Розацеа — хроническое воспалительное заболевание кожи неустановленной этиологии. Заболевание характеризуется рецидивирующей гиперемией и отеком кожи, эритемой, папулезно-пустулезными высыпаниями, телеангиэктазиями, пустулами или сочетанием этих симптомов. Затяжное течение болезни, склонность к рецидивам, изменение цвета лица, изъязвление кожи и образование рубцов при розацеа оказывают пагубное влияние на физическое, психическое и социальное здоровье пациентов. Патофизиология розацеа до конца не изучена. Как полагают многие авторы, важную роль в развитии заболевания играют наследственность, иммунная дисрегуляция, сосудистая гиперреактивность, хроническое воспаление, инвазия микроорганизмов, а также некоторые факторы окружающей среды [1–7].
В последние годы все большую роль в патогенезе розацеа отводят генетическим факторам. Согласно данным литературы, идентифицированы такие факторы риска развития розацеа, как наследственность, фототип кожи (по Фицпатрику IV фототип) и специфические генетические варианты ApaI G/T, что убедительно свидетельствует о генетической предрасположенности к возникновению данного патологического состояния. Проведенные исследования идентифицировали некоторые гены, связанные с патогенезом розацеа: ген молекулы межклеточной адгезии ICAM-1 (связанный с барьерной функцией кожи), ген глутатион S-трансфераз θ-1 (GSTT1) и/или глутатион-S-трансферазы μ-1 (GSTM1) и нуклеотид-связывающий домен, богатый лейцином повтор и пириновый домен, содержащий ген рецептора 3 NLRP3 (связанный с иммунными реакциями и воспалением), человеческий лейкоцитарный антиген-DR альфа (HLA-DRA), ген бутирофилиноподобного протеина 2 (BTNL2), гены преобразователей сигналов и активаторов транскрипции (белков STAT), также связанных с функцией иммунной системы [6, 8–10]. Исследования, основанные на изучении семейных, близнецовых и региональных факторов (кельтское и североевропейское происхождение), также свидетельствуют о важном значении генетической предрасположенности к возникновению розацеа. Более того, с 2015 г. результаты генетических исследований, посвященных изучению роли генетических факторов в развитии розацеа, публикуются каждый год. С появлением новых технологий, таких как секвенирование генома, анализ омик, а также других инструментов биоинформатики, количество таких публикаций имеет тенденцию к увеличению. Таким образом, очевидна необходимость проведения дальнейших исследований с целью выявления причинных генов, особое внимание следует уделить изучению их функциональности. Гены свертывающей системы крови и метаболизма фолатов могут дать более полное представление о причинах возникновения и механизмах развития заболевания. Актуальным является также изучение их роли в качестве потенциальных предикторов риска возникновения и степени тяжести розацеа [11–17].
Цель исследования — изучение у пациентов с розацеа полиморфизмов генов системы гемостаза и фолатного цикла.
Материал и методы
Исследование проведено на базе научно-диагностического центра Immunogen test при Институте иммунологии и геномики человека АН РУз. Основную группу составили 27 пациентов с установленным диагнозом розацеа различной степени тяжести. В контрольную группу вошли 20 условно здоровых испытуемых без розацеа.
Генотипирование образцов крови проводили методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Для приготовления банка ДНК у участников исследования осуществляли забор 3–5 мл венозной крови из локтевой вены с использованием вакутейнеров с антикоагулянтом/консервантом — 15% трикалиевым EDTA (Ethylenediamin-tetraacetik Acid). Кровь для дальнейшей обработки могла сохраняться до 24 ч при температуре 4 °C. Для получения геномной ДНК использовали двухэтапный метод лизиса клеток крови: 1-й этап — получение лизатного концентрата лейкоцитарных клеток, 2-й этап — дальнейшая очистка лизатов лейкоцитарной массы методом спиртово-солевой обработки [18] в модернизированной форме. Концентрацию ДНК доводили до 100 нг/мл. Измерение концентрации ДНК проводили на спектрофотометре NanoDrop Lite («Thermo Fisher Scientific», США). Анализ последовательности ДНК осуществляли методом ПЦР в режиме реального времени с использованием технологии Q-PCR HRM и PCR-детекции электрофорезом на микрочипе. Для типирования полиморфных вариантов изучаемых генов-кандидатов (табл. 1) использованы методы HRM-qPCR (Stratagene M*3005P, «Agilent Technologies», Германия; «DT-Prime», Россия) и микрочиповой PCR-детекции (MCE 202 MultiNA, «Zhimadzu», Япония).
