Термические травмы являются серьезной медицинской, экономической и социальной проблемой здравоохранения, при этом основной причиной летальности пострадавших от ожогов остается ожоговая инфекция. Ввиду обилия некротических масс и постоянно пополняющегося запаса питательных веществ, диффундирующих из плазмы, ожоговая рана является оптимальной средой для размножения микроорганизмов. Первичная колонизация ожоговой поверхности происходит уже в первые часы после травмы, либо она изначально является обсемененной. Видовой состав контаминантов ожоговых ран разнообразен, поскольку источники микробной контаминации могут быть как эндогенного происхождения (необожженная кожа, желудочно-кишечный тракт пациента), так и экзогенного генеза (контаминированные руки, ротоглотка и одежда медицинского персонала; катетеры и другие медицинские устройства) [1]. Следующий этап инфекционного процесса сопровождается формированием на поверхности раны сложных, взаимодействующих между собой сообществ микроорганизмов, заключенных в экстрацеллюлярный полимерный матрикс — биопленки [2, 3]. При моделировании инфекционного процесса на ранах свиней было доказано, что образование зрелых биопленок происходит через 48 ч после заражения [4]. Созревание биопленки и последующая дисперсия бактерий, распространяющихся с кровотоком по всему организму, приводят к генерализации инфекционного процесса, развитию тяжелых вторичных осложнений ожоговой болезни (плевропневмония, эндокардит, менингоэнцефалит, сепсис), увеличивают риск инвалидизации и смертности пациентов [2, 3].

Биопленка на поверхности раны, как правило, поливидовая. Естественно, что между членами микробных сообществ в биопленке устанавливаются сложные межвидовые взаимоотношения, которые могут быть антагонистическими, например конкуренция за питательные вещества и торможение роста других членов биопленки, или синергетическими — содействие формированию биопленки путем совместной агрегации и метаболического сотрудничества, когда один вид использует метаболит, продуцируемый соседними видами [5—7]. Примером антагонистических способностей является способность, установленная у ассоциации Staphylococcus aureus с Pseudomonas aeruginosa, продуцировать бактериоцины, ингибирующие рост представителей кишечной и кожной микробиоты. Подробный анализ нескольких наблюдений in vitro и in vivo показал, что S. aureus демонстрирует кооперативные отношения с Candida albicans, Enterococcus faecalis и Haemophilus influenzae и конкурентные отношения с P. аeruginosa, Streptococcus pneumoniae, Lactobacillus spp. и Corynebacterium spp. Однако, несмотря на наличие обоих типов взаимоотношений, P. аeruginosa, H. influenzae, E. faecalis, S. pneumoniae и C. albicans могут восстановить свои патогенные свойства с помощью S. aureus. Межвидовые взаимодействия влияют на интенсивность роста микроорганизмов, экспрессию белка, патогенность и восприимчивость к антибиотикам [8].

Ввиду сложных межмикробных взаимоотношений анализ данных по динамике видового состава в ходе течения раневой инфекции вызывает серьезные сложности. При описании видовой структуры микробных сообществ ожоговых ран обычно определяют только качественные и количественные показатели микробной колонизации, без учета специфики видовых взаимодействий и смены сообществ микроорганизмов в динамике ожоговой болезни и антибиотикотерапии. Вместе с тем ясно, что для проведения адекватного мониторинга видовой структуры микробных сообществ требуется использование соответствующих статистических методов.

Цель исследования — демонстрация информативности методов описательной статистики, количественных методов микробной экологии и анализа зависимостей для изучения динамики микробных сообществ в ходе течения ожоговой болезни с учетом характера микробной контаминации различных локусов тела и антибиотикочувствительности возбудителей ожоговой инфекции.

В исследование были включены 57 пациентов в возрасте от 18 до 54 лет, госпитализированных в Челябинский областной ожоговый центр в период с 2014 по 2017 г. Травмы отобранных больных характеризовались термическим происхождением, поверхностным расположением, локализацией на одном или одновременно нескольких топографических участках тела, отсутствием поражений дыхательных путей, глубиной 2—3-й степени, площадью от 12 до 40%. Продолжительность пребывания в стационаре каждого больного составляла 4—30 сут.

