Введение

Дерматофиты относятся к патогенным плесневым грибам, обладают кератинолитической активностью, обеспечивающей им проникновение и развитие в кератин-содержащих тканях — роговом слое эпидермиса кожи, волосах и волосяных фолликулах, ногтевых пластинах, что приводит к спектру топически связанных заболеваний, кодируемых в МКБ-10 шифром В35 как микозы кожи и ее придатков [1]. В настоящее время семейство Arthrodermataceae, к которому относятся дерматофиты, разделяют на 7 родов: Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton, Nannizzia, Arthroderma, Lophophyton, Paraphyton, включающих более 50 видов [2, 3]. Основное клиническое значение имеют виды, относящиеся к родам Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton, которые вызывают микозы кожи и ее придатков, классифицируемые как трихофитии, микроспории и эпидермофитии [4]. В глобальном масштабе, согласно данным ВОЗ, с патологиями, вызванными дерматофитами, в течение жизни сталкивается до 25% населения земного шара (в отдельных районах этот показатель достигает 40% [5–9]), что делает дерматофиты самыми распространенными возбудителями поверхностных микозов. Микозы, вызванные дерматофитами, сопровождаются выраженной воспалительной реакцией с хроническим, часто рецидивирующим течением и практически не способны к самоизлечению. При отсутствии своевременного и адекватного лечения инфекция часто приводит к необратимым патоморфологическим изменениям в коже, волосистой части головы и ногтях, в связи с чем дерматофитии рассматриваются как серьезная медико-социальная проблема. В Российской Федерации случаи трихофитии и микроспории относятся к регистрируемым инфекциям, подлежащим статистическому учету [10].

Симптомы поверхностных микозов кожи часто схожи с симптомами дерматитов и дерматозов иной этиологии, поэтому клиническая диагностика может приводить к постановке ошибочного диагноза, неверной тактике лечения и к отдаленным неблагоприятным последствиям. При этом у разных видов дерматофитов разная чувствительность к противогрибковым препаратам. Виды Trichophyton, как правило, более чувствительны к тербинафину, в то время как виды Microsporum более чувствительны к гризеофульвину [11, 12].

В связи с этим для постановки этиологического диагноза решающее значение имеют лабораторные методы диагностики, направленные на выявление и идентификацию возбудителей поверхностных микозов, в первую очередь дерматофитов.

Рутинными методами, применяемыми в ежедневной практике выявления дерматофитов, остаются микроскопия и культивирование на искусственных питательных средах. К сожалению, из-за низкой чувствительности и специфичности микробиологические методы неизбежно сопровождаются большой долей ложноотрицательных результатов, что затрудняет подтверждение или постановку диагноза и влечет за собой некорректные лечебно-профилактические мероприятия, высокий риск рецидивов и дальнейшее распространение инфекции [13].

Прямое микроскопическое исследование с использованием 10–30% раствора KOH, быстрое и простое в исполнении, является основным инструментом лабораторной диагностики поверхностных микозов кожи и придатков. Предварительная обработка щелочью обеспечивает лучшую визуализацию морфологических структур грибов. Однако для надежной идентификации необходимо, чтобы в исследуемом образце находилось достаточное количество возбудителя. В связи с этим у пациентов на ранних стадиях инфекции или после проведенного курса терапии наблюдается высокая доля ложноотрицательных результатов. Самым существенным недостатком КОН-микроскопии является то, что она не позволяет провести видовую идентификацию грибов, что существенно снижает ее возможности в этиологической диагностике кожных микозов [14].

Культуральное микологическое исследование с выделением чистой культуры грибов из биологического материала считается золотым стандартом в медицинской микологии, так как позволяет точно установить видовую принадлежность гриба [15]. Обычно применяют питательную среду Сабуро с добавлением антибиотиков, подавляющих рост сапрофитной микрофлоры. В случаях, когда необходимо подтвердить диагноз дерматофитии (трихофитии или микроспории), микологический посев является безальтернативным методом диагностики. К сожалению, микологический посев имеет ряд существенных недостатков, главные из которых медленный рост культуры гриба и длительные сроки (до 4–6 нед) культивирования. При этом время, выделяемое лабораторией на культуральную диагностику, зачастую ограничено в среднем двумя неделями. Вторым существенным ограничением культурального метода являются требовательность к получению биоматериала, зависимость ростовых свойств культуры от присутствия в материале другой флоры, как бактериальной, так и грибковой, прием препаратов, подавляющих рост и размножение дерматофитов, что в итоге сказывается на результатах посева и часто приводит к ложноотрицательным результатам [3].

