Введение

Флуоресцентный анализ в настоящее время является основным методом лазерной медицинской визуализации новообразований (доброкачественные, злокачественные опухоли) [1]. Для флуоресцентной диагностики (ФД) новообразований применяются 2 подхода. В первом случае ФД проводится с использованием вводимых в организм специальных экзогенных флуоресцентных маркеров. Второй подход основан на флуоресценции эндогенных (присущих каждому живому организму) порфиринов, накапливающихся в опухолевых и других быстро пролиферирующихся биотканях.

Малотоксичные фотосенсибилизаторы (ФС), базирующиеся на основе комплексов порфиринов с рядом лантанидных элементов (Yb, Ho, Er и Nd), и обладающие характерной люминесценцией в ближней инфракрасной (БИК) области спектра, могут быть использованы в медицине и биологии, включая диагностику новообразований [2–6]. Эмиссия этих элементов напрямую связана с эффективностью переноса энергии с антенны, роль которой исполняет порфириновая молекула, на эммитер — ион лантанида. Ион Yb³⁺ имеет наиболее высокий внутренний квантовый выход (до 4%) и в связи с этим он предпочтителен при проведении БИК-люминесцентной диагностики новообразований в биологических и медицинских манипуляциях.

Люминесценция лантанидов в своей основе достаточно слабая. Тем не менее она усиливается при использовании металлокомплексов порфиринов. Коэффициент экстинкции для иттербиевых комплексов порфиринов (ИКП) примерно на 4 порядка больше, чем при прямом возбуждении самого иона иттербия. Наряду с этим введение иона Yb³⁺ в центр порфиринового макроцикла приводит к резкому снижению фотохимической активности образующегося металлопорфирина. При этом не снижается сродство самих порфиринов к опухолевым клеткам [7]. Возбуждение порфиринового макроцикла под воздействием внешнего светового излучения не передается на кислород, а перехватывается ионом Yb³⁺, что приводит к существенному снижению квантового выхода генерации синглетного кислорода, обеспечивая низкую фототоксичность у ИКП. При возбуждении π-электронной системы органической части молекулы ИКП наблюдается люминесценция, обусловленная переходами 4f электронов иона Yb³⁺: ⁴F_5/2 → ²F_7/2 [8].

Для фотодинамической терапии рака и для ранней ФД в настоящее время используются терапевтические ФС: фотогем, фотофрин-2 (фотосенсибилизаторы 1-го поколения), фоскан, фотодитазин (препараты 2-го поколения) и др. Однако собственная флуоресценция тканей (от эндогенных порфиринов и других хромофоров, присущих биотканям) также дает вклад в этом спектральном диапазоне, что необходимо учитывать при оценке концентрации ФС в тканях [9–11].

В последнее время среди онкологических заболеваний лидируют кожные новообразования. Рак кожи — самое распространенное заболевание как в мире, так и в России, где на данную патологию приходится 12,5% общих онкологических заболеваний. За 10 лет в России число пациентов с впервые диагностированным раком кожи возросло на 33%, при этом у женщин рак кожи встречается в 1,7 раза чаще, чем у мужчин [12]. Препарат аласенс (5-ALA, 5-аминолевулиновая кислота) занимает особое место среди ФС, используемых для диагностики рака кожи и слизистых оболочек. Однако отмечены недостатки в работе с 5-ALA и ее производными, проявляющиеся в ошибочных ложноположительных диагнозах. В частности, сообщалось, что в случае облучения нормальной мукозы тангенциально направленным к поверхности биоткани лазерным лучом возникала заметная красная флуоресценция благодаря возбуждению множества нормальных клеток, содержащих эндогенный протопорфирин IX [13]. Это приводило к появлению достаточно сильной флуоресценции, сравнимой с флуоресценцией опухолевой ткани, возбуждаемой перпендикулярным к поверхности биоткани лазерным лучом, что и обусловливало ошибки в диагностике.

Таким образом, очевидно, что перспектива использования терапевтических ФС для эффективной ранней диагностики рака достаточно сомнительна, а использование одного лишь узкого диапазона (600–750 нм) в процессе ранней диагностики новообразований, на наш взгляд, не является оптимальным.

Наиболее перспективным для биомедицины, по мнению многих исследователей, диагностических направлений, является БИК-диапазон спектра, что вызвано большей глубиной проникновения фотонов через биоткань и минимальной аутофлуоресценцией в этой области. Для БИК-флуоресценции в настоящее время применяются различные флуорохромы, например, цианиновые красители [14]. Некоторые из них (в частности, индоцианин зеленый) имеют отрицательные характеристики: они не туморотропны, быстро выводятся из организма [15] и обладают небольшим стоксовым сдвигом.

Ранее установлено, что одним из наиболее предпочтительных веществ для ИК-люминесцентной диагностики ряда новообразований может стать дикалиевая соль Yb-комплекса 2,4-ди(α-метоксиэтил)дейтеропорфирина IX (Yb-ДМДП IX), которую получают на основе гемина крови крупного рогатого скота. Это соединение не проявляет значительной токсичности при работе с биологическими объектами [16].