Таблица 1. Описание исследуемых генов
| Ген | SNP |
| Плазменное звено гемостаза | |
| Ген F2 (кодирует протромбин, фактор II свертывания крови) | 20210 G>A |
| Ген F5 (кодирует проакцелерин, фактор V свертывания крови, формирует протромбиназный комплекс, который превращает протромбин в тромбин) | 1691 G>A |
| Ген F7 (кодирует проконвертин, фактор VII свертывания крови, взаимодействует с фактором III, активирует факторы IX и X свертывания крови — образование кровяного сгустка) | 10976 G>A |
| Ген F13A1 (кодирует фибриназу, фактор XIII свертывания крови, участвует в образовании нерастворимого фибрина, стабилизирует фибриновый сгусток) | 103 G>T |
| Ген FGB (кодирует фибриноген, фактор I свертывания крови, образует нерастворимый белок фибрин на заключительном этапе свертывания крови) | –455 G>A |
| Тромбоцитарное звено гемостаза | |
| Ген ITGA2-α2 (кодирует интегрин альфа-2, рецептор тромбоцитов к коллагену, обеспечивает взаимодействие тромбоцитов с поврежденной стенкой сосудов) | 807 C>T |
| ITGB3-β3 (кодирует интегрин бета-3, рецептор тромбоцитов к фибриногену, участвует в агрегации и адгезии тромбоцитов к субэндотелиальным структурам | 1565 T>C |
| Фибринолитическое звено гемостаза | |
| PAI-1 (кодирует серпин, антагонист тканевого активатора плазминогена, ограничивает фибринолитическую активность в месте расположения гемостатической пробки) | –675 5G>4G |
| Гены, ассоциированные с нарушениями фолатного цикла | |
| MTHFR (кодирует метилентетрагидрофолатредуктазу, ассоциируется со снижением функциональной активности фермента, повышением уровня гомоцистеина плазмы) | 677 C>T |
| MTHFR (кодирует метилентетрагидрофолатредуктазу, ассоциируется со снижением активности фермента, повышением уровня гомоцистеина в плазме, снижением уровня фолатов) | 1298 A>C |
| MTR (кодирует B12-зависимую метионин-синтазу) | 2756 A>G |
| MTRR (кодирует метионин-синтазаредуктазу) | 66 A>G |
Исследование уровня гомоцистеина проводили с использованием метода ИХЛА (прибор IMMULITE 2000 Xpi с соответствующими реактивами, «SIEMENS», Германия).
Статистическую обработку выполняли с использованием программы JAMOVI version 1.1.9. Качественные данные представляли в виде абсолютных и относительных показателей, количественные — в виде показателей описательной статистики: среднего значения (mean) и стандартного отклонения (standard deviation). Для определения нормальности распределения признаков использовали тест Шапиро—Уилка, для сравнения групп — непараметрический критерий Манна—Уитни. Для оценки различий относительных величин использовали анализ таблиц сопряженности χ2. Выбранный критический уровень значимости составил 5% (0,05).
Результаты и обсуждение
Возраст пациентов основной группы варьировал от 15 до 64 лет (средний — 39,1±13,6 года). Возраст пациентов контрольной группы колебался от 18 до 40 лет (средний — 35,2±9,1 года). В основной группе женщин было 52%, мужчин — 48%, в контрольной — соответственно 45 и 55%. Частота встречаемости хронического холецистита и уровень гомоцистеина в крови испытуемых у пациентов основной группы были достоверно выше (соответственно p<0,05 и p<0,001), чем в контрольной группе. Клиническая характеристика пациентов и условно здоровых добровольцев представлена в табл. 2.