Таким образом, для повышения эффективности лабораторной диагностики поверхностных микозов, и в первую очередь дерматофитий, актуальна разработка новых, высокочувствительных и высокоспецифичных методов, лишенных перечисленных выше недостатков. В этом отношении накоплено большое количество научно-экспериментальных данных в пользу молекулярно-биологических методов, прежде всего на основе метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) [16, 17]. В Российской Федерации в свое время на основе ПЦР с электрофоретической детекцией был разработан набор реагентов для выявления ДНК T. rubrum, T. mentagrophytes, который нашел практическое применение в диагностике онихомикоза [18]. Однако наибольший интерес и перспективы представляют методы, основанные на ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ), позволяющие выявлять и идентифицировать широкий спектр клинически значимых видов дерматофитов с высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью [19–21]. В зарубежных странах применение молекулярных методов на основе ПЦР-РВ активно внедряется в рутинную лабораторную практику. Такие диагностические наборы, как DermaGenius 3.0, EurobioPlex Dermatophytes, позволяют идентифицировать широкий спектр видов дерматофитов, относящихся к родам Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton, Nannizzia [21–24].

В Российской Федерации разработан и зарегистрирован первый набор реагентов на основе ПЦР-РВ «АмплиПрайм Дерматофиты (Trichophyton, Epidermophyton, Microsporum)» (ООО «НекстБио»), позволяющий определять ДНК самых распространенных видов дерматофитов — T. rubrum, T. mentagrophytes complex, T. tonsurans, M. canis, E. floccosum в биологическом материале, полученном с кожи и ее придатков. В представленной работе мы оценили эффективность применения данного набора относительно классических микробиологических методов, активно применяемых в лабораторной практике для диагностики поверхностных микозов.

Материал и методы

Исследование проведено на базе МНПЦДК в 2022–2023 гг. В исследовании приняли участие пациенты, обратившиеся за дерматологической помощью. В зависимости от цели визита, характера клинических проявлений и локализации, а также предполагаемого диагноза пациентам были назначены рутинные лабораторные исследования одновременно методами КОН-микроскопии и микологического посева. Дополнительно на основании подписанного письменного информированного добровольного согласия пациента на участие в исследовании производили забор материала для ПЦР-исследования. Манипуляции при получении материала для ПЦР были аналогичными для микроскопического и культурального исследований.

Материалом для исследования служили 154 образца кожи (кожные фрагменты, чешуйки, дебрис), 62 образца волос (фрагменты волос, волосяных фолликулов, соскобный материал кожи головы) и 42 образца ногтей (подногтевой дебрис, фрагменты ногтевых пластин), в общей сложности 258 образцов. Во всех случаях материал забирали с использованием стерильных инструментов для одноразового или многоразового использования.

Фрагменты волос и волосяных фолликулов брали из середины очага поражения, выбирая поврежденные или обесцвеченные, с помощью пинцета, так как дерматомицеты обычно поражают прикорневую часть волоса и волосяной фолликул. В некоторых случаях из этих же очагов дополнительно соскабливали кожные чешуйки, где также, возможно, находились грибы. При получении материала с гладкой кожи ее поверхность сначала обрабатывали 70% этиловым спиртом для удаления возможных остатков крема и мазей. Материал — мелкие кожные чешуйки и покрышки везикул собирали пинцетом или соскабливали скальпелем на границе здоровой и пораженной кожи, так как при поражении кожи и волосистой части головы грибы выявляются главным образом в периферической части очагов поражения, реже в центре. При подозрении на онихомикоз ноготь сначала очищали тампоном, смоченным 70% спиртом. При дистальном поражении ногтевой пластины материал (подногтевой дебрис) получали выскабливанием кюреткой или лезвием из-под ногтевого ложа. Для ПЦР-исследования и в ряде случаев для КОН-микроскопии дополнительно к подногтевому дебрису в ту же пробирку забиралип срез ногтя. При проксимальном поражении ногтя материал получали соскабливанием с поверхности пораженной части ногтевой пластины.

