Возможности применения методов лазерной флюоресцентной спектроскопии и доплеровской флоуметрии при бляшечной склеродермии

Локализованная склеродермия (ЛС), известная также как очаговая склеродермия или морфея, представляет собой редкое хроническое аутоиммунное заболевание из группы коллагенозов, которое характеризуется формированием воспалительно-склеротических очагов на коже с возможным поражением подлежащих тканей и без участия в патологическом процессе внутренних органов [1, 2]. В зависимости от клинической картины (распространенности, степени и глубины фиброза) ЛС подразделяют на 5 основных типов (ограниченный, генерализованный, линейный, глубокий и смешанный), а также на различные подтипы (бляшечный, пансклеротический, саблевидный, прогрессирующая гемиатрофия лица Парри—Ромберга, буллезный и др.) [3]. Бляшечный подтип склеродермии (БС) является наиболее распространенным среди других форм ЛС. При этом общая заболеваемость ЛС колеблется от 2 до 27 случаев на 1 млн населения с преобладанием в 2—4 раза лиц женского пола [1, 3, 4].

По данным современной литературы, в патогенезе ЛС можно выделить 3 клинические стадии: воспаление—индурация—склероз, которым соответствует 3 патофизиологические фазы воспаление, гипоксия с дезорганизацией коллагена, фиброз, условно последовательные, но могут перекрывать друг друга. [1, 3, 5—7]. Течение БС может носить характер рецидивирующе-ремиттирующего заболевания с риском реактивации с течением времени, после наступления ремиссии [8]. При этом выбор метода терапии опирается на ведущий патологический процесс [1—3]. В научной литературе также активно обсуждается мнение, что длительность, своевременность начала и объем терапии зависят от объективной оценки активности заболевания [8, 9]. Однако наблюдается значительная сложность в объективизации определении активности ЛС, что способствует поздней диагностике прогрессирования заболевания или недостаточному лечению, приводящим к более частым рецидивам и осложнениям [9]. Единственным объективным методом, способным отразить все стадии ЛС, остаются гистологическое и иммуногистохимическое исследования биоптата кожи [1, 2, 10]. Но, как известно, данный метод исследования является инвазивным и не может быть использован как метод динамической оценки заболевания. Следует также отметить недостатки гистологического исследования: стоимость, трудоемкость и чувствительность результатов к квалификации патоморфолога. В связи с этим научно-практический интерес многих исследователей сосредоточен на разработке объективных неинвазивных методов диагностики БС.

В научной литературе сообщается о попытках использовании различных инструментальных методов исследования для оценки тяжести и активности заболевания у пациентов с ЛС. В ранее проводимых клинических исследованиях использовали лазерную допплеровскую флоуметрию — ЛДФ [11, 12], ультразвуковое сканирование [13, 14], термографию [14, 15], дурометрию [16], кутометрию [17]. Однако в большинстве исследований эти методы диагностики использовались как вторичные критерии оценки совместно с клиническими индексами, а также следует отметить, что все данные методы ограничены получением только физико-технической информации, интерпретация которой в той или иной степени зависит от исследователя и его квалификации.

Принцип метода лазерной флюоресцентной спектроскопии (ЛФС) основан на регистрации аутофлюоресценции эндогенных флюорофоров в биологической ткани, вызванной действием света на подходящей длине волны, что позволяет количественно оценить изменения в биохимическом составе тканей. Как отмечается, порфирины, коллаген, липофусцин, НАД-Н могут являться перспективными эндогенными оптическими маркерами для регистрации воспалительно-склеротических изменений в тканях in vivo [18—20].

С учетом перспективности использования методов неинвазивной оптической диагностики в оценке различных аспектов таких патологических процессов, как воспаление и фиброз, целью исследования стал анализ совокупной применимости методов ЛДФ (показателя микроциркуляции) и ЛФС (коллагена, липофусцина, порфиринов как флюоресцентных маркеров) для объективного определения преобладающих патологических процессов при БС in vivo и возможности оценки активности патологического процесса.