Всего исследовано 545 проб раневого отделяемого. Количество проб от одного пациента варьировало от 2 до 29, модальное значение (квартили) 7 (4—13) проб. Микробиологическое исследование раневого материала проводили в соответствии с требованиями приказа № 535 Минздрава России «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений». Из полученных проб было изолировано 595 штаммов условно-патогенных бактерий, выделенных в монокультуре или составе микробных ассоциаций. Определение чувствительности выделенных штаммов к антибиотикам и фенотипическое определение маркеров антибиотикорезистентности проводили дискодиффузионным методом в соответствии с клиническими рекомендациями «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (версия 2015.02).

В ходе статистического анализа данных применяли методы описательной статистики, количественные методы микробной экологии и анализ зависимостей. При описании данных встречаемость микроорганизмов и количество чувствительных к антибиотикам штаммов выражали в относительных частотах с 95% доверительными интервалами (95% ДИ), вычисленными методом Джеффриса [9]. Среднее количество микроорганизмов с 95% ДИ рассчитывали по предварительно логарифмированным данным с последующей ретрансформацией результатов в исходную шкалу. При этом 95% ДИ рассчитывали с помощью процедуры бутстрепа (метод BCa, n=99 999). Для выявления ассоциаций микроорганизмов, а также оценки влияния на них локализации ожога и времени, прошедшего с момента травмы, использовали расчет индексов сходства Жаккара (C_J) и канонический анализ соответствий (КАС). Статистическую значимость C_J оценивали с использованием таблиц критических значений [10], а выделяемых КАС размерностей — в рандомизационном тесте Монте-Карло (n=99 999). Динамику изменения встречаемости микроорганизмов в ране оценивали в ходе регрессионного анализа с использованием обобщенной аддитивной модели (General Additive Model — GAM) для биномиального отклика. Во всех случаях обнаруженные эффекты считали статистически значимыми при р≤0,05, незначимыми при р>0,10. Расчеты и графические построения выполнены в программно-статистической среде R (v.3.0.3) [11] и пакетах PAST (v. 3.15;) [12], mgsv [13] и TpX (v.1.5) [14].

Анализ спектра возбудителей инфекций ожоговых ран. Анализ спектра микроорганизмов является стандартной процедурой, позволяющей выявлять основных возбудителей инфекции, в отношении которых в первую очередь должно быть направлено терапевтическое воздействие. Чаще всего такие спектры изображают на круговых диаграммах, снабженных численными значениями частот встречаемости (в %). Более информативным средством изображения спектра является диаграмма, на которой частоты встречаемости снабжены 95% Д.И. Если 95% ДИ для двух частот не перекрываются, значит различия между ними статистически значимы: р≤0,05 (обратное не всегда верно).

Существует несколько методов расчета ДИ для частот. Наиболее рекомендуемые методы: байесовский метод Джеффриса, метод Уилсона, метод Агрести—Коулла. Традиционен, но несколько более консервативен точный метод Клоппера—Пирсона. Все эти методы дают близкие значения ДИ, причем для не слишком больших выборок ДИ визуально имеют положительную асимметрию в области 0—30% и отрицательную — в области 70—100%. В то время как описанный во всех учебниках по статистике метод Вальда в настоящее время не рекомендуется использовать даже для больших выборок [9].

Анализ микробного пейзажа ожоговых ран (рис. 1)

Зависимость микробного пейзажа ран от локуса ожога и времени с момента травмы. Учитывая, что микробный пейзаж ожоговой раны может варьировать в зависимости от локуса ожога и времени с момента травмы, нами был применен многомерный эксплораторный анализ — КАС. Подобно анализу главных компонент данный метод также осуществляет редукцию данных с обобщением, однако работает с величинами, удобной мерой расстояния между которыми является статистика χ². Так как к таким величинам относятся численности, данный метод нашел широкое применение в экологии сообществ [17]. В отличие от обычного множественного анализа соответствий в КАС объясняется не вся присущая данным изменчивость, а лишь та ее часть, которая задается набором инструментальных переменных, — как в регрессионном анализе. В качестве последних в нашем случае выступали время с момента ожога и его локализация.

