивального эпителия [14]. Процесс ветвления протоков и увеличение концентрации мезенхимальной ткани происходит под дополнительным влиянием сигналов BMP-7 (Bone Morphogenetic Protein-7), активируемых геном фактора транскрипции FOXC1 (forkhead boxC1). В передаче сигналов FGF принимают участие некоторые поверхностные протеогликаны, которые являются частью сигнального пути семейства WNT (Wingless Int-1) [15]. Передача сигналов FGF взаимодействует с фактором транскрипции Barx2 (Homeobox protein BarH-like 2) в эпителии СЖ, регулируя экспрессию двух матриксных металлопротеиназ (MMP-2 и MMP-9), участвующих в ремоделировании экстрацеллюлярного матрикса [16]. В последующем MMP-2 и MMP-9 секретируются в мезенхиму, высвобождая из протеогликанов FGF-10. По механизму положительной обратной связи концентрация FGF-10 увеличивается вплоть до стадии образования эпителиального зачатка СЖ. В то время как сигнальные пути передают основную направляющую информацию в процессе морфогенеза СЖ, факторы транскрипции являются завершающими «исполнителями» программы развития, физиологическое значение которых еще полностью не раскрыто. Отчасти это связано с тем, что первоначальным объектом, наиболее доступным для изучения, считаются мезенхимальные клетки. Известно, что они являются предшественниками эпителиальных клеток, но их транскрипционный фактор и функциональное значение остаются до конца не изученными.
Слезная железа подобно секреторным железам различного типа, включая слюнную, поджелудочную и молочную железы, имеет способность к регенерации [17—20]. Это показано на модели травмы СЖ взрослых мышей. После инъекции в экстраорбитальную долю СЖ провоспалительного цитокина интерлейкина 1 (IL-1) в течение 2—3 дней констатировали начало пролиферации популяции мезенхимальных клеток, меченных нестином [21]. Следует отметить, что часть нестин-позитивных клеток экспрессировала α-SMA — маркер миоэпителиальных клеток, который подтверждал общее происхождение ацинарных и миоэпителиальных клеток, участвующих в процессе репарации [22]. В эксперименте посттравматические изменения в СЖ запускают процессы, аналогичные эмбриогенезу органа. Это происходит благодаря вторичным мессенджерам, таким как инозитолтрифосфат, которые могут легко диффундировать между клетками и активировать нестимулированные клетки за счет соединительных комплексов, связывающих эпителиальные клетки СЖ. D. Voronov и соавторы также показали наличие общих эпителиальных предшественников, дающих начало как ацинарным, так и миоэпителиальным клеткам, демонстрируя идентичность путей развития и регенерации органа [23].
Благодаря своей относительно простой структуре и доступности СЖ человека является подходящим объектом для потенциального применения в регенераторной медицине. Нарушение продукции и/или выделения слезы на глазную поверхность может развиваться вследствие хронического дакриоаденита при системной патологии: IgG4-связанном заболевании, саркоидозе, гранулематозе с полиангиитом, синдроме Шегрена, синдроме Черджа—Страусса, болезни Крона, болезни Стилла и др. Возможности лечения пациентов с воспалительными заболеваниями СЖ ограничены отчасти из-за отсутствия эспериментальных платформ для изучения патофизиологии железы. В настоящее время это направление активно изучают с целью разработки новых подходов к лечению хронических дакриоаденитов на фоне системных и аутоиммунных заболеваний [24—27].
В приведенной выше литературе представлены данные о возможности культивирования клеток СЖ на животных моделях in vitro. Однако клеточная культура человека остается до настоящего времени относительно не изученной [28—35]. Разрабатываемые модели in vitro и in vivo направлены на исследование секреторного потенциала эпителия СЖ, его регуляции и этиопатогенеза поражения органа.
За последние два десятилетия произошли изменения в процедуре культивирования ацинарных клеток СЖ in vitro. Так, C. Oliver и соавторы опубликовали один из первых отчетов о культивировании популяции морфологически дифференцированных делящихся ацинарных клеток железы крысы с использованием 3D-культивирования [36]. Ацинарные клетки пролиферировали на базальном матриксе и имели цитоплазматические секреторные гранулы. Однако разработанная система культивирования смогла поддержать рост эпителиальных клеток только в течение 6—7 дней, после чего происходил чрезмерный рост фибробластов. Культура ацинарных клеток СЖ кролика впервые получена M. Meneray в 1994 г. В описанных условиях культивирования интактные ацинусы кроликов в течение 14 дней сохраняли морфологическое строение и физиологическую реактивность, сходную со СЖ. Затем происходило изменение большей части ацинарной организации и клеточной поляризации [31, 37]. Ввиду этого L.E. Hann и соавторы акцентировали внимание на важности состава среды, внеклеточного матрикса, количества реагентов для оптимального роста и функциональности ацинарных клеток железы [38].
