При «омоложении» кожи главными целями являются увеличение биосинтетической активности фибробластов, оптимизация физиологических функций, усиление клеточной активности, увеличение синтеза коллагена, эластина и гиалуроновой кислоты, благодаря чему кожа становится более плотной, блестящей и увлажненной [1].

Мезотерапия — метод профилактики и лечения возрастных изменений кожи, в том числе морщин, так как позволяет легко проникнуть во внутренние слои кожи и доставить непосредственно во внеклеточное пространство препараты, необходимые для активизации метаболических процессов стареющих тканей [2].

Одним из эффектов, который достигается при мезотерапии, является пунктуационный, связанный с воздействием иглы на кожу. Микроигольчатая терапия стимулирует выработку коллагена путем запуска синтеза и секреции каскада сигнальных молекул, способствующих ранозаживлению после травмы. Время восстановления после процедуры микроукалываний (микронидлинг) минимальное [3].

Другим эффектом является фармакологическое воздействие лекарства. При изучении фармакокинетики интрадермально вводимых препаратов было показано, что при более поверхностных инъекциях (не более 2 мм глубиной) препарат элиминирует значительно дольше. Создание депо фармакологически активных веществ в коже позволяет доставить непосредственно к клеткам кожи витамины, микроэлементы, микропептиды, биологически активные энергосберегающие вещества, являющиеся строительным и питающим клетку материалом. Этот путь введения дает возможность применять при лечении пациента более низкие дозы препаратов [2].

Наше внимание привлекли препараты, содержащие ДНК- и РНК-комплексы, а также низкомолекулярные фракции пептидов, аптечной сети. Нуклеиновые кислоты выполняют важную роль в процессах жизнедеятельности организма. Их функция заключается прежде всего в сохранении и передаче генетической информации и проявляется в биосинтезе белка [4]. Нуклеиновые кислоты — один из важных компонентов интегрального и иммунологического гомеостаза организма [5].

Геронтологами показано, что при старении наблюдается резкое снижение синтеза многих регуляторных пептидов с потерей чувствительности к ним клеток-мишеней [6]. Экстракты различных животных тканей являются источником получения регуляторных тканеспецифичных пептидов [7]. Эндогенные пептиды участвуют в регуляции дифференцировки и пролиферации клеток, изменяя функциональную активность генома и процессы синтеза белка в зависимости от состояния многоклеточной системы [8]. Пептидные регуляторы являются многофункциональными. Они способны воздействовать как на дифференцированные клетки взрослого организма, запуская пролиферацию клеток и поддерживая при этом тканевую специфичность, так и на полипотентные эмбриональные клетки, индуцируя тканеспецифическую дифференцировку [6].

Цель исследования — изучить влияние мезотерапии полипептидами тимуса и эпифиза, а также препаратом, содержащим нуклеиновые кислоты, на иммуногистохимические показатели кожи.

Трем пациентам в разных стационарах города за 1 нед до плановой абдоминопластики и иссечения рубца на ограниченном участке кожи по методике «глубокий наппаж» вводили нуклеотидный препарат (1-я группа), низкомолекулярные фракции полипептидов тимуса (2-я группа) и эпифиза (3-я группа), изотонический раствор NaCl (4-я группа) и обкалывали кожу иглой (5-я группа). Все пациенты подписали информированное согласие на процедуру. После хирургического лечения кусочки кожи были доставлены на кафедру косметологии ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздрава России для иммуногистохимического исследования (ИГХ) с целью выявления экспрессии маркеров апоптоза (р53), антиапоптоза (Bcl-2), пролиферации (Ki-67), антигена гистосовместимости (HLA-DR) и рецептора к эпидермальному фактору роста (EGFR).

