Актуальный статус биомедицинских продуктов для генной и клеточной терапии рецессивного дистрофического буллезного эпидермолиза (обзор, часть IV)

На молекулярном уровне патология рецессивного дистрофического буллезного эпидермолиза (РДБЭ) связана с мутациями в гене COL7A1, кодирующем синтез коллагена VII типа (C7) [1]. На уровне геномной ДНК большинство вариантов мутаций в COL7A1 ассоциируется с однонуклеотидными заменами, поэтому в качестве перспективного подхода к лечению пациентов с РБДЭ можно рассматривать один из методов генной терапии — редактирование генов (РГ), содержащих патогенные варианты [2].

Осуществляется этот процесс посредством программируемых нуклеаз, которые вызывают целенаправленные одно- или двуцепочечные разрывы в ДНК, после чего происходит репарация с исправлением мутаций за счет активации эндогенного механизма репарации ДНК [3]. Наиболее распространенными для коррекции генов с РБДЭ являются система TALEN (Transcription activator-like effector nucleases) и более современная — CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Crispr- Associated protein). Начало РГ РДБЭ было положено в 2013 г., когда Osborn и соавт. [4] сообщили об использовании системы TALEN для редактирования дермальных фибробластов (ДФ) пациентов с РДБЭ. ДФ с исправленным геном были репрограммированы с помощью комбинации транскрипционных факторов в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), дифференцированы в кератиноциты, продуцирующие нормальный C7, и затем использованы для создания эпидермальных трансплантатов (ЭТ). Следует отметить, что возможность получать ИПСК стала одним из важных стимулов прогресса стратегии РГ [5, 6]. Так, V. Sebastiano и соавт. [7] создали линии ИПСК, которые после коррекции дефектного гена дифференцировали в кератиноциты с нормальным синтезом C7 и использовали для создания аутологичных ЭТ.

В настоящее время разработаны стратегии РГ с использованием нуклеаз TALEN и CRISPR/Cas9, продемонстрировавших возможность создания ЭТ на основе клеток кожи с исправленным геном и проведены доклинические исследования (ДИ), результаты которых продемонстрировали, что после трансплантации полученных ЭТ животным с РДБЭ значительно улучшалось состояние их кожи [8, 9].

Однако, несмотря на достигнутые успехи, данный метод генной терапии, направленный на необратимое восстановление выработки функционального C7, все еще не выведен на стадию клинических исследований (КИ) [6, 10, 11]. Основная причина — методологические и технологические изъяны используемых систем, включающие недостаточную эффективность коррекции, вероятность повреждения генома (нецелевые эффекты нуклеаз) и отсутствие адекватного способа доставки генного редактора в неповрежденную кожу.

Цель работы — описание метода РГ и результатов ДИ, сравнительный анализ применяемых стратегий, подходы, способные в ближайшем будущем исключить недостатки РГ и вывести этот один из самых перспективных методов лечения РДБЭ в клиническую практику.

Альтернативным подходом к восстановлению C7, не требующим трансдукции полноразмерной кДНК COL7A1, является стратегия редактирования генов, выполняемая с помощью специфических нуклеаз, которые можно прицельно направить на необратимое изменение нуклеотидной последовательности гена в области мутации в ДНК [2]. Инструменты редактирования генов способны напрямую исправлять мутацию в соответствующем гене, восстанавливая экспрессию гена без риска развития инсерционного мутагенеза, который может наблюдаться при генной заместительной терапии [12].

Для редактирования геномов используются такие синтетические нуклеазы, как домены цинковых пальцев (Zinc Finger Nuclease — ZFN), TALEN, домены и системы CRISPR/Cas. Для редактирования RDEB используются преимущественно последние две технологии — TALEN [11, 13, 14] и CRISPR/Cas [15, 16].

Действие синтетических нуклеаз связано с образованием индуцированных нуклеазой разрывов ДНК (НРД) для внесения вставок или делеций в последовательность генов, которые затем восстанавливаются согласно клеточным механизмам репарации ДНК с помощью в основном двух различных механизмов: негомологичного соединения концов ДНК и с помощью репарационного шаблона ДНК-донора, когда НРД восстанавливаются путем гомологично направленной репарации (ГНР), что обеспечивает более точную коррекцию [17, 18].