Таблица 2. Клиническая характеристика основной группы и группы контроля
| Параметр | Основная группа | Группа контроля |
| Число обследованных | 27 | 20 |
| Пол | ||
| женский | 14 (52%) | 9 (45%) |
| мужской | 13 (48%) | 11 (55%) |
| Возраст, годы | 39,1±13,6 | 35,2±9,1 |
| Подтип розацеа | ||
| ЭТП | 12 (44,4%) | — |
| ППП | 15 (55,6%) | — |
| Наличие Demodex fol. | 14 (52,0%) | — |
| Наличие на коже | ||
| эритемы | 25 (92,6%) | — |
| телеангиэктазий | 23 (85,2%) | — |
| папул | 13 (48,0%) | — |
| пустул | 13 (48,0%) | — |
| Локализация очагов поражения | ||
| щеки | 19 (70,4%) | — |
| лоб | 9 (33,3%) | — |
| подбородок | 4 (14,8%) | — |
| крылья носа | 9 (33,3%) | — |
| Наличие патологии ЖКТ | ||
| гастродуоденит | 5 (18,5%) | 2 (10%) |
| холецистит | 6 (22,2%) | — |
| жировой гепатоз | 1 (3,7%) | — |
| H. pilory | 1 (3,7%) | — |
| диффузное уплотнение печени | 1 (3,7%) | — |
| хронический панкреатит | 1 (3,7%) | — |
| гастрит | 3 (11,1%) | 2 (10%) |
| Наличие астеноневротического расстройства | 4 (14,8%) | 2 (10%) |
| Сахарный диабет | 2 (7,4%) | 1 (5%) |
| Микоз | 2 (7,4%) | — |
| Уровень гомоцистеина в крови, мкмоль/л | 12,4±6,9 | 7,1±2,03 |
Примечание. ЭТП — эритематозно-телеангиэктатический подтип; ППП — папулопустулезный подтип.
Полиморфизмы генов системы гемостаза
Структурно в системе гемостаза выделяют плазменное звено (факторы свертывания и образование фибрина — гены F2, F5, F7, F13, FGB) и сосудисто-тромбоцитарное звено (факторы адгезии тромбоцитов к сосудистой стенке, сокращения сосудов, агрегации тромбоцитов, формирования тромба — гены ITGA2, ITGB3, PAI-1). При изучении у пациентов с розацеа полиморфизмов 8 генов свертывающей системы крови (F2: 20210 G>A, F5:1691 G>A, F7:10976 G>A, F13A1:103 G>T, FGB: –455 G>A, ITGA2: 807 C>T, ITGB3: 1565 T>C, PAI-1: –675 5G>4G) получены данные, представленные в табл. 3. При исследовании плазменного звена гемостаза у обследованных пациентов преимущественно выявлены благоприятные аллели G/G. Гетерозиготные и гомозиготные неблагоприятные варианты генов встречались у незначительной части больных.
