Введение

Одним из самых распространенных источников для получения клеточных продуктов в современной регенеративной медицине является жировая ткань. В ней содержатся мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, эндотелиальные клетки различной степени зрелости, гладкомышечные клетки, тканевые макрофаги и лейкоциты [1—4]. Совокупность ядросодержащих клеток жировой ткани называется стромально-васкулярной фракцией (СВФ) [2, 5]. Эффективность и безопасность применения СВФ показаны в большом числе клинических исследований [6—11].

В регенеративной медицине СВФ используют для лечения ран, ожогов, язв, а также в ортопедии для восстановления суставных тканей и хрящей [12—15]. В эстетической медицине СВФ используется для устранения рубцов, растяжек и других косметических дефектов, а также коррекции возрастных изменений [16].

Предложены механический и ферментативный способы получения СВФ [17, 18]. Наиболее распространенным методом получения СВФ на сегодняшний день является ферментативный метод, при котором фермент, а именно коллагеназа, добавляется в измельченный липоаспират и расщепляет коллаген и другие компоненты внеклеточного матрикса. Несмотря на широкое использование ферментативного метода, он не лишен недостатков. Во-первых, длительность процедуры может достигать 1,5—2 часов, что обусловлено длительностью технологического процесса. Во-вторых, сама коллагеназа является относительно дорогим расходным материалом [17].

Данные недостатки стимулировали развитие механических методов получения СВФ. В ряде работ показано развитие различных направлений данной методики от концепта до систем, используемых в практике [19, 20].

Наиболее простой является методика использования специальных переходников, соединяющих два шприца, между которыми перегоняется жир. Как правило, производится до 20—30 пассажей (перегонов) из одного шприца в другой. Следует отметить, что простота данной методики влечет и недостатки, а именно неравномерность механического воздействия на жировую ткань. В просвете цилиндрического отверстия переходника значение напряжений сдвига уменьшается по направлению от стенки переходника к его оси. Выполнение нескольких пассажей может повысить качество обработки, но не может его гарантировать. К тому же, как показано в исследовании, количество неповрежденных клеток снижается пропорционально числу выполненных пассажей [21].

В результате развития технологии появились системы на основе сеточных конструкций [22—25]. Они решают проблему неоднородности полученного липоаспирата, но также требуется 5—10 пассажей для его обработки, что может приводить к дополнительному повреждению жировых клеток [26, 27].

Системы типа Adinizer позволяют гомогенизировать жировую ткань с использованием дисков Adinizer с сеточной конструкцией размером от 600 до 4000 микрон. Количество пассажей уменьшено до 5 [28].

В данной работе рассматривается разработка системы, позволяющей за 1—2 пассажа получить механически обработанный жировой трансплантат, который удовлетворяет следующим требованиям:

— высокая степень однородности биоматериала;

— малый размер фракции полученного продукта, в рамках исследования принят критерий прохождения жирового трансплантата через иглы размером G27, G29;

— параметры выживаемости клеток в полученной СВФ, сопоставимые с ферментативным методом.

Обоснование выбора конструкции

Конструкции на основе сеток позволяют производить более равномерную обработку жировой ткани по сравнению с переходниками, поэтому они являются предпочтительными.

Гидродинамическая проводимость сеточных конструкций может быть оценена по формуле (1):

(1)

где — коэффициент отношения площади шприца к площади ячейки сетки; r — радиус ячейки сетки; η — динамическая вязкость жировой ткани до механической обработки; L — толщина пористой пластины (в нашем случае это толщина проволоки из которой сплетена сетка); n — количество ячеек-пор в сетке. Если сеточная конструкция имеет форму диска с диаметром 10 мм, а динамическая вязкость оценивалась на основе следующих исследований, то гидродинамическая проводимость конструкции на основе сеток с различным размером ячейки и проволоки варьирует

(2)

Однако практическое сравнение сеточных конструкций с различным размером ячейки показало кратное увеличение необходимых усилий, которые необходимо приложить к поршню шприца при переходе от сетки с размером ячейки 1 мм к 500 мкм и 100 мкм сеткам. Это вызвано тем, что ячейки мелкой сетки быстро забиваются внеклеточным матриксом, а эффективная площадь отверстий в конструкции падает, что ведет к кратному увеличению гидродинамического сопротивления и невозможности продавить жир через сеточную конструкцию размерами 100—300 мкм.