Материал и методы

Для люминесцентной диагностики новообразований кожи и слизистых оболочек разработана фармацевтическая композиция (ФК) флюроскан (аттестат аккредитации №РОСС RU.0001.510608). ФК состоит из люминесцирующего в БИК-области спектра Yb-ДМДП IX и различных гелей (кремофор, тизоль, калгель) с использованием обеспечивающих хорошую проницаемость пенетраторов: диметилсульфоксида, глюкозамина и глицерина. Неповрежденную кожу и поверхность новообразований у пациентов обрабатывали ФК и выдерживали 40 мин. Излишки ФК удаляли с помощью этанола. Далее измеряли интенсивность сигналов люминесценции в области полосы Cope ≈405 нм, а БИК — люминесценцию регистрировали в области 900–1100 нм.

Наличие неизмененного нефототоксичного металлокомплекса (ИКП) в составе геля флюроскан подтверждено данными спектрофотометрического анализа. Проведено измерение отношения оптической плотности раствора ФК в ДМСО при длине волны 568 нм к оптической плотности того же раствора при длине волны 532 нм. Эти результаты должны находиться в диапазоне от 1,13 до 1,20. Подобные характеристики ранее использовали при подтверждении подлинности препаратов, таких как витамин B₁₂ и фотогем. Спектры поглощения синтезированных комплексов снимали на спектрофлуориметре LS-5B фирмы Perkin Elmer. Спектрально-кинетические характеристики получали с помощью разработанного в ИРЭ им. В.А. Котельникова РАН измерительного стробоскопического стенда с возбуждением в видимом диапазоне спектра [17]. Источником излучения служил импульсный лазер LS-2132 фирмы Lotis-Tii на кристалле алюмоиттриевого граната с ионами неодима с длиной волны излучения 532 нм. Параметры лазерного излучения: частота следования импульсов 10 Гц, энергия в одиночном импульсе 100 мДж, длительность импульса (по уровню 0,5) 10 нс. В регистрационном канале использовали монохроматор МДР-23 с камерой ВИДЕОСКАН-285-USB на ПЗС-матрице SONY ICX285AL (для получения спектров эмиссии) или с ФЭУ-83 (для снятия кинетических кривых). Времена жизни люминесценции для всех образцов получены при длине волны эмиссии 976 нм.

Исследования селективности накопления Yb-ДМДП в тканях проводили на макетном лазерно-волоконном флуориметре (ЛВФ), разработанном в ФИРЭ им. В.А. Котельникова РАН. Препарат флюроскан применяли у 35 дерматологических больных. Большинство пациентов имели множественные и сочетанные поражения кожи (базалиомы без изъязвления — 20, базалиомы с изъязвлением — 14, себорейные кератомы — 29). Больных с актиническим кератозом было 7.

Результаты

Для подтверждения подлинности ФК использованы спектральные характеристики Yb-комплекса порфирина. Применение спектрофотометрического метода обеспечивается наличием в видимой области спектра 2 максимумов поглощения при 532 и 568 нм с достаточно высокими значениями молярных показателей поглощения (рис. 1).

Рис. 1. Спектр поглощения Yb-ДМДП IX (концентрации комплекса 10^–4 М, 20% раствор ДМСО).

В спектре поглощения Yb-ДМДП IX доминирует полоса Cope (в области 400 нм) и 2 Q-полосы при 530 и 570 нм значительно меньшей интенсивности. При этом наблюдается высокий коэффициент экстинкции (ε) Yb-ДМДП IX, в водной среде имеющий значение ~1,2×10⁵ М^–1 см^–1.

Для иона Yb³⁺ полоса люминесценции находится в БИК-диапазоне при 975–985 нм (рис. 2), сама порфириновая матрица эмитирует флуоресценцию в области 630 нм. При этом большая часть энергии возбуждения идет на флуоресценцию. Общий квантовый выход люминесценции Ф_tot ионов Yb³⁺ в исследуемых комплексах рассчитывали, используя в качестве эталона раствор Zn-тетрафенилпорфирина в этаноле (его квантовый выход 0,03) [18]. Расчетный квантовый выход люминесценции иона Yb³⁺ составил ~0,9%. Во всем диапазоне энергий, вплоть до энергий, соответствующих УФ-области спектра, ион Yb³⁺ имеет только 2 энергетических уровня: основной (⁴F_7/2) и возбужденный (²F_5/2). Для иона Yb³⁺ характерна сильная связь его электронной подсистемы с фононами решетки [19], что приводит к уширению линий электронных переходов. Электронные уровни ⁴F_5/2 → ²F_7/2 расщепляются на 3 и 4 вырожденных уровня соответственно. На основании этого 4f-люминесценция иона Yb³⁺ в ИКП наблюдается в значительно широком спектральном БИК-диапазоне: 920–1060 нм при возбуждении в области 300–630 нм.

Рис. 2. Спектр люминесценции Yb-ДМДП IX (концентрация комплекса 10^–4 М, раствор 20% ДМСО).