Основная проблема, с которой столкнулись исследователи, заключалась в невозможности пролонгировать жизнеспособность ацинарных клеток in vitro. Этот вопрос оставался нерешенным до тех пор, пока A. Schonthal и соавторы в 2000 г. не применили в составе среды EGF дигидротестостерон (DHT) и культуральные среды Matrigel и HepatoStim [39]. L. Long предложил пролонгировать жизнеспособность ацинарных клеток за счет использования полиэфирсульфона, амниотической мембраны в качестве скаффолдов и ротационной системы культивирования клеток СЖ крысы и кролика in vitro [40—42]. Используемые в настоящее время условия для культивирования in vitro секреторных клеток подтверждают мимикрию их паттерна секреции in vivo. Об этом свидетельствует наличие в культуральном супернатанте секреторного IgA, лактоферрина, лизоцима, лакритина и ряда других белков, продуцируемых СЖ, уровень которых возрастает в ответ на альтерацию [43].
По мнению D. Zoukhri и соавторов, при воспалительном повреждении СЖ человека первоначально происходят апоптоз и аутофагия клеток, но затем запускается механизм восстановления органа [44]. Это позволило сделать вывод, что активация апоптоза происходит с помощью агонистов фактора некроза опухоли α (TNF-α), которые потенциально инициируют регенерацию поврежденной СЖ. TNF-α идентифицирован как основной цитокин, ответственный за регенераторные и иммуномодулирующие эффекты мезенхимальных стволовых клеток в различных тканях [45]. Результаты исследования M. Lee и соавторов на модели сухого глаза у мышей продемонстрировали улучшение секреции слезы и устранение дефектов глазной поверхности при местном введении TNF-α [46].
S. You и соавторы показали, что инъекция интерлейкина в слезную железу мыши приводит к структурным изменениям ткани железы. Ответная реакция стволовых клеток заключалась в их миграции к месту повреждения и участию в процессах репарации. Однако авторы сообщают о минимальном росте стволовых клеток in vitro из нативной (неповрежденной) слезной железы [47]. Противоположные данные приводят C. Kublin и соавторы, которые в своих исследованиях на культурах клеток крысы и человека установили наличие стволовых клеток в нативной СЖ [48]. Исходя из этого можно сделать вывод, что определение происхождения стволовых клеток или клеток-предшественников, ответственных за регенерацию СЖ, является главным аспектом их изучения. Исследования показали, что они могут иметь мезенхимальное, протоковое, миоэпителиальное или ацинарное происхождение [34, 49]. Стволовые клетки можно также культивировать в условиях in vitro. Нестин-позитивные клетки, выделенные из СЖ, после введения IL-1, могут размножаться in vitro с образованием адипоцитов. Некоторые из этих клеток экспрессировали маркеры мезенхимальных стволовых клеток: виментин, ABCG2 (мембранный белок, относится к суперсемейству АТФ-связывающих кассетных транспортеров), Sca-1 (антиген стволовых клеток-1) и фактор транскрипции Snail-1 (репрессирует транскрипцию) [50]. Последний индуцируется в эпителиальных клетках протоков при их повреждении, активируя эпителиально-мезенхимальный переход. Это позволяет предположить, что клетки протоков могут быть источником мезенхимальных стволовых клеток в процессе регенерации [51]. Исследование миоэпителия нативной СЖ крысы позволило идентифицировать незрелую стволоподобную популяцию клеток, экспрессирующую предполагаемые маркеры стволовых клеток: нестин и ABCG-2. На миоэпителиальное происхождение указывает их способность размножаться в культуре, а затем дифференцироваться в несколько линий [49]. Отдельные клетки, выделенные из культур эпителиальных клеток СЖ, обладают способностью к образованию сфероидов, характерных для стволовых клеток, но не экспрессируют миоэпителиальный маркер α-SMA (гладкомышечный актин) [52]. Использование маркеров клеточной поверхности (c-kit+ Epcam(–) CD31(–) CD45(–) Sca1(–)) при 3D культивировании выявило образование органоидов из эпителиальных клеток-предшественников, которые дифференцировались в протоковые и секреторные клетки [53]. P. Ackermann и соавторам удалось выделить из СЖ взрослых мышей предполагаемые стволовые клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности Sox2, Nanog и Klf4 [54]. Авторы пришли к заключению, что зрелая СЖ содержит эндогенные стволовые клетки или клетки-предшественники, но их идентичность и локализация остаются спорными. Следует подчеркнуть, что в представленных выше исследованиях, сосредоточенных на изучении только определенных типов клеток, для создания культуры использованы СЖ в полном анатомическом объеме [55].
