Галектин-3 (Гал-3) принадлежит к семейству галектинов — белков, обладающих способностью связывать галактозиды [1]. У человека он имеет молекулярную массу 26 кДа, структурно отличается от других белков семейства галектинов [2]. Гал-3 принимает участие в таких процессах, как адгезия, апоптоз и ангиогенез [3]. В норме его концентрация в сыворотке крови здорового человека составляет в среднем 0—3 нг/мл [4].

Известно, что Гал-3 участвует в развитии таких заболеваний, как рак, фиброз и сердечная недостаточность [3, 5, 6]. Наиболее часто высокие концентрации Гал-3 в сыворотке крови пациентов встречаются при злокачественных опухолях предстательной, молочной и щитовидной желез, причем опухоль, вырабатывающая избыточное количество Гал-3, характеризуется усиленным кровоснабжением и легко метастазирует [7].

Кроме того, Гал-3 способен активировать макрофаги по альтернативному пути, в результате чего они экспрессируют аргиназу 1 — фермент, необходимый для синтеза полиаминов и пролина из аргинина. Пролин и полиамины используются в процессе клеточной пролиферации, в том числе фибробластов, синтезирующих коллаген. Таким образом, в норме воспалительный процесс завершается регенерацией ткани, а при хроническом воспалении ведет к фиброзу пораженного органа [8].

На данный момент ряд коммерческих компаний («Abcam», «Merck», «Thermo Fisher» и др.) предлагает поликлональные и моноклональные антитела к Гал-3 для использования в таких методах, как белковый иммуноблот, проточная цитометрия, иммуногистохимическое окрашивание и др.

Компания «Bender MedSystems» производит набор для обнаружения Гал-3 в биологических жидкостях методом иммуноферментного анализа. Его аналитическая чувствительность составляет 0,12 нг/мл, набор рассчитан на 96 измерений, однако в клинической практике его не используют, так как он предназначен только для научных исследований. Аналогичных отечественных наборов на данный момент не существует. Между тем растет количество данных о способах диагностики тяжести состояния и терапевтических перспектив по уровню Гал-3 в сыворотке крови человека.

Цель настоящей работы — разработка эффективных отечественных моноклональных рекомбинантных антител, специфичных к Гал-3, для диагностических и исследовательских целей.

Создание рекомбинантных Гал-3 макаки и человека. Гены полноразмерного Гал-3 были клонированы в вектор pET28b (рис. 1).

Экспрессия и очистка рекомбинантного Гал-3. Клетки E. coli штамма DE3 RIL трансформировали при помощи метода электропорации плазмидой с геном Гал-3 и растили на селективной агаризованной среде, содержащей канамицин. Экспрессия гена проходила под контролем lac-промотора, а в качестве индуктора экспрессии использовали изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид («Thermo Fisher Scientific», США) в концентрации 1 нМ. Бактериальные клетки осаждали при 3000 g, ресуспендировали в 20 мл буфера для лизиса (300 мМ NaCl, 25 мМ NaP, 8 мМ меркаптоэтанола, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида) и разрушали с помощью френч-пресса. Полученный лизат осветляли путем центрифугирования при 9000 g в течение 30 мин. Рекомбинантный Гал-3 очищали методом аффинной хроматографии на лактозил-сефарозе, как описано ранее [9].

Аффинная селекция Fab-фрагментов антител из фаговых библиотек. Селекцию Fab-фрагментов антител методом фагового дисплея проводили согласно стандартному протоколу [10] с использованием синтетических фаговых библиотек, полученных в нашей лаборатории ранее. При селекции использовали понижающиеся концентрации Гал-3: 5, 3 и 1 мкг/мл для первого, второго и третьего раундов отбора соответственно. Гал-3 сорбировали на стенках иммунопробирки (Greiner bio-one, medium binding) в фосфатно-солевом буфере (PBS) с меркаптаэтанолом для предотвращения димеризации молекул через неспаренный остаток цистеина. Для получения кросс-реактивных антител к Гал-3 человека и макаки (с целью расширения возможностей доклинических испытаний на животных) в первом и третьем раундах отбора использовали Гал-3 человека, а во втором — обезьяний белок. Для блокировки участков пластика, не занятого Гал-3, использовали следующие растворы: Super Block («Thermo Fisher Scientific», США), 5% растворы белков молока и бычьего сывороточного альбумина в PBST (PBS с 0,1% твин-20) для первого, второго и третьего раундов соответственно.

Экспрессия полноразмерных IgG1 в клетках линии CHO-1. Уникальные последовательности Fab-фрагментов конвертировали в полноразмерные IgG1 человека для последующей экспрессии в эукариотических клетках CHO-1 (Chinese hamster ovary cell line — клеточная линия ооцитов китайского хомяка). Ооциты китайского хомяка хранили при температуре жидкого азота в сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида в качестве криопротектора. После разморозки клеточный осадок ресуспендировали в равновесной смеси сред CHO-S-SFMII, Free Style CHO («Gibco», США) и растили в течение 1сут при мягком перемешивании в CO₂-инкубаторе Heracell («Thermo Fisher Scientific», США). Количество жизнеспособных клеток оценивали окрашиванием красителем трипановым синим. Когда доля живых клеток достигала 90%, проводили трансфекцию клеток CHO-1 по стандартному протоколу [11].