В ходе анализа было получено 5 канонических осей, из которых статистически значимыми были только первые две размерности (р=0,0002 и р=0,0003 соответственно). Они почти целиком объясняли изменчивость (в терминологии КАС — инерцию, в %) встречаемости микроорганизмов в ранах, обусловленную временем и локализацией: 67,8+23,7=91,5. На рис. 2 представлена

Первая ось объясняла 67,8% инерции набора данных по встречаемости микроорганизмов и обобщала динамику изменения микробного пейзажа раны во времени. По проекциям координат микроорганизмов на ось 1 видно, что первичные контаминанты ран, характерные для нормальной микробиоты кожи (Staphylococcus saprophyticus и Staphylococcus epidermidis), в течение времени сменялись на представителей нормальной микробиоты кишечника (Escherichia coli и Proteus spp.). Проанализировав данные о чувствительности раневой микробиоты к антибиотикам, мы установили, что на смену микробного пейзажа ран в динамике ожоговой инфекции решающее значение оказывала антибиотикотерапия. Рост первичных контаминантов ран, относящихся к грамположительной микробиоте кожи (S. saprophyticus и S. epidermidis), эффективно подавляли β-лактамные антибиотики, использующиеся в ожоговом отделении в качестве стартовой терапии: все выделенные из ожоговых ран в течение первых дней госпитализации штаммы S. saprophyticus и S. epidermidis были чувствительны к цефоперазону/сульбактаму и цефепиму — 91,7% (95% ДИ 84,3—98,4), ампициллину — 93,2% (95% ДИ 86,1—100) к амоксициллину/клавуланату. Однако указанные антибиотики были неэффективны в отношении энтеробактерий, высевающихся из ожоговых ран через 1нед госпитализации. Использованные фенотипические методы детекции маркеров антибиотикорезистентности позволили установить у всех исследованных раневых изолятов Klebsiella pneumoniae и E. coli наличие β-лактамаз расширенного спектра, обеспечивающих бактериям устойчивость ко всем β-лактамам, кроме азтреонама. Смена грамположительной микробиоты на грамотрицательную и увеличение доли антибиотикорезистентных энтеробактерий среди возбудителей раневой ожоговой инфекции отмечены и другими исследователями [18].

Вторая ось (см. рис. 2) объясняла 23,7% инерции. Вдоль нее проявились различия в микробном пейзаже ран головы и туловища, с одной стороны, и ран конечностей — с другой. Видно, что векторы головы и туловища практически совпадали, что указывает на очень сходный характер микробной контаминации ожогов этих частей тела. В целом в ожоговых ранах головы и туловища было больше S. saprophyticus, E. coli, Proteus spp., K. pneumoniae и, напротив, практически отсутствовал S. epidermidis, более характерный для ожогов верхних конечностей. На присутствие в ранах S. aureus, P. aeruginosa и A. baumannii время и локализация ожога влияли очень слабо, что видно по их расположению вблизи точки начала координат. Этот факт можно объяснить тем, что для S. aureus, P. aeruginosa и A. baumannii характерно госпитальное происхождение, поэтому локус ожога для них не имеет значения.

Выявление ассоциаций микроорганизмов в ожоговых ранах. Так как из ран часто выделяются смешанные популяции микроорганизмов, далее мы попытались обнаружить устойчивые ассоциации микроорганизмов в ожоговых ранах с использованием методов микробной экологии — путем расчета такого показателя экологической общности, как C_J. Он вычисляется по четырехпольной таблице частот, входами в которую являются наличие и отсутствие первого и второго видов, а частоты представляют собой количество соответствующих местообитаний (в нашем случае штаммов). В отличие от других популярных коэффициентов ассоциации для таблиц 2×2 (Крамера, Чупрова, сопряженности Пирсона, фи, Юла и др.) C_J не учитывает в расчетах ячейку отсутствия обоих видов: он представляет собой отношение числа проб, содержащих одновременно два вида, к числу проб, содержащих хотя бы один из них. Таким образом, исключается ситуация, когда виды могут оказаться сходными только потому, что не встречаются в большинстве местообитаний. Коэффициент C_J изменяется от 0 (отсутствие совместной встречаемости организмов) до 1 (исключительно совместная встречаемость).

