Важной проблемой современной урологии, гинекологии и репродуктивной медицины является бесплодный брак [1]. Среди причин роста числа бесплодных браков особая роль принадлежит так называемому «мужскому» фактору, заключающемуся в резком снижении фертильности эякулята [2—5].

Показателями фертильности спермы являются характеристики его клеточного состава, в частности, концентрация, подвижность и морфологические особенности сперматозоидов. Состав семенной плазмы также оказывает значительное влияние на фертильность эякулята. В последние годы возрос интерес к исследованию различных белковых компонентов эякулята, в том числе традиционно исследуемых в сыворотке крови [6—9]. Примером такого белка является васкулоэндотелиальный фактор роста (ВЭФР, от англ. Vascular Endothelial Growth Factor — VEGF), представляющий собой один из наиболее мощных факторов роста [10]. Этот белок продуцируется различными типами клеток, такими как макрофаги, эндотелиоциты, гладкомышечные клетки, он активно участвует в процессах васкулогенеза (в образовании сосудистой системы в эмбриональном периоде) и ангиогенеза (в формировании новых сосудов при уже существующей сосудистой сети).

В отечественной литературе имеются публикации [6, 9], посвященные исследованию индивидуальных белков в семенной плазме. Однако отмечается явный дефицит российских исследований, изучающих содержание ВЭФР в эякуляте здоровых и пациентов с различными заболеваниями мужской репродуктивной системы. Так, используя поисковую систему источников по базе Научной электронной библиотеки (https://elibrary.ru) по сочетанию ключевых слов «сперма/семенная плазма, ВЭФР», «сперма/семенная плазма, васкулоэндотелиальный фактор роста» и «сперма/семенная плазма, VEGF», не было обнаружено ни одной публикации. Литературные источники по интересующей теме в Библиотеке национального центра биотехнологической информации (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) найти можно, однако их количество ограничено лишь десятками публикаций [11, 12]. Для сравнения: количество публикаций, посвященных анализу уровня ВЭФР в крови и тканях, исчисляется десятками тысяч. Все это обусловливает интерес к исследованию ВЭФР в сперме при различных заболеваниях.

Цель исследования — изучение содержания ВЭФР в эякуляте здоровых мужчин и мужчин со снижением концентрации сперматозоидов.

Выполнено одномоментное обсервационное исследование «случай—контроль» с соблюдением этических принципов, изложенных в Хельсинкской декларации Всемирной организации здравоохранения (версия 2008 г.). Проведение исследования одобрено этическим комитетом Пермского государственного медицинского университета им. акад. Е.А. Вагнера.

Обследованы 64 мужчины среднего возраста (от 26 до 54 лет), обратившиеся в медицинские учреждения Перми по поводу диагностики и лечения бесплодного брака. Все пациенты предоставили письменное информированное согласие на использование биоматериала для настоящего исследования. Для исключения влияния слизи на результаты исследования нами использован более строгий критерий для вязких образцов с повышенным содержанием слизи. Вязким эякулятом считали образцы с результатами более 5 мм (по тесту отрыва нити), а не меньше 20 мм, как это приводится в последних руководствах [4].

Пациенты были разделены на три группы (табл. 1). Основную группу (1-я группа) составили 16 пациентов с отсутствием сперматозоидов (азооспермией). В группу сравнения (2-я группа) вошли 24 пациента с олигозооастеноспермией (концентрация сперматозоидов ниже 15 млн/мл и содержанием подвижных клеток менее 40%) [5]. В контрольную группу (3-я группа) включили 24 здоровых мужчины, чьи образцы эякулята характеризовались нормальным содержанием, подвижностью и морфологией сперматозоидов [4, 5]. Группы были сопоставимы по возрасту.

Исследовали образцы семенной плазмы и сыворотки крови. Каждый из этих образцов отделяли путем центрифугирования при 2000 g (3000 об/мин) в течение 15—20 мин на центрифуге СМ-6М (ELMI, Латвия). Аликвоты супернатантов биологического материала переносили в пробирки Эппендорф и хранили до исследования при температуре –40 °С.

Концентрацию ВЭФР определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора реактивов VEGF—ИФА—БЕСТ (А 8784) (ЗАО «Вектор-Бест», Россия).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ Statistica v. 7 (Stat Soft Inc., США). Для каждого массива данных рассчитывали параметры описательной статистики: среднее арифметическое значение (М), стандартное отклонение (SD), а также медиану (Me) и интерквартильный диапазон [25%; 75%]. С помощью критерия Шапиро—Уилка оценивали распределение результатов внутри выборки. Для сравнения концентрации ВЭФР в парных образцах сыворотки крови и семенной плазмы использовали критерий Уилкоксона. Для сравнения трех независимых выборок применяли H-критерий Краскела—Уоллиса с последующим попарным сравнением. Количественную оценку линейной связи между двумя случайными величинами оценивали с применением коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r) и построения графика линейной регрессии.