В исследование были включены пациенты добровольцы (n=41), находящиеся на стационарном лечении в отделении дерматовенерологии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, с диагнозом: ограниченная или распространенная бляшечная склеродермия (с исключенным системным процессом). В группу исследования всего вошло 41 человек (2 мужчины, 39 женщин), медиана возраста 55 лет) евразийского происхождения с II фототипом кожи по Фитцпатрику, длительное время проживавших на территории одного региона (Москва и Московская область). Клиническое исследование было одобрено научным и этическим советом МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Все участники подписали добровольное информирование согласие на участие в исследовании. В исследуемую группу вошло всего 59 очагов (38 — активных, 21 — неактивных). Подгруппы сформированы по клиническому характеру патологического процесса в очаге: всего воспалительное пятно или воспалительный перифокальный венчик (n=26, медиана возраста 55), индурация (n=22, медиана возраста 45,5), склероз (n=21, медиана возраста 63) и контрольная интактная кожа (n=42, медиана возраста 55). Критерии исключения из исследования: заболевания крови (тромбоцитопения, анемия средней и тяжелой степени и др.); сахарный диабет; хронические и острые сердечно-сосудистые заболевания (ишемическая болезнь сердца, в том числе стенокардия напряжения III—V функционального класса, хроническая сердечная недостаточность III—IV функционального класса, инфаркт миокарда, инсульт в анамнезе, коронарная/каротидная реваскуляризация, заболевания периферических артерий); нарушения ритма сердца; диагностированные системные аутоиммунные заболевания; беременность; выраженная инсоляция и загар за последние 6 мес; отказ от участия в исследовании.

Исследование состояло из нескольких этапов: 1) сбор жалоб и анамнеза, осмотр дерматовенеролога, определение фототипа кожи по Фитцпатрику, определение факторов исключения из исследования, клиническая оценка патологических кожных очагов; 2) исследование патологических кожных очагов и в качестве контроля — интактной кожи методами ЛФС и ЛДФ, при помощи прибора ЛАКК-М (ООО НПП «ЛАЗМА»), взятие биопсии; 3) статистический анализ полученных данных, сопоставление оптических данных с патоморфологическими.

Измерения каждым методом производили трехкратно в точках на расстоянии 0,5—1 см друг от друга, для каждой зоны клинического воспаления клинической индурации и склероза, а также в качестве контроля в зоне интактной кожи с контралатеральной стороны или на расстоянии 3—4 см от патологического кожного очага с последующим определением среднего значения.

Для количественной оценки содержания флюорофоров использовали индекс тканевого содержания вещества (η_f), вычисляемый по формуле [21]:

,

где I_f — интенсивность флюоресценции на эффективной длине волны регистрации флюоресценции флюорофора, I_bs — интенсивность обратно рассеянного лазерного излучения, предварительно уменьшенная оптическим фильтром примерно в β=1000 раз.

Для исключения внутрииндивидуальной вариабельности использовали нормированные на интактную кожу индексы тканевого содержания, вычисляемые по следующей формуле:

,

где η_f(оч) — индекс тканевого содержания флюорофора в очаге, η_f(инт) — индекс тканевого содержания флюорофора в контрольной интактной коже.

Для определения относительной (к интактной коже) величины показателя микроциркуляции (ПМ) предлагаем вычисление индексов ПМ по следующей формуле:

,

где ПМ(оч) — ПМ в очаге, а ПМ(инт) — в контрольной интактной коже.

В качестве объективного метода контроля исследования у 4 пациентов, сопоставимых по возрасту, полу и локализации патологического кожного процесса, после исследования на аппарате ЛАКК-М, взято 5 панч-биопсий (2 из зоны воспаления, 2 из зоны индурации, 1 из зоны склероза). Получены фрагменты кожи из исследуемой области размером 0,5×0,7 см и помещены в 10% раствор формалина с последующей окраской гистологических препаратов гематоксилин-эозином.

Статистический анализ выполнен с помощью программы R studio Version 1.4.1106 (RStudio PBC, USA) и языка R версии 4.2.2. Проверку нормальности распределения количественных признаков проводили с помощью критерия Шапиро—Уилка. Для зависимых количественных переменных сравнение выполняли в зависимости от нормальности распределения с помощью критерия Вилкоксона или критерия Стьюдента для зависимых наблюдений. Для независимых количественных переменных проводили дисперсионный анализ с апостериорными попарными сравнениями с помощью теста Тьюки (Tukey HSD) или критерия Крускала—Уоллиса с последующими апостериорными попарными сравнениями с помощью критерия Данна с поправкой Хольма—Бонферрони в зависимости от нормальности распределения. Статистически значимым считали уровень p<0,05.