Образцы материала, предназначенные для микроскопического исследования, собирали на предметное стекло, сверху добавляли каплю 20% раствора КОН, накрывали покровным стеклом и в закрытых контейнерах отправляли в лабораторию для последующего исследования. Образцы биоматериала для культурального исследования и ПЦР собирали в отдельные стерильные одноразовые полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл и в сухом виде транспортировали лабораторию.

КОН-микроскопия

Образцы биологического материла, помещенные в раствор КОН под покровное стекло, исследовали с использованием светового микроскопа. После инкубации с раствором КОН плотные кератин-содержащие элементы растворялись, обеспечивая хорошую контрастность морфологическим структурам грибов — дрожжевым клеткам, псевдомицелию, мицелию, конидиям и другим элементам. Визуализацию проводили при увеличении в 40 раз, при необходимости для лучшего рассмотрения отдельных элементов проводили микроскопию окрашенных препаратов при увеличении в 90–100 раз.

Микологический посев

Исследуемый биологический материал из пластиковых пробирок аккуратно переносили шпателем в пробирки на скошенный агар в 2–3 точки на расстоянии 1–2 см. Материалом одной пробы засевали не менее 2–3 пробирок (волосы) и 4–5 пробирок (кожные и ногтевые чешуйки). Для изоляции дерматомицетов использовали стандартную агаризованную среду Сабуро с декстрозой, хлорамфениколом и гентамицином. Посевы инкубировали при 28 °C. Появление роста дерматомицетов отмечали с 4-го по 12-й день инкубации в точках посева по краям внесенного материала. При отсутствии роста в течение 30 дней результаты культивирования считали отрицательными. Видовую идентификацию полученной чистой культуры грибов проводили на масс-спектрометре Vitek MS с использованием технологии MALDI-TOF.

ПЦР исследование

ПЦР-исследование проводили с использованием серийно выпускаемого набора реагентов «АмплиПрайм Дерматофиты (Trichophyton, Epidermophyton, Microsporum)» (РУ №РЗН 2023/19905 от 29.03.23 (ООО «НекстБио», Москва, Россия) на основе технологии ПЦР-РВ в соответствии с инструкцией производителя. В состав набора входит комплект реагентов для экстракции ДНК и комплекты реагентов для ПЦР-амплификации специфических фрагментов генома дерматофитов. Реагенты для экстракции ДНК включали специальный раствор (буфер М), предназначенный для частичного растворения кератин-содержащего материала (чешуек кожи, фрагментов волос и ногтевого материала), и растворы для экстракции и очистки ДНК дерматофитов в присутствии частиц магнетизированного сорбента. Экстракцию проводили как в ручном режиме с использованием магнитного штатива (ООО «ИнтерлабСервис», Россия), так и на автоматической станции для экстракции нуклеиновых кислот Nexor 96 Fully Automated Nucleic Acid Extractor («Lepu Medical Technology», Китай). Комплект для проведения ПЦР в реальном времени включал в состав ПЦР-смесь Дерматофиты и ПЦР-смесь T. tonsurans. Мультиплексный характер амплификации с детекцией сигнала флуоресценции в реальном времени позволял выявлять и идентифицировать ДНК 4 основных видов дерматофитов: T. rubrum, T. mentagrophytes complex, M. canis, E. floccosum и T. tonsurans. Амплификацию проводили по универсальной программе АмплиПрайм на приборах планшетного типа (С1000 Touch в комплекте с модулем CFX96, «Bio-Rad Laboratories», США). Интерпретировали результаты с помощью программного обеспечения FRT-manager (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия).

Секвенирование и анализ данных по Сенгеру

При получении дискордатных результатов (положительные результаты ПЦР в отсутствие роста грибов при посеве) для подтверждения наличия ДНК определенного вида дерматофита проводили выборочное секвенирование по Сэнгеру таксон-определяющей области генов дерматофитов ITS1-ITS2 размером 470 пар оснований. Реакцию секвенирования выполняли с применением BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit («Applide Biosystems») согласно инструкции производителя с разделением фрагментов на автоматическом генетическом анализаторе 3730×l DNA Analyzer («Applide Biosystems»). Для оценки таксономической конгруэнтности между нуклеотидной последовательностью клинических образцов и референсной последовательностью ДНК дерматофитов использовали базу данных нуклеотидов GenBank Национального центра биотехнологической информации (NCBI).