За максимально приемлемую вероятность ошибки первого рода (р) принимали величину уровня статистической значимости, равную или меньшую 0,05.

У всех пациентов ВЭФР был обнаружен как в сыворотке крови, так и в образцах семенной плазмы. Семенная плазма характеризовалась необычно высоким содержанием ВЭФР. Его средняя концентрация в образцах неразведенной семенной плазмы составила 3346±129,6 (3361 [3250; 3461,5] пг/мл, в сыворотке крови она была в 16,24 раза меньше —206±99,1 (194 [112,5; 295,5]) пг/мл (р<0,05). Во всех исследованных неразбавленных образцах эякулята концентрация ВЭФР превысила предел линейности тест-системы (2000 пг/мл). К сожалению, отсутствие на момент выполнения исследования доступных тест-систем не позволило провести повторное исследование с разведенными образцами эякулята, поэтому результаты являются предварительными.

Содержание (Ме) ВЭФР у пациентов основной группы в семенной плазме было 13,7 раза больше, чем в сыворотке крови (при оценке по критерию Уилкоксона — р=0,000438), в группе сравнения — в 15,98 раза (р=0,000018), в контрольной группе — в 18,82 раза (рис. 1).

При оценке значений концентрации ВЭФР в семенной плазме между тремя группами по H-критерию Краскела—Уоллиса были обнаружены статистически значимые различия (р=0,0076) (табл. 2).

При оценке корреляционных связей между уровнем ВЭФР в сыворотке крови и семенной плазме статистически значимой связи не выявили, коэффициент ранговой корреляции Спирмена для всех результатов исследования составил r= –0,027869 (p=0,826959) (рис. 2).

В семенной плазме присутствуют разные белки [9, 13]. Ряд цитокинов, факторов роста и других белков участвует в нормальном функционировании репродуктивной системы мужского организма [14—16]. Для некоторых соединений, которые были исследованы раньше, например, прокальцитонина, продемонстрировано неожиданно высокое их содержание в семенной плазме [9]. Аналогично высокое содержание в эякуляте обнаружено и для ВЭФР, который является одним из наиболее изученных представителей семейства белков — факторов роста, регулирующих пролиферацию клеток эндотелия и участвующих в образовании сосудистой сети.

Обнаруживаемый в биологических жидкостях человеческого организма ВЭФР имеет различное происхождение. В ряд биологических жидкостей, например, в желчь или спинномозговую жидкость, он может поступать из сыворотки крови в процессе экссудации. Однако необычно высокое его содержание в семенной плазме не позволяет считать этот механизм основным источником для ВЭФР эякулята. Вероятно, в семенную плазму ВЭФР активно продуцируется органами мужской репродуктивной системы, а не проникает из крови пассивно в результате диффузии по градиенту концентрации.

В литературе [17, 18] приводятся сведения о важной роли ВЭФР в дифференцировке гонад мужского организма, в частности процесса васкуляризации. Высокое содержание ВЭФР в сперме указывает на возможные физиологические функции этого белка.

Одной из возможных функций, по мнению авторов настоящего исследования, может являться подготовка клеток эндометрия женского организма для предстоящей имплантации яйцеклетки после оплодотворения.

В литературе приводятся сведения о важной роли ВЭФР в женской репродуктивной системе [19, 20]. Более низкое содержание этого белка в семенной плазме мужчин с азооспермией может быть обусловлено нарушением формирования спермы, в том числе угнетением продукции ВЭФР органами мужского урогенитального тракта. При этом вероятным местом продукции ВЭФР могут являться либо предстательная железа, либо семенные пузырьки, т. е. органы, секреты которых составляют значительную долю эякулята, в частности семенной плазмы.

1. Семенная плазма мужчин характеризуется необыкновенно высоким содержанием ВЭФР, превосходящим более чем в 10 раз концентрацию этого белка в сыворотке крови. Этот факт следует учитывать при планировании исследований и при необходимости выполнять предварительное разведение семенной плазмы.

2. Высокая концентрация ВЭФР в семенной плазме и отсутствие зависимости от концентрации этого белка в сыворотке крови указывают на местную продукцию ВЭФР эякулята органами репродуктивной системы мужчин.

3. Нарушение фертильности эякулята, обусловленное снижением количества сперматозоидов, сопровождается уменьшением концентрации ВЭФР в семенной плазме, но не в сыворотке крови.

4. Полученные предварительные данные указывают на необходимость проведения дальнейших исследований, в том числе для уточнения роли различных органов репродуктивной системы мужчин в продукции ВЭФР, а также изучения его вероятной роли в процессах репродукции в мужском и женском организмах.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Соснин Д.Ю. — https://orcid.org/0000-0002-1232-8826

Галькович КР. https://orcid.org/0000-0001-9039-7117