Лепра — хроническое инфекционное заболевание, вызываемое патогенной для человека Mycobacterium leprae, с преимущественным поражением кожи, слизистых оболочек и периферической нервной системы. Несмотря на успехи в лечении лепры с помощью химиотерапии как во всем мире, так и в России, сохраняется опасность инвалидизирующих последствий лепрозного процесса. Речь идет о прогрессировании нейротрофических осложнений у части больных лепрой после окончания стандартной антибактериальной терапии, что приводит иногда к необратимой тяжелой инвалидности с потерей трудоспособности и социальной активности личности. К таким нейротрофическим осложнениям относятся лепрозные нейропатии и трофические язвы. Частота трофических язв у больных лепрой в различных регионах мира достигает 10—50% [1, 2]. В 70—90% случаев язвы располагаются на подошвенной поверхности стопы. По мнению ряда авторов [1, 3], ведущая роль в возникновении нейротрофических язв стоп у больных лепрой отводится специфическому невриту, приводящему к анестезии кожи. В то же время другим определяющим патогенетическим фактором развития трофических язв при лепре (как и при сахарном диабете) являются сосудистые нарушения [4, 5]. Лепрозные и диабетические трофические язвы имеют сходную клиническую картину. Изъязвления наблюдаются на деформированной стопе с натоптышами и омозолелыми краями. Язвы могут проявляться обширными гнойно-некротическими изменениями глубоких тканей. Как у больных лепрой, так и у пациентов с сахарным диабетом такие изменения отличаются длительным течением с высокой резистентностью к проводимой терапии и частыми рецидивами. Лечение трофических язв нижних конечностей любой этиологии является весьма актуальной проблемой в медицинском и социально-экономическом плане [6]. В истории лепрологии использовались различные методы лечения таких язв с разной степенью эффективности [2, 7]. Современная программа лечения трофических язв базируется на принципе этапности и рационального сочетания компрессионного, хирургического и медикаментозного лечения [8]. Успешность медикаментозного лечения в первую очередь обусловлена правильным подбором антибактериальных средств, что связано с идентификацией возбудителей вторичной флоры в трофических язвах. Определение микрофлоры язв, особенно часто рецидивирующих, может помочь в поиске новых подходов к их предупреждению и лечению. Ранее было показано, что патогенная микрофлора с превалированием различных видов стрептококков и стафилококков наблюдалась в содержимом трофических язв у 89,3% больных лепрой [9]. Определение микобактериальной флоры практически не проводилось из-за трудоемкости методов идентификации. И только после открытия молекулярно-генетических методов возможности изучения содержимого язв на наличие микобактериальной флоры значительно расширились.

Цель настоящего исследования — молекулярно-генетическая идентификация микобактерий, выделенных из содержимого трофических язв больных лепрой.

Обследованы 15 больных лепроматозной лепрой в стадии регресса, у которых на подошвенной поверхности стоп отмечались нейротрофические язвы. Все больные находились на стационарном лечении в Научно-исследовательском институте по изучению лепры (НИИЛ). В качестве группы сравнения организована группа из 13 больных сахарным диабетом, также имеющих подошвенные трофические язвы. Группы больных были сопоставимы по полу и возрасту. Материалом для исследования служили соскобы с трофических язв стоп больных лепрой и сахарным диабетом. Перед взятием соскоба поверхность язв обрабатывалась тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором. Для молекулярно-генетической идентификации микобактерий материал собирался одноразовой стерильной палочкой с краев и из центра язв и помещался в пробирку с транспортной средой.

Для установления наиболее чувствительных методов выделения ДНК микобактерий из трофических язв экстракцию проводили из одних и тех же образцов четырьмя различными методами. М1 — выделение ДНК методом, основанным на лизисе нуклеиновых кислот лизирующим раствором («Проба-НК» НПФ «ДНК-технология», Россия); М2 — автоматический метод выделения ДНК набором реагентов (GXT DNA/RNA GenoExtraction Kit) на станции GenoXtract («HainLifescience», Германия); М3 — выделение ДНК набором реагентов GenoLyse («HainLifescience», Германия); М4 — выделение ДНК с помощью 5% бычьего сывороточного альбумина.