Статистическая обработка

Для статистического анализа сравнения результатов и дальнейшего анализа данных использовали программное обеспечение Excel 2016. Данные выражены в виде абсолютных и относительных чисел для качественных переменных. Для попарного сравнения связанных (зависимых) групп по диагностическому признаку (частоты выявления дерматофитов) использовался критерий χ² МакНемара с оценкой p value в интервале от менее 0,1 (низкий уровень достоверности различий) до более 0,001 (высокий уровень достоверности различий).

Результаты

Особенностью обследованной выборки пациентов было наличие широкого спектра дерматологических проблем, которые служили причиной обращений к врачу. В то же время пациентов с диагнозами, соответствующими поверхностному микозу кожи той или иной локализации (коды МКБ B35.0, B35.1, B35.4, B35.6, B36.8) было всего 70 (27,1%), еще 20 (7,8%) пациентам был поставлен предварительный диагноз «дистрофия ногтя» (L60.3), остальные 168 (65,1%) пациентов имели предварительный диагноз дерматитов и дерматозов иной этиологии (L30.3, L20.8, L-40.0, L08.0, L30.8, B36.0, L01.0, L70.0, L23.8, L30.0, L30.1, L24.8, L11.0, L42.0, L27.8, L71.0, L30.4, L92, L27.2, L60.3, L60.8).

По итогам проведенного исследования одновременно методами КОН-микроскопии, микологического посева и ПЦР-РВ с использованием набора «АмплиПрайм Дерматофиты (Trichophyton, Epidermophyton, Microsporum)» в общей сложности протестировано 258 (100%) образцов 3 типов биоматериала, полученных от соответствующего числа пациентов (табл. 1).

Таблица 1. Результаты выявления дерматофитов разными методами диагностики

Из указанного числа исследованных образцов материала с разных локализаций грибы выявлены в 92 (35,7%) образцах хотя бы одним из методов. При этом совпадение положительных результатов исследования всех 3 методов установлено для 20 (7,8%) образцов. Если рассматривать отдельно результативность классических методов — КОН-микроскопии и/или микологического посева, то наличие грибов было бы установлено только в 38 (14,7%) образцах. Методом КОН-микроскопии получено 26 (10,1%) положительных результатов, с помощью микологического посева — 32 (12,4%). При включении в алгоритм обследования метода ПЦР-РВ количество образцов с идентифицированными дерматофитами возросло до 88 (34,1%), при этом положительные результаты только ПЦР-РВ при отрицательных результатах КОН-микроскопии и микологического посева получены в 54 (20,9%) образцах.

В табл. 2 представлены результаты по выявлению разных видов дерматофитов в различных типах биоматериала. Спектр и частота выявления разных видов дерматофитов существенно зависели от типа биоматериала и метода выявления. Самыми распространенными видами дерматофитов в образцах кожи и волос обоими методами диагностики были M. canis, на втором месте — T. tonsurans.

Таблица 2. Сравнение результатов выявления отдельных видов дерматофитов в разных типах биологического материала

В образцах кожи с разной частотой выявлены все определяемые виды дерматофитов: T. rubrum, T. mentagrophytes complex, T. tonsurans, M. canis, E. floccosum. Самый распространенный возбудитель микоза гладкой кожи M. canis методом ПЦР-РВ выявляли в 1,8 раза чаще по сравнению с микологическим посевом и в 2,6 раза чаще по сравнению с КОН-микроскопией. Частота выявления второго по распространенности возбудителя микоза гладкой кожи — T. tonsurans методом ПЦР-РВ превышала таковую, выявленную культуральным методом в 2,7 раза, а микроскопическим — в 8 раз. Выявление T. rubrum стало возможным только с помощью ПЦР-РВ, ни культурально, ни с помощью КОН-микроскопии возбудитель не диагностировали. Большая часть случаев T. mentagrophytes установлена только с помощью ПЦР-РВ, в одном из которых был положительный результат КОН-микроскопии. При этом, как и в случае с T. rubrum, ни одного случая выявления T. mentagrophytes в образцах гладкой кожи культуральным методом не зафиксировано. E. floccosum оказался самым редким из видов дерматофитов и был обнаружен только в образце с гладкой кожи у одного пациента всеми методами диагностики.