Последующие исследования направлены на оптимизацию состава скаффолдов, сред и разработки методик для идентификации конкретных пулов клеток. H. Lin доказал, что ткань СЖ человека способна экспрессировать ряд маркеров эпителиальных клеток-предшественников in vitro. В тканях железы обнаружены маркеры клеток-предшественников C-Kit, K15, Nestin и P63. Культивированные эпителиальные клетки органа были положительными по панцитокератину, AQP5, Rab3D, ABCB5, C-kit, K15, Ki67 и P63 и образовывали сфероиды, сходные с пространственной конфигурацией СЖ. Эти культивируемые клетки обладали способностью к пролиферации и дифференцировке, что подтверждали результаты ПЦР [56].
K. Yoshino установил, что эпителиальные клетки СЖ, высеянные на матригеле, были сходны с ацинарными комплексами in vivo и образовывали кластеры с центральными полостями, содержащими лактоферрин, а клетки, содержащие фибробласты, образовывали тубулоацинарные структуры и напоминали СЖ человека. При использовании коллагенового геля, содержащего фибробласты, происходило образование только клеточных островков или монослоя, а лактоферрин выявляли в небольших концентрациях. Эпителиальные клетки, высеянные на пластик, образовывали монослой, экспрессия лактоферрина была спорадической. Продукция клетками лактоферрина, измеренная методом ELISA, подтверждена результатами иммуногистохимического исследования. Между субстратами отмечены значительные различия в скорости пролиферации: так, клетки, выращенные на пластике, имели самую высокую скорость пролиферации, а на матригеле и коллагеновом геле — низкую. Таким способом удалось доказать, что матригель способствует ацинарной дифференцировке в большей степени, чем коллагеновый гель и пластик, а включение фибробластов в культуральные субстраты способствует дифференцировке протоков. При этом авторы не проводили исследований, которые могли бы объяснить разницу скорости пролиферации клеток на различных средах [55].
При культивировании эпителиальных клеток СЖ человека S. Tiwari и соавторы обнаружили формирование «сферул» из эпителиальных клеток с протокоподобными образованиями. Представлены предварительные данные о наличии стволовых клеток и протокоподобных клеток в культивируемой среде. Авторы сообщили также о создании функционально эффективных культур СЖ человека in vitro, что подтверждено повышенным (относительно контроля) уровнем секреторного IgA, лизоцима и лактоферрина в конденсированных средах [34].
Исследования последних лет направлены на создание трехмерных культур СЖ человека в бессывороточных условиях. Выращенные свободно плавающие сферы — «лакрисферы» — были обогащены стволовыми клетками (высокая экспрессия CD-117) и обладали повышенной клонообразующей способностью и высоким базальным секреторным потенциалом. Результаты этих исследований не только подтверждают установленную ранее способность клеток СЖ человека расти в двумерных культурах, но и являются доказательством возможности роста в 3D-культурах с сохранением секреторной функции [24, 57]. S. Schrader и соавторами удалось создать трехмерную культуру СЖ кролика в биореакторе в условиях микрогравитации, точно имитируя ее конфигурацию. Однако через 2 нед наблюдения отмечена тотальная гибель культуры клеток в связи с распространяющимся центральным некрозом [42]. Учитывая данный опыт, K. Spaniol и соавторы описали возможность использования неиммуногенного децеллюляризованного тканевого матрикса, полученного из СЖ свиньи. Он позволил эпителиальным клеткам, высеянным на этот каркас, сохранить ацинарные структуры и секреторную способность до 30 дней [58]. H. Lin получил аналогичные результаты на кроликах, подтвердив, что клетки-предшественники СЖ, полученные из сферообразующей культуры, дифференцируются и проявляют секреторную функцию либо в децеллюляризованном матриксе, либо в 3D-коллагеновом геле [29]. Но, несмотря на успехи, в настоящее время все еще существуют проблемы, связанные с оптимизацией метода децеллюляризации, процесса посева, долгосрочных условий культивирования и разработки методов функциональной проверки. Представленные выше работы подчеркивают важность состава сред, субстрата и условий для размножения и сохранения функциональной активности клеток СЖ.