Определение сродства антител к Гал-3 методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Измерения методом ППР проводили при 25 °C на приборе Bio-Rad ProteOn XPR36 с использованием чипа ProteOn GLH.

Эпитопное картирование антител к Гал-3. Участки связывания антител с Гал-3 определяли при помощи иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием пар антител, среди которых один из участников был мечен биотином. По наличию позитивного сигнала делали вывод о том, что исследованная пара антител связывается с разными эпитопами Гал-3, по отсутствию — что участки связывания одинаковы или частично перекрываются.

Рекомбинантным способом были успешно получены Гал-3 макаки и человека с молекулярной массой 27 и 26 кДа соответственно. Наличие незначительного протеолиза не повлияло на результаты дальнейших экспериментов. Корректность антигена (Гал-3) подтвердили в иммуноблоте с использованием коммерческих мышиных антител против Гал-3 человека («BioLegend», США) (рис. 2).

В результате селекции методом фагового дисплея были отобраны четыре антитела. Их аффинность определили с помощью ППР по равновесной константе диссоциации комплекса антитело — Гал-3, для полученных антител она составляла от 0,12 до 9 нМ (табл. 1).

Для создания тест-системы, основанной на методе ИФА, необходимо иметь два антитела, связывающихся с разными эпитопами антигена, так как одно (захватывающее) антитело сорбируется на пластик и связывает антиген из анализируемого раствора, а второе (покровное) — конъюгировано с ферментной меткой и должно связаться с антигеном таким образом, чтобы не нарушить уже сформированный комплекс. Для выявления таких пар антител было проанализировано двенадцать их сочетаний. Отрицательным контролем выступал опыт, в котором одно и то же антитело (В3) и сорбировалось на пластик, и использовалось в качестве покровного. Возможность одновременного связывания с антигеном показали всего две пары антител — С4—В3 и С7—В3. Поскольку аффинность антитела С4 выше, чем С7, для разработки системы использовали пару С4—В3.

Чтобы избежать снижения чувствительности, вызванного низкой аффинностью антитела В3, было принято решение использовать его в качестве захватывающего, а основную часть эксперимента проводить в растворе. Таким образом, в объеме буфера PBST, необходимом для опыта, сначала растворяли конъюгат, представляющий собой стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (strep-HRP, «Thermo Fisher Scientific», США), затем добавляли к нему биотинилированное антитело С4 и этим раствором разводили образцы Гал-3. После предварительной инкубации в течение 1 ч исследуемые образцы вносили в лунки согласно схеме эксперимента. Такое решение повышало чувствительность метода и уменьшало время, затрачиваемое на иммуноферментный анализ, в 2 раза (с 6 до 3 ч).

Были проведены две независимые серии из пяти измерений, в которых концентрацию Гал-3 изменяли от 500 до 0,4 нг/мл. Во избежание случайных ошибок каждую точку измеряли в двух повторениях.

Нами была успешно построена стандартная кривая зависимости оптической плотности раствора от концентрации антигена (рис. 3, а).

C использованием коэффициентов из уравнения зависимости оптической плотности от концентрации аналита (см. рис. 3, б) вычисляли содержание Гал-3 в исследуемом образце по следующей формуле:

где С – измеренная концентрация Гал-3; OD — оптическая плотность образца.

Результаты расчетов представлены в табл. 2.

В настоящей работе методом фагового дисплея впервые получены рекомбинантные человеческие кросс-реактивные антитела к Гал-3. Аффинность антител лежит в пико- и наномолярном диапазоне констант диссоциации, что открывает множество путей их использования. Такие антитела могут быть полезны в иммуногистохимическом окрашивании срезов тканей, иммунопреципитации, иммуноблоте, проточной цитометрии и ИФА при количественном определении Гал-3 в сыворотке крови для диагностических или исследовательских целей.

Из 6 полученных антител 2 (С4 и В3) показали способность связываться с разными эпитопами Гал-3, что позволяет разработать систему для ИФА по типу «сэндвич».

Создание готового набора для определения концентрации Гал-3 в биологических жидкостях потребует множества дополнительных экспериментов и подбора условий хранения реагентов. Пока чувствительность описанной тест-системы лежит в диапазоне, превышающем физиологические концентрации Гал-3 в сыворотке крови здорового человека. Однако с помощью таких подходов, как иммунная полимеразно-цепная реакция [12] и иммуномагнитные биосенсоры [13], можно было бы добиться необходимого уровня аналитической чувствительности системы. Поэтому мы считаем полученные антитела перспективными с точки зрения разработки диагностической системы как для исследовательского, так и для клинического применения.

Работа выполнена при поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в рамках программы УМНИК (договор № 0032932).

Автор, ответственный за переписку: Е.В. Павлова — https://orcid.org/0000-0001-9681-4831; e-mail: catarios-ksu@mail.ru

Corresponding author: E.V. Pavlova — https://orcid.org/0000-0001-9681-4831; e-mail: catarios-ksu@mail.ru