M. Osborn и соавт. [5], используя TALEN-опосредованную ГНР, впервые получили до 2% генетической коррекции в ДФ РДБЭ-пациентов, которые затем были перепрограммированы в ИПСК и изучены на модели кожи на основе тератомы in vivo. Результаты исследования продемонстрировали нормальную продукцию C7. TALEN-опосредованное РГ было использовано на кератиноцитах и эпидермальных стволовых клетках (ЭСК) РБДЭ-пациентов и в работах C. Chamorro и соавт. [18] и Á. Mencía и соавт. [19]. Исследователи выявили, что при пересадке трансплантатов с использованием этих генно-модифицированных клеток иммунодефицитным мышам наблюдается отложение C7 в области базальной мембраны и образование якорных волокон.

M. Aushev и соавт. [20], используя данную систему РГ, также выделили из кожи РДБЭ-пациентов клоны керптиноцитов, несущие нормальный COL7A1. По мнению исследователей, эти клетки можно размножить и использовать в виде эпидермальных пластов для лечения кожных ран РДБЭ-пациентов. Как показали ДИ, TALEN — достаточно эффективная система редактирования, способная специфически узнавать любую последовательность ДНК, однако существенным недостатком TALEN-доменов является трудоемкость и сложность их клонирования [20]. Так, при необходимости изменить одну последовательность для редактирования на другую нужно полностью изменить дизайн TALEN и клонировать de novo всю химерную молекулу TALEN.

В отличие от функционирования белков TALEN действие более современной системы CRISPR/Cas9 направляется некодирующей РНК [21]. CRISPR — это короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами и разделенные уникальными последовательностями, Cas9 — нуклеаза, разрезающая ДНК [6,22].

CRISPR/Cas9 относится к системам, в которых CRISPR-участки транскрибируются, процессируются и в соединении с транс-активированной CRISPR РНК образуют направляющую РНК, которая, комплементарно взаимодействуя с целевым фрагментом ДНК, осуществляет узнавание ДНК-мишени. Связавшись с ДНК, эти РНК взаимодействуют с Cas9-нуклеазой, которая, конформационно перестраиваясь, активируется для разрезания ДНК. CRISPR/Cas9 возможно нацелить на любую последовательность в геноме с сохранением эндогенных промоторов для экспрессии гена.

К настоящему времени с помощью CRISPR/Cas9 были успешно редактированы с функциональной коррекцией мутации COL7A1 ДФ, кератиноциты и ИПСК РБДЭ-пациентов и успешно трансплантированы мышам с РДБЭ [8, 9, 23—25]. Так, J. Jackow и соавт. [9] использовали систему CRISPR/Cas9 для редактирования ИПСК, полученных из соматических клеток кожи РДБЭ-пациентов. Выполнив в ИПСК коррекцию COL7A1 путем ГНР, исследователи успешно дифференцировали генно-модифицированные ИПСК в кератиноциты и ДФ. Показано, что колония (клон) способна образоваться из одной клетки-предшественницы ДФ, эту колонию можно изолировать/секвенировать, что дает возможность из одной предварительно отредактированной клетки-предшественницы получить клон нормальных по C7 ДФ для производства генных препаратов ex vivo [11].

Аналогичную стратегию РГ с помощью системы CRISPR/Cas9 применили B. Webber и соавт. [6], использовав первичную культуру ДФ РДБЭ-пациентов для получения ИПСК, которые затем были дифференцированы в кератиноциты, МСК и гемопоэтические клетки-предшественники. Исследователи заключили, что система CRISPR/Cas9 в комбинации с технологией ИПСК может быть успешно использована для создания аутологичной платформы и получения на ее основе нескольких типов генно-модифицированных клеток, которые можно применять для лечения РДБЭ-пациентов. Похожий метод РГ ИПСК с помощью CRISPR/Cas9 представлен и в работе M. Itoh и соавт. [26].