Возбуждение полученных спектров флюоресценции с зон патологических кожных очагов вызвано УФ-лазером (λe 365 нм) и зеленым лазером (λe 535 нм). При их анализе оптические маркеры сравнивали между зонами клинического воспаления (воспалительное пятно и перифокальный венчик гиперемии), клинической индурации, склероза и интактной кожей (табл. 1). Дополнительно все показатели нормировали на интактную кожу и сравнивали (табл. 2).

Таблица 1. Результаты статистического анализа динамики оптических параметров и стандартного отклонения в зонах клинического воспаления, индурации, склероза и интактной кожи

Примечание. Ibs(365) и Ibs(535) — пики обратного рассеяния при индукции аутофлюоресценции УФ- и зеленым лазерами; средние индексы тканевого содержания для коллагена (η_f 420 и η_f455 нм), для совокупности эндогенных флюорофоров (липофусцин, НАД-Н, ФАД, жирные кислоты и др. — η_f480 нм), для порфиринов (η_f590 нм) и липофусцина (η_f 630 нм); ^a — критерий Вилкоксона, ^b — критерий Стьюдента, ^с — критерий Крускала — Уоллиса, ^d — дисперсионный анализ, * — p<0,05.

Таблица 2. Результаты статистического анализа динамики нормированных показателей флюоресценции µ(K) и µ(K) ПМ в зонах клинического воспаления, индурации и склероза

Примечание.^a — дисперсионный анализ, * — p<0,05.

В результате статистической обработки данных, полученных при определении индексов тканевого содержания эндогенных флюорофоров и ПМ, выявлено, что для подгруппы с преобладанием воспалительных процессов в зондируемой области характерно статистически значимое увеличение средних показателей порфиринов (ηf630 нм), липофусцина (η_f 590 нм), совокупных эндогенных флюорофоров (включая липофусцин, НАД-Н, ФАД, жирные кислоты и др. — η_f 480 нм) и ПМ по сравнению с оптическими показателями интактной кожи (p<0,05). Современные исследования поддерживают гипотезу о том, что порфирины чутко реагируют на метаболические изменения в тканях, и свидетельствуют, что их клеточный синтез значительно усиливается в условиях гипоксии и воспалительных процессов [20]. Мы предполагаем, что повышение флюоресценции порфиринов в фазу воспаления обусловлено наличием иммуноопосредованной реакции в тканях, возникшей из-за иммунной дисрегуляциии и приводящей к интенсивному повреждению эндотелия сосудов [5, 6]. При этом патофизиологически продолжающееся активное повреждение эндотелия сосудов, согласно современным данным, характеризуется постепенной активацией периваскулярных фибробластов, пролиферацией перицитов и гладкомышечных клеток в миофибробласты, повышением синтеза активных форм кислорода (АФК), что, в свою очередь, приводит к гипоксии ткани, которая в конечном счете становится ведущим механизмом поддержания продукции АФК [7]. Помимо этого, следует отметить, что никотинамидадениндинуклеотиид (НАД), известный кофермент, активно участвующий в окислительно-восстановительных реакциях в клетках, и в условиях усиленного синтеза АФК является ключевой молекулой для восстановления баланса [7]. В то же время липофусцин — это липопигмент и продукт лизосомальной дисфункции, признанный маркером хронического оксидативного стресса [23], вследствие чего усиление аутофлюоресцении на длине волны 480 нм может быть обусловлено их совокупной концентрацией.

В очагах БС с клинически преобладающей индурацией анализ флюоресценции коллагена (η_f 420 нм и η_f 455 нм) показал статистически достоверное увеличение по сравнению с интактной кожей и подгруппой воспаления (p<0,05). Помимо повышенных индексов содержания коллагена, в данной подгруппе отмечено статистически значимое повышение эндогенной флюоресценции порфиринов (η_f 630 нм), липофусцина (η_f 590 нм), совокупности эндогенных флюорофоров (η_f 480 нм) по сравнению с контрольной подгруппой интактной кожи (p<0,05). Предполагаем, что эти явления в стадию индурации, вероятно, обусловлены сохраняющимся воспалительным процессом и началом усиленного синтеза и гомогенизации коллагеновых волокон в экстрацеллюлярном матриксе, что согласуется с современными представлениями о патофизиологических процессах и патоморфологических изменениях в данную фазу заболевания [1, 7, 10].