Некоторые результаты наших исследований среди пациентов представлены на рис. 3 и 4. У большинства пациентов отмечены множественные и сочетанные поражения кожи. Для исследования накопления иона иттербия в патологически измененных и здоровых тканях использовали макетный ЛВФ. Временная зависимость интегральной интенсивности люминесценции при базальноклеточном раке кожи (поверхностная форма) от различных ее участков представлена на рис. 3.

Рис. 3. Пациент Д., 55 лет. Базальноклеточный рак кожи (поверхностная форма).

1—3 — участки опухолевого роста без изъявления; 4 — изьявления по краю очага; 5 — кожа, не обработанная гелем (внешне здоровая); 6 — неизмененная кожа (соседняя с поз. 4, внешне здоровая), обработанная гелем.

Рис. 4. Пациент П., 56 лет. Базальноклеточный рак кожи (язвенная форма).

1 — кожа без опухолевого роста, обработанная гелем; 2 — участок опухолевого роста, без изьявления; 3, 4 — язвенная поверхность очага; 5 — кожа, не обработанная гелем; 6 — неизмененная кожа, обработанная гелем.

Проводили исследования интегральной интенсивности люминесценции (в области 900–1100 нм) и соответственно накопления ИКП в различных новообразованиях и в областях здоровой кожи. С помощью графика можно оценить величину люминесцентного диагностического контрастного индекса (ЛДКИ):

ЛДКИ ~ I_поз.4 / I_поз.6 = 1,3 мВ/0,2 мВ = 6,5.

Наблюдается повышенная интенсивность люминесценции (накопление ФК) в язвенных поверхностях очага.

ЛДКИ ~ I_поз.4 / I_поз.6 = 2,1 мВ/0,3 мВ = 7,0.

Исследованиями определен уровень люминесценции здоровых участков кожи — 0,1–0,2 усл.ед. Наблюдали повышение уровня люминесценции над очагами рака кожи до 0,8–1,6 усл.ед. При этом максимальные уровни не зарегистрированы на поверхности опухолевых очагов с эрозиями — 1,7–3,8 усл.ед. У отдельных пациентов отмечено повышение уровня люминесценции на визуально неизмененных участках кожи, на которых впоследствии, через 3–4 дня, появлялись признаки воспалительного процесса (гиперемия, отек, болезненность).

Обсуждение

Для целей диагностики на основе данной субстанции разработана ФК флюроскан в виде геля, которая содержит минимальное количество воды, что обеспечивает высокие значения квантового выхода и времени жизни люминесценции, так как колебания ОН-групп в воде приводят к тушению люминесценции иона иттербия. На основе спектрофотометрического метода определены спектр поглощения действующего вещества Yb-ДМДП IX и спектральные характеристики его люминесценции. Это подтверждает то, что действующее вещество соответствует основным необходимым для клинического применения качествам данной ФК. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности разработанного метода для диагностики новообразований кожи и слизистых оболочек в ближнем инфракрасном диапазоне.

Применение ИК-люминесцентного исследования кожных заболеваний позволяет выявить объективные различия между здоровыми и измененными тканями. Проведенное сравнение интенсивности люминесценции в различных типах тканей может послужить основой для нового способа визуализации различных состояний в дерматологии. Вследствие того что Yb-ДМДП IX практически не имеет световой токсичности, при нанесении гелей в составе ФК на кожу побочных реакций не наблюдается.

Уровни люминесценции опухолевых очагов и здоровой кожи существенно различаются, что является подтверждением эффективного проникновения препарата в структуры кожи и избирательного накопления в патологически измененных тканях. Количество действующего вещества в структурах кожи определяется выраженностью воспалительного процесса, пролиферативной активностью клеток и их малигнизацией. Данный метод может использоваться для дифференциальной диагностики различных видов рака кожи и выявления скрытых очагов опухолевого роста, а также для контроля за эффективностью проводимой терапии.

Заключение

Апробирована разрешенная для клинического применения ФК, создано необходимое оборудование для проведения люминесцентной диагностики и контроля за лечением новообразований кожи.

Полученные в ходе исследования среди пациентов данные являются предварительными. Расширение клинических исследований по этой методике при различных патологических процессах в коже и слизистых оболочках позволит набрать достаточный статистический материал и выявить достоверные различия данных процессов. В результате скрининга ряда дерматологических заболеваний будет выяснена область возможного применения предложенной методики.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ (проект №0706-2020-0019) и согласно государственному заданию по теме №0030-2019-0009.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Алексеев Ю.В., Румянцева В.Д.

Сбор и обработка материала: Рябов М.В.

Статистическая обработка данных: Дуванский В.А.

Написание текста: Шилов И.П.

Редактирование: Румянцева В.Д.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The work was carried out with the financial support of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation (project No. 0706-2020-0019), as well as the State Task on the topic No. 0030-2019-0009.

Authors’ contributions:

The concept and design of the study: Alekseev Yu.V., Rumyantseva V.D.

Collecting and interpreting the data: Riabov M.V.

Statistical analysis: Duvanskiy V.A.

Drafting the manuscript: Shilov I.P.

Revising the manuscript: Rumyantseva V.D.