W. Wu и соавт. [25] использовали систему CRISPR/Cas для локальной доставки рибонуклеопротеинов Cas9/sgRNA в кожу постнатальных мышей. С помощью этой системы был эффективно удален экзон с точечной мутацией в COL7A1 в ЭСК РДБЭ-мышей, что привело к восстановлению корректной локализации C7 in vivo. Результаты исследования показали значительное снижение образования пузырей. Исследователи продемонстрировали, что генная терапия на основе системы Cas9/sgRNA способна редактировать дефектный ген на уровне стволовых клеток in vivo, а это подразумевает долговременное, а возможно, и пожизненное, восстановление дефектного гена. Cas9/sgRNA также позволяет избежать риска, связанного с вирусными системами доставки (например, возможной интеграции вирусной ДНК в геном и активации вызванных вирусом иммунных реакций в организме хозяина), а также избежать трудностей, связанных с большим размером COL7A1 [2, 10]. Показано, что COL7A1 кДНК граничит с максимальной грузоподъемностью большинства вирусных векторов, используемых для генной терапии (8—9 кб), следствием чего является ограничение эффективности проводимой трансдукции ex vivo [27].

В 2020 г. Европейское агентство по лекарственным средствам присвоило лекарственному препарату на основе CRISPR/Cas9-опосредованной эксцизии несущего мутацию экзона 80 COL7A1 статуса орфанного препарата как потенциально новой терапии для РДЭБ-пациентов [2, 10].

Система CRISPR/Cas9 продемонстрировала ряд преимуществ по сравнению с TALEN, в частности высокую эффективность редактирования при значительно меньших затратах по сравнению с нуклеазами, ориентированными на белковую структуру, а также простоту производства и возможность редактировать любой участок ДНК [10] (табл. 1). S. Shinkuma и соавт. [28] провели редактирование гетерозиготной мутации, вызывающей ДДБЭ, в COL7A1 на ИПСК. Эти ИПСК были выделены из ДФ человека, несущих мутацию, по механизму НСК с помощью TALEN-нуклеазы и параллельно с помощью системы CRISPR/Cas9. Выявлено, что система CRISPR/Cas9 осуществляет редактирование приблизительно в 2—3 раза эффективнее TALEN [28]. Недостатком же системы CRISPR/Cas9 является ее нецелевая активность, когда направляющая РНК отжигается неспецифически и способствует разрезанию другой последовательности, часто локализованной в другом гене, на другой хромосоме [6, 11]. Эта активность может стать причиной летальных изменений в редактируемой клетке, поэтому основная задача после проведения редактирования заключается в отборе клеток, в которых прошел процесс специфического редактирования и нет неспецифических мутаций в других последовательностях [29].

Таблица 1. Сравнительный анализ методов генной заместительной терапии и редактирования генов [6, 20—22, 30—34]

Тем не менее к настоящему времени уже достигнут значительный прогресс в изучении возможности использования инструментов CRISPR/Cas9 для доставки и РГ РДБЭ [22]. Генная терапия РДБЭ, направленная на стволовые клетки кожи in vivo, является чрезвычайно важной инновационной стратегией для излечения этого одного из самых тяжелых наследственных заболеваний человека.

В целом технологии редактирования генома РДБЭ находятся еще на ранних этапах разработки — ДИ. Однако уже полученные результаты исследований, согласно которым точная генная коррекция была достигнута как в первичных клетках кожи, так и в ИПСК, подтверждают перспективность применения данного метода в генной терапии РДБЭ-пациентов [2, 4, 15, 21, 27].

Следует отметить, что современные стратегии генной заместительной терапии ex vivo (которые вышли уже на стадию КИ) и ex vivo редактирование генов (пока еще на стадии ДИ) позволяют достичь весьма высоких уровней коррекции мутации в COL7A1 как основной причины РДБЭ. Большие надежды возлагаются также на методы и подходы генной терапии, направленные на стволовые клетки кожи, например на активно изучаемые сегодня ИПСК, с помощью которых можно обеспечить пациента неограниченным количеством аутологичных клеток, продуцирующих функциональный C7.