Таблица 3. Частота встречаемости полиморфных аллелей генов системы гемостаза
| Полиморфизм гена | Частота распределения генотипов | p | ||||
| генотип | основная группа | группа контроля | ||||
| n | % | n | % | |||
| F2: 20210 G>A rs1799963 | G/G | 27 | 100 | 20 | 100 | 1,0 |
| G/A | 0 | 0,0 | 0 | 0 | — | |
| A/A | 0 | 0,0 | 0 | 0 | — | |
| F5: 1691 G>A rs6025 | G/G | 26 | 96,3 | 20 | 100 | 0,9 |
| G/A | 1 | 3,7 | 0 | 0 | 0,9 | |
| A/A | 0 | 0,0 | 0 | 0 | — | |
| F7: 10976 G>A rs6046 | G/G | 18 | 66,7 | 7 | 35 | 0,03 |
| G/A | 9 | 33,3 | 12 | 60 | 0,07 | |
| A/A | 0 | 0,0 | 1 | 5 | 0,24 | |
| F13A1: 103 G>T rs5985 | G/G | 21 | 77,8 | 13 | 65 | 0,3 |
| G/T | 5 | 18,5 | 7 | 35 | 0,2 | |
| T/T | 1 | 3,7 | 0 | 0 | 0,24 | |
| FGB: –455 G>A rs1800790 | G/G | 18 | 66,7 | 15 | 75 | 0,6 |
| G/A | 8 | 29,6 | 5 | 25 | 0,7 | |
| A/A | 1 | 3,7 | 0 | 0 | 0,24 | |
| ITGA2: 807 C>T rs1126643 | C/C | 13 | 48,2 | 17 | 85 | 0,25 |
| C/Т | 10 | 37,0 | 2 | 10 | 0,6 | |
| Т/Т | 4 | 14,8 | 1 | 5 | 0,07 | |
| ITGB3: 1565 T>C rs5918 | T/T | 22 | 81,5 | 20 | 100 | 0,04 |
| T/C | 5 | 18,5 | 0 | 0 | 0,04 | |
| C/C | 0 | 0,0 | 0 | 0 | — | |
| PAI-1: –675 5G>4G rs1799889 | 5G/5G | 8 | 29,6 | 13 | 65 | 0,02 |
| 5G/4G | 11 | 40,8 | 6 | 30 | 0,4 | |
| 4G/4G | 8 | 29,6 | 1 | 5 | 0,03 | |
В то же время в сосудисто-тромбоцитарном звене у значительной части пациентов обнаружены неблагоприятные варианты генов как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состоянии. Значительная доля неблагоприятных вариантов встречалась в генах ITGB3: 1565 T>C и PAI-1: –675 5G>4G по сравнению с контрольной группой.
ITGA2-α2: 807 C>T rs1126643 – интегрин, рецептор тромбоцитов к коллагену, обеспечивает взаимодействие тромбоцитов с поврежденной стенкой сосудов. Интегрин, ген альфа-2 (ITGA2: 807 C>T), кодирует GP Ia/IIa (гликопротеин Ia/IIa тромбоцитов); среди основных интегриновых рецепторов также известен как интегрин α2β1, расположен на хромосоме 5q23-31. SNP гена ITAG2 изменяет экспрессию GP Ia/IIa C807T. GP Ia/IIa отвечает за адгезию тромбоцитов к коллагену I типа, следовательно, дефицит GP Ia/IIa (приобретенный или врожденный) приводит к нарушению процесса адгезии тромбоцитов. При сравнении основной и контрольной групп статистически значимых различий не выявлено (прослеживалась тенденция к наличию различий, p=0,07).
ITGB3-β: 31565 rs5918 — интегрин, рецептор тромбоцитов к фибриногену, участвует в агрегации и адгезии тромбоцитов к субэндотелиальным структурам. Интегрин-β3 ITGB3: 1565 T>C (распространенный полиморфизм в ITGB3), известный как человеческий тромбоцитарный антиген 1 (HPA-1b, PlA2 или rs5918), возникает из-за замены одного нуклеотида в положении 1565 в экзоне 2 ITGB3, что приводит к замене лейцина (PlA1) на пролин (PlA2) в остатке 33. SNP ранее был изучен как наследственный фактор риска острого коронарного синдрома, исследовали также его влияние на функцию тромбоцитов. Полиморфизм потенциально может влиять на активность комплекса GPIIb/IIIa и ассоциироваться с тромбозом. GPIIb/IIIa считается рецептором контакта тромбоцитов с тромбоцитами, играющим важную роль в их агрегации, а его SNP связаны с гиперреактивностью тромбоцитов. Как известно, увеличение агрегационных свойств тромбоцитов тесно связано с состоянием сосудистой стенки. Участие тромбоцитов в системе гемостаза при розацеа определяется их ангиотрофической функцией (способностью поддерживать нормальную структуру и функцию микрососудов, их устойчивость к повреждающим воздействиям, а также способностью поддерживать спазм поврежденных сосудов путем секреции вазоактивных веществ, например серотонина, норадреналина и др.). При сравнении основной группы с контрольной в гене ITGB3: 1565 T>C выявлены статистически значимые различия в генотипе T/C (p<0,05).