На фоне высокого уровня практических достижений в этой области следующей задачей ученых стала апробация методик культивирования минимального объема ткани с выделением каждого клеточного компонента СЖ человека (эпителиальных, миоэпителиальных, мезенхимальных и прогениторных клеток) [30]. L. Halliday и соавторы применили метод получения культуры СЖ человека из небольшого количества биопсийного материала, взятого при блефаропластике. Клеточные культуры состояли из гетерогенной популяции, которая спонтанно организовалась в трехмерные структуры in vitro.
Экспрессия лизоцима и лактоферрина в популяции указывала на то, что большинство клеток сохраняли свою секреторную функцию (синтезировали водные и белковые компоненты). Это исследование оказалось основополагающим как для понимания механизмов заболеваний СЖ, так и для разработки биоинженерных технологий в офтальмологии [59]. Еще одним перспективным направлением исследований в данной области стало изучение роли FGF10, необходимого для развития СЖ [60—62]. Это связано с установленным фактом, свидетельствующим, что применение FGF-10 в поврежденных железах in vitro и in vivo значительно увеличивает жизнеспособность и пролиферацию эпителиальных клеток за счет уменьшения инфильтрации ткани органа, а также приводит к постепенному снижению скорости пролиферации клеток в постнатальном периоде [63]. Полученные данные подтверждают гипотезу, что сформированные СЖ представляют собой стабильную структуру со сниженной экспрессией FGF-10 и низкой скоростью клеточной пролиферации. Но, несмотря на низкий клеточный обмен в гомеостатических условиях, нативные СЖ обладают высоким регенераторным потенциалом. Они могут восстанавливаться даже после значительного острого повреждения. При хроническом воспалении регенераторная способность желез снижается [64, 65]. Подтверждением этому служат данные секвенирования РНК: экспрессия FGF-10 в зрелых СЖ снижалась по мере прогрессирования воспаления. Авторам удалось проследить передачу сигналов посредством FGFR2b, необходимую для ветвления протоков слезных, мейбомиевых и слюнных желез [66]. Так, проведенная аблация рецептора FGF 2 (FGFR-2) у мышей линии K14rtTA-tetOCre-Fgfr2, экспрессирующих кератин 14 (K14), приводила только к атрофии мейбомиевых желез и не влияла на структуру СЖ, тем самым доказано, что FGFR2 не участвует в гомеостазе. Интерпретация результатов этого исследования была затруднена, так как экспрессию K14 фиксировали во время эмбриогенеза на всем эпителии железы, а в постнатальном периоде обнаруживали только в базальных протоковых и миоэпителиальных клетках [67]. Замедление регенерации эпителия ацинусов после блокады FGFR2b указывает на то, что передача сигналов FGF10/FGFR2b является их обязательным регулятором и не влияет на регенерацию эпителия протоков [68].
Исследования регенераторной способности СЖ имеют большое клиническое значение для разработки потенциальных средств лечения дакриоаденита. Так, в патогенезе аутоиммунного дакриоаденита участвует как врожденная, так и адаптивная иммунная система [69]. Патофизиологический механизм его развития связан с образованием перидуктальных/перивенулярных инфильтратов, содержащих CD4+ и CD18+ T-клетки. Предполагают, что цитокины IL-6, IL-1 и TNF-α играют роль в разрушении ацинарных клеток. Провоспалительная среда способствует активации и созреванию антигенпрезентирующих клеток, которые способствуют индукции T-хелперов 1, 17, аберрантной экспрессии IFN-γ и IL-17 с дальнейшим фиброзом и атрофией секреторных клеток [70]. Разработка универсального протокола для получения функционального дифференцированного секреторного эпителия СЖ, способного экспрессировать тканеспецифические маркеры, является актуальной задачей. Необходимо также продолжать исследования для выявления сигнальных каскадов, лежащих в основе морфогенеза железы, транскрипционных сетей, которые в конечном счете определяют тканевую идентичность. Выяснение природы и происхождения стволовых клеток и клеток-предшественников даст возможность выделения и размножения этих клеток в культуре. Разработка метода культивирования ткани на небольшом объеме образца в перспективе должна гарантировать воспроизведение результатов не только in vitro, но и in vivo. При получении функционально активной культуры клеток СЖ возможно создание модели аутоиммунных заболеваний.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.