Эффективность же доставки трансгена in vivo для системного применения остается спорной проблемой, и пока в этом направлении прорыва нет. Помимо этого, для всех генных стратегий по-прежнему не решен вопрос, связанный с риском развития неблагоприятных иммунных реакций против нового C7 у пациентов с нулевой экспрессией этого белка. Проводимые КИ включают только пациентов с остаточной экспрессией C7 или с отсутствием антител к предполагаемому белковому продукту. Поэтому разработка стратегии, направленной на образование иммунной толерантности к вновь вырабатываемому C7, является одной из задач исследований в области генной терапии. Решение этой проблемы позволит распространить методы генной терапии на всех РДБЭ-пациентов без исключения.

Многие вопросы генной терапии РДБЭ-пациентов пока не решены, однако, бесспорно, стратегии и подходы этого направления современной медицины имеют многообещающие перспективы, что подтверждают результаты ДИ и КИ. Уверенность в несомненном прогрессе в этой области подкрепляется также огромными достижениями в генной терапии других наследственных заболеваний (clinicaltrials. gov: NCT03081715, NCT03398967, NCT03166878, NCT02793856, NCT03044743, NCT03164135 [3]).

Значительные достижения в генной терапии и оптимизация протоколов клеточных культур позволили разработать эффективные подходы ex vivo и in vivo для лечения РДБЭ. Разрабатываемые биомедицинские продукты находятся на разных стадиях процессинга: часть из них уже используется в клинике, для других еще проводятся лабораторные и доклинические исследования (табл. 2).

Таблица 2. Краткая информация о продуктах/КИ клеточной и генной терапии

Проведенные ДТ и КИ с использованием генно-модифицированных кератиноцитов и ДФ продемонстрировали многообещающий потенциал в лечении РДБЭ. Обнаруженную в ходе исследований проблему, связанную с низкой численностью ЭСК в популяции кератиноцитов кожи РДБЭ-пациентов в трансплантатах, можно решить, как показали исследования, с помощью ИПСК благодаря их неограниченному пролиферативному и дифференцировочному потенциалу, а также способности к самообновлению, что чрезвычайно важно при наращивании клеточной массы из единичных редактированных клеток.

Сложность патогенетических механизмов, лежащих в основе РДБЭ, диктует необходимость применение комбинированного подхода к лечению РДБЭ-пациентов для достижения оптимального клинического результата. Этот вывод подтверждают результаты исследований возможностей, которые демонстрирует генная терапия в сочетании с клеточной. Так, терапия COL7A1 с заменой или коррекцией рекомбинантного белка C7 для заживления кожных ран в сочетании, например, с использованием мезенхимальных/стромальных клеток или стволовых клеток пуповинной крови (для получения системных иммуномодулирующего и противовоспалительного эффектов) может значительно облегчить тяжесть РДБЭ, повысить устойчивость кожи к повреждениям и улучшить качество жизни таких пациентов. Применение аутологичных клеток пациента в комбинации с генной терапией на основе программируемых синтетических нуклеаз, обеспечивающих более точный подход к коррекции мутаций РДБЭ, позволит получить долгосрочный (возможно, пожизненный) клинический эффект. Наиболее целесообразно использование данных методов начиная с детского возраста пациентов — до начала функциональных повреждений или других осложнений. В этом случае высоки шансы избежать возникновения серьезных осложнений РДБЭ, включая сквамозно-клеточную карциному, предупредив развитие хронического воспаления и фиброза, а значит, значительно повысить качество и продолжительность жизни больных. Известно, что РДБЭ является одним из наиболее тяжелых наследственных заболеваний со значительной смертностью в молодом возрасте.

К тому же комбинированный подход с использованием ИПСК и стратегии редактирования генов предоставляет новые возможности для развития персонализированных методов заместительной терапии. Однако, прежде чем эти инновационные технологии будут введены в клиническую практику, необходимо проведение еще значительного количества доклинических и клинических исследований их безопасности.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.