Повышенный синтез коллагена фибробластами является одной из основных характеристик склеродермии и тесно связан с ее патогенезом. В основе данной формы тканевого ответа лежит активация фибробластов, вызывающая повышенное отложение клетками внеклеточного матрикса. Результаты многих исследований позволяют предположить, что ключевую роль в данном процессе играет трансформирующий фактор роста-β (TGF-β).

TGF-β₁ повышает экспрессию генов, отвечающих за синтез коллагена I, III, VI, VII, X типов, фибронектина и протеогликанов [1]. В образцах кожи, полученных из очагов поражения путем биопсии, выявлен повышенный синтез TGF-β₁ [2]. Также четко показано увеличение числа рецепторов к фактору в области очагов склеродермии, что свидетельствует о повышенной активности TGF-β₁ при данной патологии [3]. В исследованиях in vitro выявлена корреляция между увеличением числа рецепторов к фактору и повышением уровня матричной РНК α-цепей коллагена I типа [4]. Установлено, что при TGF-β сигнализации повышенная активность AP-1 транскрипционного комплекса коррелирует с повышенной экспрессией гена коллагена I типа [5].

Таким образом, представляется актуальным изучение экспрессии генов компонентов AP-1 транскрипционного комплекса при выраженном развитии склеродермических изменений. В данной работе методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (ПЦР-РВ) изучали уровень экспрессии генов C-JUN, JUNB, JUND, C-FOS, FOSB, FRA-1, FRA-2 в пораженной склеродермией коже.

Материал для биопсий получали от пациентов, проходивших лечение в консультативно-поликлиническом отделении Московского научно-практического центра дерматовенерологии и косметологии с установленным диагнозом очаговая склеродермия. Возраст пациентов варьировал от 25 лет до 71 года. Диагноз «очаговая склеродермия» в каждом случае устанавливался клинически и был подтвержден результатами патоморфологического изучения биоптатов кожи. Согласно клинической классификации Tuffanelli и Winkelmann, у обследованных больных наблюдались бляшечная (7 человек: пациенты 1, 3, 4, 5, 6, 8 и 10) и генерализованная (3 пациента) формы заболевания. Диагностическими критериями генерализованной формы являлись наличие на 1 анатомическую область не менее 4 бляшек, диаметром превышающих 3 см (пациенты 2, 7 и 9), или/и вовлечение 2 анатомических областей и более (пациент 9). Диаметр очагов варьировал от 2 до 40 см и занимал обширные участки тела (табл. 1).

Материал из пораженного и непораженного участков кожи больных склеродермией получали под местной анестезией с помощью дерматологического пробойника (4 мм). Биопсии из непораженных участков кожи брали на расстоянии около 3 см от пораженной кожи [6, 7]. Исследование одобрено комитетом по этике при Институте общей генетики РАН и соответствует принципам, изложенным в Хельсинкской декларации.

РНК из биопсий выделяли на колонках Qiagen по стандартному протоколу RNeasy Mini Kit для кожи. Для освобождения препаратов РНК от примесей ДНК проводили обработку ДНКазой Qiagen. Концентрацию РНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop 1000 («Thermo Scientific», США), после чего образцы выравнивали по концентрации в ddH2O.

Обратную транскрипцию проводили следующим образом. В пробирки для ПЦР объемом 200 мкл вносили: буфер, dNTP, 100 ЕД обратной транскриптазы M-MLV («Promega»), 20 ЕД ингибитора РНКаз RNasin («Promega»), 500 нг oligo(dT) праймеров («ДНК-Синтез») и РНК до конечной концентрации не более 100 нг/мкл. Смесь термостатировали 1 ч при 37 °С.

ПЦР-РВ проводили в 96-луночных оптических плашках с использованием меченных флюоресцентными агентами олигонуклеотидных проб. Для реакции использовали 2,5-кратную реакционную смесь с референсным красителем ROX («Синтол»). Праймеры и пробы были синтезированы фирмой «ДНК-Синтез» (табл. 2).

Амплификацию проводили в ПЦР-амплификаторе («Bio-Rad», «iQ4»), используя следующую программу: 1) денатурация при 95°С в течение 4 мин, 2) денатурация при 94 °С в течение 15 с, 3) отжиг при 55 °С в течение 15 с, 4) элонгация при 72 °С в течение 15 с, 5) этапы II—IV повторяли 50 раз. Экспрессию генов-мишеней нормализовали на «ген домашнего хозяйства» GAPDH. Амплификацию гена GAPDH и исследуемых генов проводили в разных пробирках.

Результаты вычисляли с использованием данных реакции ПЦР-РВ со следующими параметрами: эффективность праймеров в ПЦР-РВ не менее 95%; коэффициент корреляции — не менее 0,99; наклон кривой (slope) –3,4±0,2.

Результаты ПЦР обрабатывали методом 2^-ΔΔCt, который показывает, во сколько раз изменяется экспрессия гена в пораженном образце по сравнению с непораженным [8]. ΔΔCt и ΔCt рассчитывали по следующим формулам:

ΔΔCt = ΔCt_{(пораженной кожи)} -ΔCt_{(непораженной кожи)}, ΔCt=Ct_{(исследуемый ген)}-Ct_(GAPDH).

Эксперименты проводили в трех повторах для каждого образца [8].

Большой интерес для нас представляло сравнение уровней экспрессии генов в пораженной части кожи больных склеродермией по отношению к визуально непораженной части кожи, находящейся на расстоянии не более 3 см от очага у одного и того же больного. Такое сравнение, принятое и в ряде зарубежных лабораторий, позволяет максимально исключить влияние побочных факторов на чистоту эксперимента [9].