Амплификация ДНК осуществлялась с использованием основанного на DNA-STRIP технологии комплекта реагентов и праймеров фирмы «HainLifescience» (Германия):

1) набор GenoType Leprae DR, позволяющий молекулярно-генетически идентифицировать M. leprae и ее устойчивость к рифампицину, офлоксацину, дапсону;

2) набор GenoType Mycobacterium CM (CommonMycobacteria), выявляющий 14 видов микобактерий, таких как: M. avium ssp., M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. marinum/M. ulcerans, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. peregrinum, M. xenopi и комплекс M. tuberculosis;

3) набор GenoType Mycobacterium AS, обеспечивающий идентификацию 16 видов редко встречающихся микобактерий: M. simiae, M. mucogenicum, M. goodi, M. celatum, M. smegmatis, M. genavense, M. lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai/M. intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M. kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum и M. shimoidei.

Полимеразно-цепную реакцию (ПЦР) проводили на термоциклерах Терцик (НПФ «ДНК-технология», Россия). В зависимости от выбранных праймеров применяли от 30 до 50 циклов амплификации. Гибридизацию амплифицированной ДНК выполняли на автоматическом приборе GT-Blot-48 («HainLifescience», Германия). Учет результатов осуществлялся визуально с помощью прилагаемого к каждому набору шаблона и в автоматическом сканирующем устройстве GenoScan («HainLifescience», Германия).

При выделении ДНК методами М1—М4 установлено, что все методы достаточно эффективны. Наиболее чувствительным оказался метод М4, при экстракции которым в трофических язвах обнаруживались микобактериальные ассоциации, в отличие от других методов, при использовании которых в тех же образцах выявлялся только один вид микобактерий. Следовательно, имеющиеся отечественные наборы и реагенты для экстракции ДНК ничем не уступают в эффективности импортным аналогам.

При исследовании образцов на наличие возбудителя лепры комплектом реагентов GenoType Leprae DR у 3 пациентов в соскобах трофических язв были обнаружены ДНК M. leprae. У 2 из них выявлялся «дикий» тип M. leprae с высокой чувствительностью к трем основным противолепрозным препаратам. У третьего больного с вялотекущими трофическими язвами, не поддающимися стандартному лечению, был выявлен «мутантный» штамм M. leprae, характеризующийся устойчивостью к дапсону, рифампицину и офлоксацину.

Комплектом реагентов GenoType Mycobacterium CM почти у половины больных лепрой (46,7%) в трофических язвах выявлены ДНК различных видов микобактерий. Из них с самой высокой частотой (40,0%) идентифицировалась M. scrofulaceum, M. avium встречалась в 26,7%, M. abscessus, M. fortuitum и M. kansasii — в 20,0%, M. xenopi — в 13,3% случаев.

В соскобах с трофических язв от больных сахарным диабетом у 4 из них определялись ДНК пяти видов нетуберкулезных микобактерий, из которых M. scrofulaceum и M. kansasii обнаруживались в 15,4% случаев, в единичных случаях определялись M. avium, M. malmoense и M. fortuitum.

При исследовании образцов с использованием праймеров GenoType Mycobacterium AS как у больных лепрой, так и у пациентов с сахарным диабетом ни один из определяемых набором видов микобактерий не был обнаружен.

Таким образом, в трофических язвах у больных лепрой и сахарным диабетом выявляются нетуберкулезные микобактерии. Кроме того, у больных лепрой в 20,0% случаев в язвах идентифицировалась ДНК M. leprae.