С помощью C_J удалось выявить только две статистически значимые ассоциации: A. baumannii — S. aureus (C_J=0,442; n=95; р=0,001) и S. aureus — P. aeruginosa (C_J=0,430; n=93; р=0,050). Слабую ассоциацию демонстрировали также A. baumannii и P. aeruginosa (C_J =0,300; n=100; р>0,05). Таким образом, результаты поиска ассоциаций оказались близки как к результатам простого анализа встречаемости, так и к КАС: в ожоговых ранах выявлены ассоциации, образованные различными сочетаниями трех видов бактерий: S. aureus, A. baumannii и P. aeruginosa.

Анализ динамики выделения из ожоговых ран приоритетных возбудителей ожоговой инфекции. Учитывая, что КАС не выявил зависимости частоты выделения трех доминирующих видов бактерий от времени, прошедшего с момента травмы, был проведен регрессионный анализ с использованием GAM, которая является непараметрическим расширением обобщенных линейных моделей и обычно используется в случаях, когда тип зависимости заранее не известен. GAM имеет ряд статистических преимуществ перед другими способами сглаживания нелинейных зависимостей, включая возможность учета природы данных (разные семейства распределений) и относительно небольшую ошибку модели при ее сложности. Были использованы модели для биномиального отклика (наличие или отсутствие микроорганизма), подгонка которых проведена с использованием пакета mgcv для программно-статистической среды R [22].

На рис. 3 представлены

Изучение динамики заселения ожоговой раны неферментирующими грамотрицательными бактериями показало, что для A. baumannii была характерна нелинейная динамика: к 20-му дню частота выделения этого вида в ране резко снижалась, однако после 20-го дня госпитализации начинался новый подъем индикации данного вида. Возможно, этот факт связан с конкурентными взаимоотношениями A. baumannii с S. aureus, встречаемость которой на 20-й день госпитализации была максимальной. В свою очередь P. aeruginosa колонизировала раны после 10—14-х суток госпитализации, после 2—3 нед ее индикация в ранах была максимальной и практически выходила на плато. Изучение чувствительности к антибиотикам у P. аeruginosa и A. baumannii, выделяющихся из ожоговых ран после 2 нед госпитализации, подтвердило их полирезистентность. Способность продуцировать металло-β-лактамазы (МБЛ) была выявлена у 89,7% (95% ДИ 80,4—98,1) P. аeruginosa, поэтому при лечении инфекций, вызванных такими штаммами, следует исключить все β-лактамы и карбапенемы. Резистентность P. аeruginosa к амикацину и ципрофлоксацину также сохранялась на высоком уровне — 90,6% (95% ДИ 87,4—98,1) и 89,7% (95% ДИ 81,0—96,1) соответственно. Все изоляты A. baumannii, выделенные из ран после 2-недельной госпитализации, были устойчивы к ципрофлоксацину и амикацину, наличие МБЛ отмечено в 85,3% случаев (95% ДИ 78,6—92,8).

На фоне антимикробной терапии в естественной поливидовой биопленке на поверхности ожоговой раны происходит смена видового состава возбудителей инфекции. Результаты проведенного исследования демонстрируют возможность использования методов описательной статистики, количественных методов микробной экологии и поиска зависимостей для изучения динамики микробного пейзажа.

Благодарности. Авторы статьи выражают благодарность заведующей кафедрой микробиологии, иммунологии и общей биологии, декану биологического факультета ФГБОУ ВО «ЧелГУ» А.Л. Бурмистровой и заведующей лабораторией МБУЗ ГКБ № 6 Челябинска Л.И. Бахаревой за помощь в организации работы и выполнении лабораторных исследований.

Автор, ответственный за переписку: С.В. Андреева — https://orcid.org/0000-0002-1396-8681; е-mail: andreeva_sv81 @mail.ru

Corresponding author: S.V. Andreeva — https://orcid.org/0000-0002-1396-8681; е-mail:andreeva_sv81 @mail.ru