Проанализировав ряд статей и баз данных, мы пришли к выводу, что в исследованных процессах, играющих важную роль в развитии склеродермии, в качестве основных транскрипционных факторов присутствуют преимущественно компоненты транскрипционного фактора АР-1. Компоненты транскрипционного комплекса AP-1 могут являться генами-кандидатами при склеродермии по следующим причинам. Транскрипционный фактор AP-1 представляет собой группу парных комплексов, образованных ДНК-связывающими белками, входящими в семейства Jun, Fos и ATF (activating transcription factor). Фактор AP-1 обеспечивает ответ клеток на действие ростовых факторов, цитокинов, нейротрансмиттеров и других межклеточных сигнальных молекул. В регуляции активности AP-1 участвуют G-белки, адаптерные белки, MAP-киназы и другие компоненты внутриклеточных регуляторных систем [10]. Транскрипционный фактор АР-1 участвует в поддержании базального уровня экспрессии многих генов. Он является одной из главных мишеней для индукции коллагена I типа [11]. Его функции тесно связаны с процессами пролиферации и трансформации клеток. Индукция клеточной дифференцировки вызывает активацию транскрипции генов, кодирующих компоненты комплекса АР-1 [10]. Классический фактор АР-1, состоящий из белков Jun и Fos, узнает консенсусную последовательность TGACTCA, встречающуюся в промоторах многих генов.

На основании проведенного нами анализа результатов опубликованных исследований и баз данных мы идентифицировали ряд генов, которые представляются важными для исследования. В их число вошли гены, кодирующие транскрипционный фактор AP-1: C-JUN, JUNB, JUND, C-FOS, FOSB, FRA-1, FRA-2.

При индивидуальном анализе каждого больного показано, что уровень экспрессии гена C-FOS в пораженной склеродермией коже повышен относительно визуально непораженной кожи (контроль) в интервале от 1,1 раза (больной 5) до 9,7 раза (больной 3). Среднее значение изменения уровня экспрессии гена оказалось повышенным в 3,6±1,7 раза (рис. 1).

Уровень экспрессии гена C-JUN в пораженной склеродермией коже был повышен относительно визуально непораженной кожи (контроль) в 1,4-6,3 раза (больные 3 и 4 соответственно). В среднем уровень экспрессии гена оказался повышенным в 3,6±1,0 раза (рис. 2).

При измерении уровня экспрессии гена FRA-1 в пораженной склеродермией коже относительно визуально непораженной показано снижение в интервале от 1,9 раза (больной 4) до 10,2 раза (больной 2). В среднем уровень экспрессии гена оказался пониженным в 4,3±1,2 раза (рис. 3).

Уровень экспрессии гена JUNB в пораженной склеродермией коже был повышен по сравнению с относительно визуально непораженной кожей в 2,0—7,5 раза (больные 2 и 7 соответственно). В среднем уровень экспрессии гена оказался повышенным в 4,2±1,2 раза (рис. 4).

Уровень экспрессии гена JUN-D в пораженной склеродермией коже был повышен относительно визуально непораженной в 1,6—8,2 раза (больные 10 и 7). В среднем уровень экспрессии данного гена был повышен в 4,4±1,5 раза (рис. 5).

Уровень экспрессии гена FRA-2 в пораженной склеродермией коже по сравнению с непораженным был повышен в 1,3—6,7 раза (больные 9 и 5). В среднем уровень экспрессии этого гена был повышен в 4±1,2 раза (рис. 6).

При измерении уровня экспрессии гена FOSB в пораженной склеродермией коже по сравнению с визуально непораженной выявлено повышение от 1,8 раза (больной 1) до 7 раз (больные 5 и 10). В среднем уровень экспрессии гена оказалcя сниженным в 3,6±1,2 раза (рис. 7).

Полученные с помощью метода ПЦР-РВ результаты свидетельствуют об увеличении в пораженной склеродермией коже экспрессии практически всех генов АР-1 системы, кроме гена FRA-1.

Повышенная экспрессия генов компонентов АР-1 системы в пораженной склеродермией коже может быть обусловлена их участием в TGF-β₁ сигнальном каскаде, индуцирующим экспрессию гена коллагена I типа. Склеродермия является хроническим заболеванием соединительной ткани, характеризующимся фиброзом кожи [12], что выражается в патологическом накоплении компонентов внеклеточного матрикса, преимущественно коллагена I и III типов [13], а синтез и секрецию основных белков внеклеточного матрикса, особенно коллаген I типа, в коже человека стимулирует TGF-β [14, 15]. Это косвенно подтверждается результатом ряда исследований [11, 16], в которых блокирование АР-1 системы приводило к ингибированию TGF-β₁ индукции экспрессии гена коллагена I типа.

В частности, установлено, что фибробласты, нокаутные по гену JUN-D, оказывались малочувствительными к TGF-β стимуляции и продуцировали значительно меньше коллагена [17]. Также показано, что повышение уровня экспрессии гена COL1A2, с которого транскрибируется один из двух полипептидов коллагена I типа, достигается за счет TGF-β индукции генов JUN-B и C-JUN [18].

Таким образом, полученный нами результат, свидетельствующий о том, что в пораженной склеродермией коже происходит активация большинства генов АР-1 системы, кроме гена FRA-1, может служить важным дополнением к данным по изучению сигнальных каскадов, активирующих коллаген I типа.