В подгруппе с преобладанием в очагах БС склероза наряду с повышением индексов тканевого содержания коллагена (η_f 420 нм и η_f 455 нм), липофусцина и совокупности флюорофоров по сравнению с интактной кожей (p<0,05) наблюдается достоверное снижение флюоресценции порфиринов и ПМ по сравнению с подгруппами с преобладанием воспаления и индурации (p<0,05), что может трактоваться как возможное снижение активности воспалительного процесса.

Динамика ПМ в зависимости от преобладающего патологического процесса в очаге, вероятнее всего, зависит от плотности капиллярной сети, которая на ранней воспалительной фазе увеличивается из-за активной иммуноопсредованной реакции, однако прогрессирующая эндотелиальная дисфункция в итоге приводит к обеднению капиллярного русла, что продемонстрированно в исследовании P. Helmbold и соавт. [22].

Следует отметить, что вариабельность поглощающих и рассеивающих свойств кожи влияет на спектр флюоресценции (регистрируемый in vivo) и зависит от ряда факторов, основными из которых являются объем кровенаполнения ткани и концентрации эндогенных хромофоров кожи [21, 22]. Статистический анализ средних значений пиков обратного рассеяния (Ibs365 и Ibs535) показал отсутствие значимых достоверных различий по критерию Крускала—Уоллиса (p>0,05) в зависимости от клинического характера зоны (воспаление, индурация, склероз), что, вероятнее всего, говорит о сопоставимых поглощающих и рассеивающих свойств кожи в этих подгруппах (табл. 1). При этом сравнение средних значений пиков обратного рассеяния (Ibs365) в зависимых подгруппах (интактная (воспаление) и воспаление, интактная (индурация) и индурация, интактная (склероз) и склероз) показал статистически достоверное повышение их значений в подгруппах интактной кожи (p<0,05) по сравнению с подгруппами воспаления, индурации и склероза (табл. 1). Анализ средних значений пиков обратного рассеяния (Ibs535) в тех же зависимых подгруппах показал лишь достоверные различия в паре интактная (воспаление) — воспаление (p<0,05) в пользу снижения в области воспаления (табл. 1). Это явление на ранних стадиях заболевания (воспаление) может быть обусловлено повышенным объемом кровенаполнения и отеком тканей, а на более поздних стадиях — накоплением совокупности флуорофоров (липофусцин, свободный и связанный НАД-Н, жирные кислоты и др.), которые, как известно, перекрывают большую часть спектра флуоресценции в УФ-диапазоне [24]. Помимо этого, статистический анализ индексов тканевого содержания флюорофоров и ПМ в области контрольной интактной кожи в зависимости от анатомической локализации очагов продемонстрировал отсутствие статистически значимых различий (p>0,05), что позволяет не учитывать фактор анатомической локализации очагов в статистическом анализе. Однако следует подчеркнуть малое число наблюдений в ряде анатомических зон (спина в межлопаточной области — 8, бедро внутренняя и передняя поверхность — 11, шея передняя поверхность 3, плечо внутренняя поверхность — 1). Поэтому на основании вышеизложенных данных для исключения влияния эндогенных факторов на спектр флюоресценции и исключения внутрииндивидуальной вариабельности рекомендуем рассчитывать нормированные показатели на интактную кожу.

Дисперсионный анализ нормированных индексов тканевого содержания флюорофоров µ(K) и относительного µ(K) ПМ (табл. 2) в целом не противоречит статистическому анализу средних индексов тканевого содержания эндогенных флюорофоров и ПМ (табл. 1). Однако при попарном сравнении подгрупп индурация — склероз по нормированному индексу коллагена µ(K) (455) не отмечено достоверных различий (p=0,209), так же и при сравнении подгрупп склероз — воспаление по нормированному показателю липофусцина µ(K) (590) достоверных различий нет (p=0,654). Соответственно нами определены оптимальные оптические маркеры для объективизации ведущего патологического процесса в очаге БС: коллаген (η_f 420), совокупность флюорофоров (η_f 480), порфирины (η_f 630) и ПМ. Динамика нормированных на интактную кожу показателей эндогенного содержания флюорофоров и ПМ изображена на рис. 1.

Рис. 1. Динамика нормированных на интактную кожу индексов тканевого содержания флюорофоров и ПМ (M±SD) в зависимости от подгруппы.

* — дисперсионный анализ, p<0,05.