В образцах волосистой части головы, как и в образцах гладкой кожи, преобладали M. canis, на втором месте — T. tonsurans, при этом другие виды дерматофитов не были обнаружены. Как и в случае с образцами кожи, оба вида определялись всеми методами диагностики (с оговоркой, что при КОН-микроскопии видовая идентификация была невозможна) с преимуществом в пользу метода ПЦР-РВ. Частота выявления M. canis методом ПЦР-РВ превышала таковую при микологическом посеве и КОН-микроскопии в 1,3 и 3 раза соответственно, а частота выявления T. tonsurans методом ПЦР-РВ оказалась выше по сравнению с культуральным и микроскопическим методами в 6 раз.

В материале ногтей, наоборот, были выявлены только T. rubrum и T. mentagrophytes, при этом T. rubrum выявляли в 4 раза чаще по сравнению с T. mentagrophytes. При сравнении результатов выявления разными методами следует обратить внимание, что все случаи T. mentagrophytes установлены только методом ПЦР-РВ, результаты других методов оказались отрицательными. В случае выявления T. rubrum результативность ПЦР-РВ по сравнению с КОН-микроскопией была выше в 5,3 раза, а при микологическом посеве только в 1 из 16 случаев, выявленных с помощью ПЦР-РВ, наблюдали рост культуры.

Для подтверждения специфичности полученных положительных результатов ПЦР-РВ при отрицательных результатах КОН-микроскопии и микологического посева проведено выборочное секвенирование продуктов амплификации, полученных из указанных образцов, которое установило присутствие в них ДНК выявленных видов дерматофитов. Таким образом, можно утверждать, что все выявленные с помощью ПЦР-РВ случаи при отрицательных результатах других методов являются истинно положительными.

Ни в одном случае не получен положительный результат посева при отрицательном результате ПЦР-РВ. Только у 4 пациентов диагноз микоза установлен на основе результатов микроскопии при отрицательных результатах ПЦР-РВ и посева. В 2 случаях это были образцы кожи и в 2 — материал ногтевых пластин. Исходя из существующих представлений об этиологии поверхностных микозов кожи и придатков, возможно, это микотическая инфекция, вызванная грибами-недерматофитами.

При попарном сравнении результатов между ПЦР-РВ с КОН-микроскопией и микологическим посевом статистический анализ показал высокий уровень достоверности (p<0,001).

Обсуждение

Диагностика и дифференциальная диагностика дерматофитий имеет принципиальное значение, так как клиническая картина может мимикрировать под другие дерматозы, лечение которых принципиально отличается от лечения дерматофитий. Кроме того, такие широко распространенные заболевания, как атопический дерматит и псориаз, часто сопровождаются дерматофитной инфекцией [25].

Проведенное исследование подтвердило более высокую чувствительность метода ПЦР-РВ по сравнению с классическими лабораторными методами диагностики дерматофитий — КОН-микроскопией и микологическим посевом (см. рисунок), что в целом согласуется с результатами многочисленных зарубежных исследований [19, 26, 27].

Частота выявления дерматофитов разными методами в различных образцах биоматериала.

Как видно из рисунка, в нашем исследовании частота выявления дерматофитов методом ПЦР-РВ относительно КОН-микроскопии и посева для образцов кожи была выше в 3,1 и 2,3 раза соответственно, для образцов волос — в 4 и 1,8 раза соответственно. Самая значительная разница между разными лабораторными методами получена для образцов ногтевого материала. Частота выявления дерматофитов методом ПЦР-РВ превышала результаты КОН-микроскопии в 4 раза, посева — в 24 раза, что указывает на самую низкую эффективность микологического посева при диагностике онихомикоза. Полученные результаты находят подтверждение и в работах других исследователей, показавших, что 30–35% онихомикоза, вызванного дерматофитами, остается культурально-негативным [16, 28], а на фоне применения метода ПЦР доля культурально-негативных случаев достигает 74% [29].

Несмотря на то, что, по данным зарубежной литературы, T. tonsurans и M. canis могут поражать ногтевые пластины и вызывать онихомикоз [30, 31], в обследованной выборке пациентов эти поражения встречались только в образцах с гладкой кожи и волосистой части головы. Наиболее редким дерматофитом оказался E. floccosum, выявленный только у одного пациента в образце с гладкой кожи всеми методами, что отражает особенности эпидемического процесса этого вида дерматофита в нашей стране. Для сравнения, частота дерматофитий, вызванных E. Floccosum, в Казахстане значительно выше — более 10% среди других установленных видов дерматофитов [32].

