Влияние коллагенсодержащего препарата на численность и пролиферативную активность фибробластов кожи в эксперименте

Изменения кожи при старении и воздействии ряда негативных факторов, в том числе табачного дыма, связаны с уменьшением численности фибробластов и их функциональной активности, а также с дезорганизацией компонентов экстрацеллюлярного матрикса [1—4]. Фибробласты поддерживают гомеостаз внеклеточного матрикса кожи, обеспечивая ее ремоделирование и обновление [5—7].

Курение сигарет является распространенной привычкой среди различных групп населения, в том числе среди женщин и подростков. Курение ускоряет процесс старения кожи, поскольку сигаретный дым вызывает окислительный стресс и образование свободных радикалов. Эти процессы приводят к уменьшению синтеза коллагена, составляющего основу соединительной ткани кожи и обеспечивающего ее прочность и эластичность. Кроме того, курение повышает уровень матричных металлопротеиназ, что приводит к деградации коллагена, эластических волокон и протеогликанов в коже [8]. В связи с этим актуально изучение морфологических процессов, происходящих в коже при действии табачного дыма.

В эстетической медицине используют различные инъекционные и пероральные средства, содержащие коллаген [2, 3]. Поиск препаратов, способствующих нормализации состояния фибробластов кожи и компонентов экстрацеллюлярного матрикса, — актуальная задача современной медицины. Одним из таких препаратов является отечественный коллагенсодержащий препарат, представляющий натуральный гидролизованный коллаген I и III типов. Препарат применяется для профилактики старения кожи и волос, лечения проявлений постакне, способствует укреплению суставов, предотвращению развития синдрома раздраженного кишечника, восстановлению нарушений соединительной ткани, возникших в результате травм.

Цель исследования — оценка изменений численности фибробластов и их пролиферативной активности в коже экспериментальных животных при длительном воздействии сигаретного дыма и последующем применении коллагенсодержащего препарата.

Опыты проведены на крысах-самцах линии Wistar, которых содержали при температуре 22±1 °C в условиях вивария ЧГУ им. И.Н. Ульянова, доступ к воде и пище был свободный. Для анализа воздействия сигаретного дыма на животных создали затравочную камеру объемом 0,3 м³, в которой проводили сжигание сигарет 2 раза в сутки в течение 30 мин. Сигареты использовали со следующим составом: смолы 10 мг/сиг, никотин 1 мг/сиг (ГОСТ 3935—2000 «Сигареты. Общие технические условия» и Федеральный закон от 22.12.2008 № 268-ФЗ «Технический регламент на табачную продукцию»). После пребываниях в условиях табачного дыма крыс извлекали из камеры и содержали в обычных условиях вивария. Еженедельно оценивали их общее состояние.

Всех животных разделили на опытную (n=75) и контрольную (n=20) группы. Животные опытной группы находились в затравочной камере в условиях табачного дыма в течение 4 мес по 30 мин каждый день 2 раза в сутки. В опытной группе сформированы 3 подгруппы (по 25 животных), которые, начиная с первого дня после окончания четырехмесячного воздействия табачного дыма, получали перорально с питьевой водой коллагенсодержащий препарат российского производства в суточной дозе 120 мг/кг. Животным 1, 2 и 3-й подгрупп препарат применяли соответственно в течение 1, 2 и 3 мес. Животные контрольной группы находились в затравочной камере без табачного дыма, и коллагенсодержащий препарат не получали.

Для оценки состояния дермальных фибробластов у животных с дорсальной поверхности шеи брали биоптаты кожи (1×1 см), которые в течение 24 ч фиксировали в 10% растворе формалина, обезвоживали и заливали в парафин. Затем готовили срезы толщиной 4 мкм и окрашивали их гематоксилином-эозином. В полученных гистологических препаратах подсчитывали число фибробластов. Иммуногистохимические исследования проводили с оценкой экспрессии маркера пролиферации Ki-67 [7]. В качестве первых антител использовали поликлональные кроличьи антитела (титр 1:50, NB110–89717SS, «Novus Biologicals Inc.», США). Визуализацию антигенов осуществляли с помощью системы EnVision, конъюгированной с пероксидазой (K 4002, «DakoCytomation», Дания) [7]. В качестве контроля специфичности окраски применяли нормальную кроличью сыворотку в концентрации 1%. Подсчет числа клеток в коже осуществляли под микроскопом Carl Zeiss Axio Scope A1 (Германия) и SigmaScan Pro5 (США) в 1 мм² в 10 полях зрения при увеличении в 400 раз. Статистическую обработку проводили в программе Statistica-10 («StatSoft Inc.», США) с использованием критериев Краскела—Уоллеса и Манна—Уитни. Полученные данные представляли в формате средних значений и среднего квадратического отклонения (M±SD). За уровень статистической значимости принимали p<0,05.