Биоптаты кожи транспортировали из клиники в лабораторию в салфетке, пропитанной 0,9% раствором NaCl, затем образцы кожи 10×10×5 мм монтировали на криостатные блоки и замораживали в холодильнике при температуре –40 °С. Изготавливали криостатные срезы толщиной 5 мкм таким образом, чтобы плоскость сечения проходила вертикально; срезы помещали на предметные стекла, высушивали на воздухе при комнатной температуре не менее 2 ч, затем фиксировали в течение 10 мин в абсолютном ацетоне и высушивали. Приготовленные срезы окрашивали или хранили при температуре –20 °С.

Экспрессию клеточных маркеров определяли методом непрямой ИГХ. ИГХ проводили полимерным методом с использованием системы детекции Super Sensitive IHC Detection Systems («Bio Genex»). Характеристика моноклональных антител к исследуемым маркерам представлена в табл. 1.

После первой инкубации срезы отмывали в буфере в течение 10 мин, затем инкубировали с реактивом Super Enhanser («Bio Genex», США), а после того — с реактивом Polymer-HRP (конъюгат с пероксидазой; компания «Bio Genex», США) в течение 30 мин с дальнейшей 3-кратной промывкой. Затем срезы окрашивали раствором диаминобензидина из набора («Bio Genex», США), препарат разводили по инструкции производителя. Окрашивали 5—15 мин, затем промывали дистиллированной водой, ядра докрашивали гематоксилином Carrazzi. О положительной экспрессии маркеров свидетельствовала коричневая окраска на фоне голубой окраски ядер.

Гистологические препараты фотографировали. По отдельности производили съемку эпидермиса и дермы.

Фотографии обрабатывали с применением программы Морфология 5.0, где выделяли области скопления белка — иммуногистохимического маркера; в зависимости от характера маркера проводили морфометрию. Для определения р53 и Ki-67 подсчитывали количество меченых клеток в поле зрения микроскопа, для Bcl-2 и EGFR — оптическую плотность, для HLA-DR — долю (в процентах) окрашенной площади на препарате. В качестве контроля использовали препараты интактной кожи, показатели которой принимали за 100% (6-я группа).

cтатистическую обработку результатов проводили в программе Statistica 6.1. Соответствие показателей ИГХ нормальному распределению оценивали с помощью критерия Колмогорова—Смирнова. Для выявления различий между группами был проведен однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Внутригрупповые различия выявляли с использованием апостериорных критериев, в частности критерия Тьюки (Tukey HSD). Достоверность различий принимали на уровне р≤0,05.

Следует отметить, что экспрессию маркера p53 в эпидермисе и дерме отмечали в единичных препаратах, поэтому в статистическую обработку не включали.

Межгрупповые сравнения (табл. 2)

В эпидермисе по маркеру Bcl2 (табл. 3)

По маркеру EGFR (табл. 4)

В эпидермисе при внутригрупповом сравнении (табл. 5)

Таким образом, через 1 нед после нидлинга незначительно снижается пролиферация клеток в эпидермисе, в дерме — повышается с аналогичной тенденцией изменений маркера к EGFR, при этом маркер апоптоза не обнаруживается, маркер антиапоптоза практически не изменяется, что не позволяет судить о клеточном обновлении. Механическая травма кожи иглой более чем на 20% повышает экспрессию маркера HLA-DR в эпидермисе, снижая этот показатель примерно на такую же величину в дерме, что не является статистически достоверным.

После однократного введения изотонического раствора NaCl через 1 нед отмечают самое высокое (более чем на 35%) повышение пролиферации клеток в эпидермисе и значительное снижение этого показателя в дерме, при этом экспрессия EGFR практически не изменяется. Маркер апоптоза также не определяется, маркер антиапоптоза практически не изменяется, а показатели HLA-DR снижаются на 10% в эпидермисе и почти на 50% в дерме. Полученные результаты отличаются от тех, которые наблюдались после механической травмы иглой. Нельзя исключить, что, с одной стороны, изотонический раствор NaCl влияет на градиент движения жидкости от базальной мембраны к поверхности рогового слоя эпидермиса, участвуя в повышении клеточной пролиферации и снижая антигенную нагрузку, с другой — способствует разведению основного вещества дермы.