В качестве дополнительного объективного метода контроля исследования нами взято 5 верифицирующих панч-биопсий после исследования на аппарате ЛАКК — М, у пациентов разных подгрупп (2 из зоны воспаления, 2 из зоны индурации, 1 из зоны склероза), сопоставимых по возрасту, полу и локализации патологического кожного процесса (рис. 2). Гистологическая картина соответствовала клинической оценке очагов и результатам, полученным методами ЛФС и ЛДФ.

Рис. 2. Гистологические препараты, окраска гематоксилином и эозином (×100).

1 и 2 — биопсия воспалительного пятна (свежие активные очаги, существующие менее 3 мес), выраженные периваскулярные воспалительные инфильтраты, выраженный сосочковый слой дермы, структурных изменений в дерме нет; 3 и 4 — биопсия из зоны идурации (активные очаги, существующие 3—6 мес), сохраняется периваскулярный воспалительный инфильтрат, отмечаются области гомогенизации коллагена, сосочковый слой дермы сглажен; 5 — биопсия из зоны склероза (неактивный очаг, существует более 3 лет без динамики), наблюдаются сглаженный сосочковый слой дермы, плотно упакованный гомогенизированный коллаген, уменьшение количества сосудов и потеря клеток, наличие мелких склерозированных сосудов.

Статистический анализ полученных данных апостериорными попарными сравнениями свидетельствует о невозможности применения одного конкретно выбранного оптического маркера в качестве критерия объективизации ведущего патологического процесса (табл. 1 и 2), что диктует необходимость их сочетанного учета. На основании полученных результатов можно заключить, что совокупное применение методов ЛФС и ЛДФ позволяет с высокой точностью определить преобладание патологического процесса в очаге БС in vivo и оценить активность патологического процесса у каждого пациента. По нашему мнению, ЛФС и ЛДФ также можно рассматривать как перспективные методы проведения динамического мониторинга эффективности терапии БС независимо от метода терапии.

Следует подчеркнуть ряд ограничений нашего исследования: в группу исследования включены только пациенты с II фототипом кожи по Фитцпатрику и бляшечной формой склеродермии; не проводился учет степени меланиновой пигментации исследуемой области, а, как известно, меланин является хромофором эпидермиса и дермы, который способен влиять на спектр флюоресценции; при оценке микроциркуляции не оценивались объем кровенаполнения и удельное потребление кислорода исследуемой области. Кроме того, мы не проводили анализ сопутствующих факторов, как-то хронических заболеваний, способных влиять на спектр флюоресценции и состояние микроциркуляторного русла.

Разработка неинвазивного объективного метода диагностики для персонализированного динамического контроля заболевания при терапии ЛС представляет большой научно-клинический интерес.

Для определения ведущего патологического процесса и возможности оценки его активности в очагах при БС описаны наиболее подходящие для этого оптические маркеры (коллаген η_f 420, совокупность флюорофоров η_f 480, порфирины η_f 630 и ПМ). В последующих исследованиях планируется определение пороговых значений индексов тканевого содержания флюорофоров и ПМ с учетом упорядочивающего фактора, основанного на апостериорных попарных сравнениях, и разработка алгоритма их оценки с определением чувствительности и специфичности метода диагностики.

Финансирование. Из средств госзадания ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, по разделу «Наука».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Хынку Е.Ф., Разницына И.А., Молочкова Ю.В., Рогаткин Д.А., Молочков А.В.

Сбор и обработка материала — Хынку Е.Ф., Молочкова Ю.В., Гуреева М.А.

Статистическая обработка данных — Разницына И.А., Глазков А.А.

Написание текста — Хынку Е.Ф., Гуреева М.А.

Редактирование: Молочкова Ю.В., Рогаткин Д.А., Молочков А.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликтав интересов.

Financing. From the state assignment funds of the State Budgetary Healthcare Institution of the Moscow Region MONIKI named after M.F. Vladimirsky, in the science section.

Authors’ contributions:

The concept and design of the study — Khynku E.F., Raznitsyna I.A., Molockova Y.V., Rogatkin D.A., Molockov A.V.

Collecting and interpreting the data — Khynku E.F., Molockova Y.V., Gureeva M.A.

Statistical analysis — Raznitsyna I.A., Glazkov A.A.

Drafting the manuscript — Khynku E.F., Gureeva M.A.

Revising the manuscript — Molockova Y.V., Rogatkin D.A., Molockov A.V.