Язвы стоп ввиду своего анатомического расположения и частых обострений подвержены колонизации бактериями и присоединению вторичной инфекции, что затрудняет процессы регенерации. Все это определяет тактику ведения таких больных [7]. Бактериологическое исследование отделяемого язв выявляет, как правило, широкий спектр патогенных микроорганизмов как аэробного, так и анаэробного характера, причем в большинстве случаев превалирует сочетанная микрофлора. Так, T. Lema и соавт. [10] при изучении микрофлоры язв у больных лепрой обнаружили 44% грамположительных и 56% грамотрицательных бактерий. L. Gellati и соавт. [11] при изучении содержимого трофических язв у 16 больных лепрой выявили в 80% случаев рост грамотрицательных бактерий, в 63% — грамположительных кокков, в 36% — смешанной микрофлоры. Чаще всего у больных, находящихся на лечении в НИИЛ, высевались Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa [9]. В комплексной терапии таких пациентов применяют различные антибиотики, но антибиотикотерапия иногда не дает желаемого эффекта. Важную роль в возникновении и прогрессировании трофических язв играет симбиоз патогенных и сапрофитных микроорганизмов. Именно этим микроорганизмам принадлежит патогенетическая роль в поддержании местной воспалительной реакции. Большинство патогенных бактерий может поражать костную ткань, в 80—90% случаев основным этиологическим агентом остеомиелитов считается S. aureus [12, 13]. Однако наличие атипичных микобактерий также может приводить к длительному течению трофических язв и создавать трудности в лечении как при лепре, так и при сахарном диабете. Нетуберкулезные микобактерии повсеместно распространены в окружающей среде. Они существуют в широком диапазоне патогенности для человека от сапрофитных до потенциально патогенных видов, способных вызывать заболевания. Следовательно, колонизация человека микобактериями (временная или постоянная) — довольно распространенное явление. Эта колонизация может повлечь за собой инфекцию или вызвать усугубление тяжести основного заболевания или его осложнений. Так, M. abscessus и M. fortuitum часто обнаруживаются при абсцессах в местах инъекций или вакцинаций, в том числе и у больных сахарным диабетом [14]. Поражения на коже в виде язв, абсцессов могут быть вызваны микобактериями M. avium complex при их прямом проникновении при травматизации кожи, хирургических манипуляциях [15], а M. scrofulaceum часто является причиной лимфаденитов [16]. M. avium complex, M. kansasii и в меньшей степени M. xenopi, а в некоторых регионах и M. scrofulaceum могут вызывать различную легочную патологию [17]. Чаще всего это происходит у пациентов с ослабленным иммунитетом, например, у ВИЧ-инфицированных. Нельзя исключать вероятность того, что эти микобактерии могут влиять на костную ткань, приводя к развитию остеомиелитов. Колонизация трофических язв больных лепрой различными микобактериями, возможно, связана не только с нарушениями иммунного ответа, но и с толерантностью, обусловленной общими антигенными детерминантами данных микобактерий и микобактерий лепры.

Таким образом, на основании результатов проведенного исследования можно заключить, что у больных лепрой, находящихся в стадии клинического регресса, в трофических язвах присутствует и микобактериальная микрофлора, в том числе и M. leprae. В настоящее время накоплен большой опыт по выявлению и лечению бактериальной флоры в трофических язвах больных лепрой [7, 10, 11]. Однако мы не встретили работ по микобактериальной идентификации содержимого трофических язв. Эти микобактерии нелегко было определять в связи с трудоемкостью специализированных (культуральных и биохимических) методов идентификации. И только в последние годы в связи с достижениями в области таксономии, базирующейся на знаниях генетики микобактерий, стало возможным быстро идентифицировать микобактерии.

Возможно, именно присутствие различных микобактерий в содержимом язв, помимо других провоцирующих факторов, создает трудности в лечении и способствует хронизации процесса. Изучение частоты и характеристик микобактериальной флоры трофических язв различной этиологии необходимо для оптимизации схем антибиотикотерапии. Так, например, сообщалось об эффективном лечении кларитромицином гранулематозного дермального инфильтрата, вызванного M. scrofulaceum [18]. Кроме того, была показана высокая активность спарфлоксацина, азитромицина при лечении микобактериозов [19].

Таким образом, у больных лепрой выявлена не только колонизация трофических язв различными микобактериями, но и наличие в них резистентных к лекарственным средствам штаммов M. leprae. Следовательно, применение у этих больных антибиотиков, не входящих в перечень основных противолепрозных препаратов, но обладающих высокой антимикобактериальной активностью, может сыграть существенную роль при лечении больных лепрой с хроническими трофическими язвами, особенно резистентных к стандартной терапии.