Ингибитор активатора плазминогена типа 1 (PAI-1: –675 5G>4G), также известный как ингибитор белковой серпинпептидазы, ветвь E, член 1 (SERPINE1), принадлежит к суперсемейству ингибиторов сериновых протеаз. Он играет важную роль в регуляции фибринолитической системы, быстро ингибирует активатор плазминогена тканевого типа (tPA) и активатор плазминогена урокиназного типа (uPA), который не может расщеплять плазминоген с образованием плазмина. Ген, кодирующий PAI-1, имеет несколько полиморфных локусов, среди которых наиболее хорошо изучен инсерционно-делеционный полиморфизм 4G/5G, содержащий либо 4, либо 5 (4G/5G) гуаниновых оснований на 675 PAI-1 промоторе. Различные варианты гена PAI-1 изменяют уровень белка ингибитора активатора плазминогена PAI-1, что приводит к снижению фибринолитической активности плазмы. В ряде исследований изучены ассоциации между PAI-1 4G/5G полиморфизмом и риском развития атопического дерматита, метаболического синдрома и другой патологии. Согласно полученным нами данным, у обследованных пациентов в 70% случаев наблюдались варианты гена PAI-1: –675 5G>4G. Выявлены статистически значимые различия с контрольной группой в гомозиготном варианте 4G/4G (p<0,05), что позволяет сделать предположение о снижении у этих пациентов фибринолитической активности плазмы.
Полиморфизмы генов фолатного цикла
Частота встречаемости полиморфных аллелей генов метаболизма фолатов представлена в табл. 4. Гены ферментов фолатного цикла отвечают за активность ферментов реакций метилирования, которые ответственны за многие ферментативные превращения. Ген MTHFR, кодирующий метилентетрагидрофолатредуктазу, — один из ключевых ферментов фолатного цикла, расположен в позиции 1p36.3. Два наиболее распространенных полиморфизма гена MTHFR — 1298 A>C (rs1801131) и 677 C>T (rs1801133) связаны со снижением активности фермента.
Таблица 4. Частота встречаемости полиморфных аллелей генов метаболизма фолатов
| Полиморфизм гена | Частота распределения генотипов | p | ||||
| генотип | основная группа | группа контроля | ||||
| n | % | n | % | |||
| MTHFR: 1298 A>C rs1801131 | A/A | 16 | 59,3 | 17 | 85 | 0,05 |
| A/C | 8 | 29,6 | 1 | 5 | <0,05 | |
| C/C | 3 | 11,1 | 2 | 10 | >0,05 | |
| MTHFR: 677C>T rs1801133 | C/C | 13 | 48,1 | 16 | 80 | >0,05 |
| C/T | 9 | 33,3 | 1 | 5 | <0,05 | |
| T/T | 5 | 18,6 | 3 | 15 | >0,05 | |
| MTR: 2756 A>G rs1805087 | A/A | 17 | 63,0 | 12 | 60 | >0,05 |
| A/G | 9 | 33,3 | 8 | 40 | >0,05 | |
| G/G | 1 | 3,7 | 0 | 0 | >0,05 | |
| MTRR: 66 A>G rs1801394 | A/A | 9 | 33,3 | 5 | 25 | >0,05 |
| A/G | 11 | 40,7 | 12 | 60 | >0,05 | |
| G/G | 7 | 26,0 | 3 | 15 | >0,05 | |
При изучении распределения аллелей генов 1298 A>C MTHFR (rs1801131) и 677C>T MTHFR (rs1801133) при различных подтипах розацеа была выявлена связь между частотой встречаемости неблагоприятных аллелей этих генов и тяжестью течения заболевания. При этом неблагоприятный аллель C гена 1298 A>C MTHFR (rs1801131) и неблагоприятный аллель T гена 677C>T MTHFR (rs1801133) чаще встречались при папулопустулезном подтипе розацеа.