Набольшую частоту M. canis наблюдали в образцах кожи, при этом методом ПЦР-РВ возбудитель обнаруживали в 1,8 раз чаще, чем при посеве. В образцах волос M. canis также выявляли чаще (в 1,3 раза) при ПЦР по сравнению с посевом. Второй наиболее часто обнаруживаемый дерматофит — T. tonsurans методом ПЦР-РВ в образцах кожи выявляли в 2,7 раза чаще по сравнению с микологическим посевом, в образах волос — в 6 раз чаще.

Наибольшие проблемы выявления культуральным методом наблюдали у T. rubrum — только в 1 из 20 случаев, выявленных методом ПЦР-РВ, отмечен рост культуры гриба. T. mentagrophytes обнаружен только в 7 образцах, причем исключительно методом ПЦР-РВ, и ни в одном из них культуральное исследование не выявило возбудитель.

На эффективность классических методов диагностики значительное влияние оказывают факторы преаналитического этапа и подготовки пациентов к исследованию. Дерматофиты медленно растут на искусственных питательных средах и крайне уязвимы к различным факторам, снижающим их жизнеспособность. На результаты микологического посева больше всего оказывает предшествовавшая исследованию антимикотическая терапии, которая может приводить к двукратному снижению результативности культурального исследования [33]. В связи с этим образцы для микологического посева необходимо получать до начала приема системных антимикотиков, а в случае терапии топическими или системными препаратами последующее микологическое культуральное исследование необходимо проводить не ранее чем через 15 дней после окончания приема местных или через 3 мес после окончания приема системных препаратов [34]. К сожалению, именно при поражениях ногтей не редки случаи, когда пациенты обращаются к врачу сразу после или во время самостоятельного лечения. Еще один фактор, негативно влияющий на результаты микологического посева, — частое присутствие на поверхности кожи волосистой части головы и ногтевых пластинах плесневых грибов-контаминантов (Penicillium, Mucor, Alternaria и др.), которые в условиях длительного (до 4–6 нед) культивирования значительно быстрее размножаются и подавляют рост дерматофитов [10]. Это, в свою очередь, искажает результат исследования и затрудняет установление истинного этиологического агента [35]. Ложноотрицательные результаты микологического посева могут быть получены при сопутствующих бактериальных инфекциях. Например, компоненты серы, продуцируемые Pseudomonas aeruginosa, подавляют рост дерматофитов при диагностике онихомикоза [36]. Метод ПЦР в значительно меньшей степени подвержен такому ингибирующему влиянию со стороны различных биохимических и фармакологических агентов [37].

Различные виды биоматериала характеризуются разной доступностью возбудителя к его лабораторному обнаружению. Кроме того, разные методы имеют физически разный предел обнаружения возбудителя, что в совокупности сказывается на диагностической чувствительности теста. Известно, что поражение волос при микроспории происходит по типу ectothrix и артроконидии гриба расположены снаружи, на поверхности ствола волоса [4, 25]. В связи с этим основная масса грибов доступна для визуальной идентификации при микроскопии, легко контактирует с питательной средой при посеве. В случае трихофитии волосистой части головы, вызванной T. tonsurans, поражение волос происходит по типу endothrix, артроконидии грибов расположены внутри волосяного стержня и большая часть из них остается недоступной для контакта с питательной средой. При проведении микроскопического исследования добавление КОН облегчает растворение кератина волос, делая более доступным визуализацию грибов с учетом их концентрации. Это может быть одной (но не единственной) из причин столь низкой эффективности культурального выявления T. tonsurans в материале с волосистой части головы [36].

Похожая ситуация может наблюдаться при лабораторной диагностике при подозрении на онихомикоз. При поражении ногтевого аппарата благодаря кератинолитической активности дерматофиты проникают в толщу ногтевой пластины, где в итоге сосредоточивается их основная масса, причем наиболее жизнеспособная. Однако именно эта часть популяции грибов, как и в случае инфекции волос по типу endothrix, остается по большей части недоступной для попадания и размножения в культуральной среде [38]. Данный аргумент хорошо согласуется с результатами гистологических исследований с использование PAS-микроскопии, которая проводится с препаратами срезов ногтевой пластины, демонстрируя внутритканевое расположение клеток грибов [17]. К этому необходимо добавить и то, что чувствительность PAS-микроскопии значительно превышает чувствительность КОН-микроскопии, однако из-за определенных технических требований PAS-микроскопия не нашла широкого применения в рутинной лабораторной практике [39–41].