Для получения мелкодисперсного липоаспирата после механической обработки необходимо провести фильтрацию липоаспирата, так как забранная у пациента жировая ткань может включать крупные фрагменты соединительной ткани, которые необходимо убрать до начала механической обработки. А затем необходимо сделать каскадную обработку жировой ткани, сначала более крупной сеткой, которая подготовит жировую ткань к прохождению через сетку с размером ячейки 100 мкм без ее значительного забивания.

Исследуемая конструкция коннектора представлена на рис. 1 и состоит из корпуса и крышки. Набор сеток внутри коннектора обеспечивает механическое воздействие на липоаспират. Соединение корпуса и крышки коннектора находится в области 3 (см. рис. 1), то есть после сеточных конструкций в области после сеток достигается наименьшее давление.

Рис. 1. Устройство коннектора с сетками.

1 — область с необработанным липоаспиратом; 2 — область с предобработанным липоаспиратом; 3 — область с обработанным липоаспиратом.

Корпус разработан и распечатан на 3D-принтере из пластика ABS. На рынке представлен широкий выбор плетеных сеток из нержавеющей стали марки AISI 316. Возможны варианты размеров сетки от 26 мкм до 1 мм и более с толщиной проволоки от 25 мкм до 0,5 мм и более. В рамках данного исследования рассматривалась основная сетка с ячейкой 100 мкм, так как фильтры с таким размером ячейки используются при ферментативном методе для фильтрации, к тому же размер ячейки, сопоставимый с размерами игл G27 G29, должен обеспечить прохождение через них липоаспирата после механической обработки.

Несмотря на то, что механически обработанный липоаспират не использовался для пациента, перед исследованием коннекторы и фильтры дезинфицировали медицинским спиртом.

Экспериментальные исследования выбранной конструкции

Процесс забивания сеточной конструкции нельзя оценить теоретически на основе расчетов или математического моделирования, поэтому проведено экспериментальное исследование с использованием лабораторного стенда (рис. 2) [26].

Рис. 2. Блок линейного перемещения.

1 — шаговый двигатель; 2 — перемещающаяся платформа; 3 — датчики силы, 2 штуки; крепление шприцев, 2 штуки; концевой индуктивный датчик, 2 штуки; шприц, 2 штуки; универсальный коннектор.

Стенд посредством двух датчиков силы позволял оценивать необходимые усилия при перегоне жира из одного шприца в другой. Объемная скорость была ограничена 10% от максимально возможной для стенда — 2 мл/с. Технические параметры стенда приведены в табл. 1.

Таблица 1. Параметры автоматизированного стенда

Экспериментальные исследования показали, что при использовании предварительного фильтра с сеткой 1 мм и коннектора с одной сеткой 100 мкм максимально совокупное усилие на поршень достигает 20 кг и более, что ведет к разрушению поршня.

Такие высокие значения прилагаемых усилий вызваны высокой степенью забития сетки 100 мкм и кратным повышением ее гидродинамического сопротивления. Это могло приводить к потере герметичности конструкции, так как сетка 100 мкм при приложении к ней высокого давления может деформироваться, смещаться, а ячейки — растягиваться.

На рис. 3 слева представлен график перемещения платформы стенда и соответсвующее усилие на поршень шприца, из которого выдавливается жир. Вертикальной линией при превышении усилия в 20 кг ячейка сетки 100 мкм растянулась и пропустила необработанную жировую ткань, что наглядно видно при вскрытии коннектора (см. рис. 3, справа).

Рис. 3. График перемещения платформы стенда (оранжевый) и соответствующее усилие (синий) на поршень шприца (слева) и иллюстрация «прорыва» сетки (справа).