Однонуклеотидные замены (SNP) rs1801131 (1298A>C) и rs1801133 (677C>T) в гене MTHFR приводят к образованию термолабильной формы метилентетрагидрофолатредуктазы, снижению ее активности и, как следствие, к повышению уровня гомоцистеина в крови и снижению синтеза метионина. Гомоцистеин представляет собой серосодержащую аминокислоту, образующуюся в результате метаболизма метионина. Гомоцистеин конвертируется в метионин с участием в качестве кофакторов витамина B12 и фолиевой кислоты. В метаболическом цикле синтеза гомоцистеина недостаток этих витаминсодержащих кофакторов приводит к повышению уровня гомоцистеина. Гипергомоцистеинемия связана с различной системной патологией, в том числе с сердечно-сосудистыми, цереброваскулярными и психоневрологическими заболеваниями. В ряде исследований выявлены потенциальные механизмы, с помощью которых гомоцистеин может способствовать развитию эндотелиальной дисфункции, включая активацию тромбоцитов. Многие исследования продемонстрировали повышенную частоту выявления гипергомоцистеинемии у больных с различными воспалительными заболеваниями кожи, включая акне, витилиго, псориаз и гнойный гидраденит. Накопление гомоцистеина обусловливает повреждение эндотелия сосудов. Гомоцистеин оказывает одновременно атерогенное и тромбоваскулярное действие, а также дает нейротоксический эффект. В нашем исследовании уровень гомоцистеина в крови пациентов с розацеа оказался достоверно выше (p<0,001), чем в крови условно здоровых добровольцев (см. табл. 2).
При изучении полиморфизмов генов системы гемостаза и генов фолатного цикла мы получили данные, позволяющие предположить наличие участия нарушений тромбоцитарного звена гемостаза и метаболизма фолиевой кислоты в патогенезе розацеа. Более частая встречаемость вариантов генов ITGB3: 1565 и PAI-1: –675 в основной группе свидетельствует о нарушениях у больных розацеа функции свертывающей системы, в частности агрегации тромбоцитов и фибринолитической активности, что может приводить к травматизации мелких сосудов (за счет нарушения ангиотрофической функции тромбоцитов и гиперкоагуляции). В результате при локальном воспалении развиваются нарушения микроциркуляции. Выявленные нами варианты генов метаболизма фолатов ассоциируются с повышенным уровнем гомоцистеина в крови, что также способствует травматизации эндотелия сосудов.
Заключение
Розацеа относится к полиэтиологическим (мультифакторным) заболеваниям с участием в его патогенезе различных патологических механизмов. Основной причиной, обусловливающей возникновение розацеа, является генетическая предрасположенность к развитию заболевания, которая приводит к формированию лимфатической васкулопатии. Реализации наследственности способствуют различные экзогенные и эндогенные триггеры. В результате проведенного исследования выявлены гены, предположительно участвующие в механизмах развития розацеа, а также влияющие на тяжесть течения заболевания. В частности, обнаружены неблагоприятные варианты генов тромбоцитарного звена — ITGB3: 1565 T>C rs5918 и PAI-1: –675 5G>4G rs1799889, а также генов фолатного обмена — MTHFR: 1298 A>C rs1801131 и MTHFR: 677C>T rs1801133. Выявленные локусы обеспечивают специфичность воспалительных механизмов, развивающихся при розацеа, и определяют потенциальные пути терапии. Кроме того, в нашем исследовании у пациентов с розацеа выявлен повышенный уровень гомоцистеина в крови, накопление которого способствует повреждению эндотелия сосудов.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.