При оценке эффективности микологического посева в нашем исследовании нельзя не упомянуть разницу в ростовых свойствах разных видов дерматофитов. Например, скорость роста M. canis выше по сравнению с грибами рода Trichophyton, поэтому за время, отведенное для культурального исследования (в среднем 2–3 нед), шансы получить положительный результат посева при микроспории выше, чем при трихофитии.

На фоне перечисленных выше факторов, затрудняющих выявление дерматофитов методами КОН-микроскопии и микологического посева, метод ПЦР-РВ во многом более толерантен и к низкой концентрации возбудителя, и к локализации грибов, и к наличию компонентов, подавляющих рост грибов [8, 13, 15]. Для повышения эффективности работы с кератин-содержащими биологическим материалом в наборе «АмплиПрайм Дерматофиты» предусмотрена предварительная обработка образцов буфером М, обеспечивающая частичное разрушение кератина и лучшую очистку ДНК грибов. Показано, что предварительная обработка прежде всего материала ногтей и волос буфером-М увеличивала аналитическую чувствительность в 10 раз. Анализ продолжительности различных этапов ПЦР-исследования показал, что предобработка биологического материала буфером М, дальнейшая экстракция ДНК, постановка ПЦР и сама реакция амплификации заняли в общей сложности 2,5–3 ч, что позволяет получать результат в течении рабочей смены лаборатории. При большом количестве образцов процедуры экстракции ДНК и подготовка амплификационных смесей (PCR-set-up) могут выполняться с использованием автоматических станций.

Результатом внедрения ПЦР-РВ в широкую лабораторную практику может явиться не только более объективная картина заболеваемости дерматофитиями, но и соотношение разных, в первую очередь наиболее контагиозных, микозов — микроспории и трихофитии. По данным статистического учета, заболеваемость микроспорией во много раз превышает аналогичные показатели трихофитии [1]. Согласно нашим данным, количество случаев микроспории, вызванных M. Canis, также превышает количество случаев трихофитии, вызванной разными видами Trichophyton. Однако если в случае результатов микологического посева это соотношение составляет 3,3:1, то в случае применения ПЦР-РВ это соотношение сокращается до 1,3:1 за счет увеличения числа и доли выявленных случаев T. tonsurans.

Заключение

Мультиплексная система »АмплиПрайм Дерматофиты (Trichophyton, Epidermophyton, Microsporum)» на основе ПЦР-РВ — первый в РФ коммерческий наборо реагентов, направленный на обнаружение ДНК T. rubrum, T. mentagrophytes complex, T. tonsurans, M. canis, E. floccosum. Результаты нашего исследования с применением указанного набора реагентов показали значительное увеличение числа и доли выявленных случаев дерматофитии у пациентов, обратившихся за дерматовенерологической помощью. С учетом высокой чувствительности и специфичности метода, возможности идентификации видов дерматофитов и существенного сокращения сроков получения результатов диагностика поверхностных микозов кожи переходит на качественно новый уровень. Внедрение в алгоритм лабораторного исследования ПЦР-РВ повышает обоснованность диагноза и скорость принятия клинического решения (выбор наиболее эффективной схемы лечения, введение или отмена противоэпидемических мероприятий), объективность оценки эффективности лечения и др.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Гущин А.Е., Потекаев Н.Н.

Сбор и обработка материала — Носырева К.К., Негашева Е.С., Полевщикова С.А.

Статистическая обработка данных — Носырева К.К.

Написание текста — Гущин А.Е., Носырева К.К.

Редактирование — Потекаев Н.Н., Сапожникова Н.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors’ contributions:

The concept and design of the study — Guschin A.E., Potekaev N.N.

Collecting and interpreting the data — Nosyreva K.K., Negasheva E.S., Polevshchikova S.A.

Statistical analysis — Nosyreva K.K.

Drafting the manuscript — Guschin A.E., Nosyreva K.K.

Revising the manuscript — Sapozhnikova N.A., Potekaev N.N.