У животных опытной группы после их содержания в течение 4 мес в условиях сигаретного дыма в гистологических препаратах выявлено истончение эпидермиса, сглаживание границы дермоэпидермального соединения, дезорганизацию коллагеновых волокон. В дерме установлено статистически значимое уменьшение числа фибробластов (на 26,5%), а также доли пролиферирующих Ki-67⁺-фибробластов (в 2,3 раза) по сравнению с аналогичными показателями контрольной группые (p<0,05; табл. 1, 2).

Таблица 1. Число фибробластов в дерме экспериментальных животных (M±SD)

Примечание. Здесь и в табл. 2: животные 1, 2 и 3-й подгрупп получали препарат соответственно в течение 1, 2 и 3 мес. p₁ — уровень статистической значимости различий при сравнении опытной и контрольной групп; p₂ — уровень статистической значимости различий при сравнении показателей в подгруппах до и после применения коллагенсодержащего препарата.

Таблица 2. Доля Ki-67⁺-фибробластов в дерме экспериментальных животных (M±SD)

После применения коллагенсодержащего препарата число фибробластов в коже животных достоверно возрастало. Так, в 1-й подгруппе животных, получавших препарат в течение 1 мес, число фибробластов в дерме увеличилось на 5,4%. Во 2-й и 3-й подгруппах животных, получавших препарат в течение 2 и 3 мес, число фибробластов в дерме увеличилось соответственно на 13,1 и 28% (см. табл. 1).

Доля пролиферирующих Ki-67⁺-фибробластов после применения препарата также достоверно увеличилась в 1,3, 1,5 и 1,7 раза в 1, 2 и 3-й соответственно (см. табл. 2).

С морфологической точки зрения фибробласты представляют собой клетки веретенообразной формы с плоскими овальными ядрами, хорошо выраженным перинуклеарным пространством и острыми отростками. Они играют важную роль в поддержании структурной целостности дермы и связаны с коллагеновыми волокнами. Коллаген выполняет регуляторную функцию в морфогенезе, дифференцировке, миграции и синтетической активности фибробластов [1—7]. В процессе старения и воздействия неблагоприятных факторов в коже могут развиваться 2 типа молекулярных механизмов, один из которых связан с изменениями количества и функциональной активности фибробластов, второй — с нарушением гомеостаза внеклеточного матрикса дермы и его основного структурного компонента коллагена. С возрастом в популяции дермальных фибробластов наблюдается уменьшение численности клеток, связанное в первую очередь с истощением пула клеток-предшественников фибробластов. Это приводит к снижению регенеративного потенциала кожи. Вместе с этим развиваются нарушения структуры и функционирования внеклеточного матрикса кожи, обусловленные изменением его механических и конформационных свойств, которые в свою очередь влияют на функционирование дермальных фибробластов. Все эти деструктивные процессы образуют замкнутый круг, способствующий прогрессированию старения кожи [7].

Следует отметить, что исследования, направленные на изучение влияния негативных факторов на старение кожи, а также поиск препаратов, улучшающих свойства и внешний вид кожи, являются весьма актуальными.

В нашем исследовании получены новые данные, свидетельствующие о негативном влиянии на кожу экспериментальных животных сигаретного дыма. В результате проведенного эксперимента выявлено, что после воздействия сигаретного дыма в течение 4 мес в дерме происходило снижение числа и пролиферативной активности фибробластов. После приема коллагенсодержащего препарата отмечено увеличение числа фибробластов и их пролиферативного потенциала. Это связано с тем, что в составе препарата присутствуют гидролизаты белков (в том числе коллагена) и ингредиенты, которые влияют на сигнальные пути, стимулирующие синтез коллагена и компонентов внеклеточного матрикса (пролил-4-гидроксилазы, эластина, интегринов).

Воздействие в течение 4 мес сигаретного дыма на кожу экспериментальных животных приводит к снижению в ней числа фибробластов и их пролиферации. Применение коллагенсодержащего препарата способствует увеличению как численной популяции фибробластов, так и их пролиферативной активности.

Источник финансирования. Рукопись подготовлена (работа/исследования выполнены) на личные средства автора.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

The source of financing. The manuscript was prepared (work/research completed) at the author’s personal expense.