Через 1 нед после однократного введения препарата, содержащего нуклеиновые кислоты, значительно снижается пролиферация клеток эпидермиса и дермы, не обнаруживается маркер апоптоза, не изменяется экспрессия маркеров антиапоптоза и EGFR. При анализе динамики показателя HLA-DR обнаружены его значительное (более чем на 40%) повышение в эпидермисе и снижение (более чем на 20%) в дерме. Влияние нуклеотидного препарата на кожу отличается от нидлинга более выраженным подавлением пролиферации клеток в эпидермисе и дерме, отсутствием влияния на EGFR, более высоким воздействием (на 20%) на антигенпрезентирующие клетки. От изотонического раствора NaCl нуклеотидные препараты отличаются подавлением пролиферации клеток эпидермиса и высоким значением антигенпрезентирующих клеток в эпидермисе.

Низкомолекулярные фракции полипептидов тимуса снижают пролиферацию клеток в эпидермисе, наиболее выраженно в дерме. При отсутствии выявления маркера апоптоза они, единственные в группах сравнения, повышают экспрессию маркера антиапоптоза в дерме, что не исключает повышение выживания клеток и клеточной дифференцировки. Полипептиды тимуса вызывают максимальное повышение (более чем на 50%) антигенпрезентирующих клеток в эпидермисе и минимальное их снижение в дерме, возможно за счет их перераспределения.

Низкомолекулярные фракции полипептидов эпифиза через 1 нед после введения на 20% повышают пролиферацию клеток эпидермиса, снижая этот показатель в дерме. При введении полипептидов эпифиза в эпидермисе и дерме встречались единичные клетки с маркером апоптоза, но аналогично полипептидам тимуса в некоторой степени полипептиды эпифиза повышали экспрессию маркера антиапоптоза в дерме. Они повышают число антигенпрезентирующих клеток в эпидермисе более чем на 40%, снижая их число в дерме.

Однофакторный анализ (ANOVA) сравнения шести групп показал, что проведенные манипуляции оказали влияние на такие маркеры эпидермального слоя кожи, как Ki67 (F=14,47; p≤0,001) и HLA-DR (F=8,02; p≤0,001), но не повлияли на Bcl2 (F=1,71; p≥0,05) и рецептор к EGFR (F=1,41; p≥0,05) (табл. 6).

В дермальном слое анализ сравнения шести групп по фактору однократного введения препарата показал, что проведенные процедуры оказали влияние на такие маркеры, как Bcl2 (F=3,08; p≤0,05), Ki-67 (F=4,26; p≤0,001) и HLA-DR (F=2,58; p≤0,05), но не повлияли на EGFR (F=0,79; p≥0,05) (табл. 7).

Через 1 нед после механической травмы кожи иглой наблюдается очень незначительное перераспределение EGFR в дерму, где отмечается некоторое повышение пролиферации клеток. Рост антигенпрезентирующих клеток в эпидермисе может отражать степень реакции на повреждение эпидермиса.

Введение изотонического раствора NaCl может способствовать пролиферации клеток эпидермиса.

Препарат, содержащий нуклеиновые кислоты, подавляет пролиферацию клеток эпидермиса и дермы, но значительно повышает число антигенпрезентирующих клеток в эпидермисе. Полипептиды тимуса вызывают максимальное повышение антигенпрезентирующих клеток в эпидермисе при снижении их пролиферативной активности, наиболее выраженно снижают пролиферацию клеток в дерме, где больше других препаратов повышают показатели антиапоптоза. Полипептиды эпифиза повышают число антигенпрезентирующих и пролиферирующих клеток в эпидермисе, в небольшой степени повышают показатели антиапоптоза в дерме.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

¹e-mail: tnkor@mail.ru
²e-mail: medicine@nrcerm.ru