Для того чтобы перенести процесс механообработки последней с сетки №2 с размером 100 мкм на предшествующие сетки, размеры сетки в фильтре уменьшались до 700 и 500 мкм, а для сетки №1 размер ячейки уменьшался до 500, 300 и 200 мкм. Усредненные значения усилия на поршне в серии экспериментальных исследований приведены в табл. 2.

Таблица 2. Среднее усилие на поршень шприца при различных значениях сеток в коннекторе

Экспериментальное исследование подтвердило, что использование сетки №1 размером 200 мкм позволяет снизить прилагаемые усилия для механообработки. Все рассмотренные образцы удовлетворяли условию прохождения обработанного липоаспирата через иглы G27 и G29. Использование системы 500/200/100 мкм (Фильтр/Сетка №1/Сетка №2) позволило провести механообработку вручную.

Экспериментальные исследования выживаемости клеток после механической обработки жировой ткани

Материал и методы

Оценку влияния размера ячейки сетки на разрушение жировых клеток при механообработке проводили на образцах липоаспирата. Источником материала были пациенты, проходившие процедуру эстетической липосакции в Научно-клиническом центре №2 ФГБНУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского». Полученный в результате выполнения шприцевой липосакции материал обычно утилизируется, как медицинский отход класса Б.

Для целей нашего исследования разработана форма информированного добровольного согласия пациентов на использование их биологического материала в научно-исследовательских целях. Форма информированного добровольного согласия одобрена локальным этическим комитетом.

В качестве референсного метода получения СВФ рассматривался ферментативный метод.

Ранее показано, что размер сетки №1 может и должен быть больше размера сетки №2. Для оценки зависимости жизнеспособности клеток липоаспирата после механообработки использовался набор сеток от 100 до 300 мкм для сетки №1, от 200 до 500 мкм для сетки №2 (рис. 4).

Рис. 4. Номенклатура размеров сеток, используемых в экспериментальных исследованиях на выживаемость клеток при механической обработке жировой ткани.

Результаты

В табл. 3 представлены результаты для 22 образцов от 8 пациентов. В среднем доля живых клеток в 1 мл для ферментативного метода несколько выше (95%), чем при механической обработке (92,3%), но количество живых клеток при расчете на 1 мл липоаспирата, как правило, выше для механического метода и составляет 10,2 млн клеток/мл по сравнению с 3,3 млн клеток/мл для ферментативного метода.

Таблица 3. Результаты экспериментальных исследований на выживаемость при ферментативном и механическом методах обработки

Коэффициент, показывающий отношение количества жизнеспособных клеток из 1 мл для механического и ферментативного метода, рассчитан по формуле (3):

(3)

Значение коэффициента, усредненного по всем образцам для каждого набора сеток, представлено в табл. 4.

Из табл. 4 видно, что наибольшие значения коэффициента отношения достигаются при наборе сеток, когда вторая сетка имеет размер 100 мкм. Увеличение минимального размера сетки в среднем уменьшает количество жизнеспособных клеток.

Таблица 4. Усредненный коэффициент отношения количества жизнеспособных клеток из 1 мл для механического и ферментативного методов при различных размерах сеток

Заключение

Предложенная система механической обработки липоаспирата позволяет получать низкодисперсный липоаспират с высокой степенью однородности, который можно использовать для клинического применения.

В результате экспериментальных исследований продемонстрирована возможность механической обработки жировой ткани с сохранением жизнеспособности клеток, сопоставимой с ферментативными методами [29]. Следует отметить, что наибольшая жизнеспособность клеток наблюдалась при использовании сетки с минимальным размером ячеек 100 мкм. Полученные результаты будут положены в основу разработки одноразового медицинского изделия для механической обработки жировой ткани.

Работа выполнена в рамках государственного задания FURG-2023-0098 «Разработка медицинских изделий для получения минимально манипулированных клеточных продуктов» Минобрнауки России для ФГБНУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.