Определение иммунофенотипа опухолевых клеток методом многоцветной проточной цитометрии является одним из основных диагностических инструментов при острых лейкозах (ОЛ) у детей и взрослых [1—2]. Различия в антигенном профиле лейкемических бластов позволяют не только уточнить линейную принадлежность ОЛ, но и выбрать наиболее подходящую терапевтическую схему для достижения оптимального результата лечения. В связи с тем, что данные иммунофенотипирования (ИФТ) используются для стратификации пациентов в рамках крупных многоцентровых исследований по терапии ОЛ, необходимой является максимально возможная гармонизация этого метода диагностики [3—4]. При проведенной нами ранее внешней оценке качества диагностики острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) методом проточной цитометрии [5—6] было обнаружено, что в российских лабораториях, проводящих иммунофенотипирование, существуют совершенно разные подходы к пробоподготовке [5], настройкам приборов [5], анализу и интерпретации полученных результатов [6]. В настоящее время российскими и зарубежными исследовательскими группами разрабатываются и внедряются относительно стандартизованные подходы к диагностическому иммунофенотипированию ОЛ [7—9]. Четкие рекомендации по формулировке заключения по результатам проведения этого диагностического исследования немногочисленны и носят рекомендательный характер. Отсутствие таких стандартов осложняет сопоставление результатов, полученных в лабораториях разного уровня. Различный формат заключений может приводить к проблемам в клинической интерпретации результатов ИФТ бластных клеток при ОЛ, что, в свою очередь, может повлечь за собой ошибки в постановке окончательного диагноза.
Несмотря на то что заключение по результату лабораторного исследования не является диагнозом, при некоторых онкогематологических заболеваниях иммунофенотипирование стало ключевым диагностическим методом. Примером тому является ОЛЛ [1—2]. Результаты иммунофенотипирования при ОЛЛ играют главную роль в постановке диагноза и непосредственно влияют на выбор терапии [1—2]. При остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) роль иммунофенотипирования существенно ниже, однако дифференциальная диагностика с другими опухолями лимфоидной и кроветворной систем (прежде всего ОЛЛ и лейкемизации лимфом) во многом базируется на результатах ИФТ. Несмотря на формальную возможность отличия результата цитометрического исследования от итогового диагноза, на враче КЛД, формулирующем заключение по проведенному ИФТ, лежит существенная ответственность за правильный диагноз и дальнейшую судьбу пациента. Вследствие этого заключение по ИФТ при ОЛ должно быть максимально однозначным и понятным для лечащего врача, а врач КЛД, в свою очередь, становится крайне важным участником диагностического процесса.
Заключение по результатам иммунофенотипирования опухолевых клеток может быть основано только на результатах цитометрического исследования. Использование для интерпретации определенного антигенного профиля бластов результатов других исследований категорически недопустимо. Итоговый синтез лабораторной и клинической информации проводит лечащий врач при участии лабораторных специалистов, однако сам по себе результат лабораторного исследования не может зависеть от результатов применения других диагностических технологий. Заключения по каждому исследованию должны выписываться на отдельном бланке. Если заключение оформляется по результатам двух и более примененных методов, то на самом бланке должно быть написано два отдельных заключения с указанием технологии, применение которой привело к каждому из результатов.
Заключение по результатам диагностического ИФТ при ОЛ должно содержать минимальное количество рассуждений и описательных фраз, должно быть кратким и емким. Основными составными частями заключения являются:
— краткая информация о пациенте и исследуемом образце, включая дату взятия материала и дату проведения исследования;
— относительное количество опухолевых клеток от всех ядросодержащих клеток (ЯСК)/миелокариоцитов костного мозга, по данным проточной цитометрии;
— качественное ИЛИ количественное, ИЛИ полуколичественное описание экспрессии антигенов опухолевыми клетками;
— итоговый иммунофенотип опухолевых клеток;
— формулировка иммуноподварианта болезни в соответсвии с классификационной категорией;
— комментарии в случае необходимости.
Информация о пациенте и исследуемом образце
Информация о пациенте и исследуемом образце должна обязательно включать дату взятия материала, тип материала и дату проведения исследования, а также описание полученной ранее терапии, прежде всего стероидными гормонами (если таковые данные имеются). В целом следует указать любую информацию об образце и воздействиях на пациента, которая уточняет возможные изменения иммунофенотипа опухолевых клеток.
Относительное количество опухолевых клеток
Процентное содержание лейкемических бластов в костном мозге следует указывать только по данным проточной цитометрии. Большее или меньшее количество бластов, определяемое цитологически, никакого значения не имеет, так как может быть легко объяснено как техническими, так и биологическими причинами. При разном количестве опухолевых клеток, выявляемом в разных пробах у одного и того же пациента, в итоговое заключение следует выносить то количество, которое получено с использованием комбинации антител, позволяющее выделить бласты наиболее точно.
Описание общей картины костного мозга и клеточного состава неопухолевых популяций может быть внесено в заключение в виде отдельного раздела, но при наличии соответствующего запроса, однако в заключение по иммунофенотипированию опухолевых клеток ни в каком случае не должно быть включено, поскольку описание антигенного профиля сразу нескольких популяций, и только одна из них является опухолевой, что может привести к неправильной интерпретации результата исследования лечащим врачом.
При наличии в костном мозге нескольких, четко идентифицируемых методом ПЦ, популяций опухолевых клеток, их раздельное описание приемлемо далеко не во всех случаях. Так, при ОМЛ вследствие «созревания» лейкемических бластов нередко может наблюдаться несколько субпопуляций опухолевых клеток, различающихся иммунофенотипически и цитоморфологически. Однако раздельное описание опухолевого пула в данном случае не приведет к изменению итогового заключения о миелоидной природе опухолевых клеток, но может ввести в заблуждение лечащего врача.
Раздельное описание нескольких популяций бластов должно выполняться только в том случае, если указанные популяции относятся к разным линиям гемопоэза, или если как минимум одна из них соответствует острому лейкозу со смешанным фенотипом (ОЛСФ). В том случае, если меньшая популяция составляет более 10% всех ЯСК (миелокариоцитов) костного мозга, иммунофенотип обеих субпопуляций описывается одинаково подробно. Если доля меньшей составляющей лейкемического пула не превышает 10%, но она определяется в ЛЮБОМ количестве (даже на уровне минимальной остаточной болезни (МОБ)), то подробно описывается антигенный профиль большей популяции, но после основной части заключения делается уточнение, что выявляется минорная популяция клеток, возможно, опухолевых, с указанием их процента от ЯСК, суммарного иммунофенотипа и, по возможности, линейной принадлежности.
Описание экспрессии антигенов
Формат описания экспрессии каждого отдельного антигена может варьировать в зависимости от принятых в конкретной лаборатории подходов. Тем не менее существует несколько наиболее распространенных вариантов [7—10].
Наиболее часто встречающимся в лабораториях РФ и постсоветского пространства является указание процентного содержания позитивных опухолевых клеток среди всей лейкемической популяции. Несмотря на то что подобное описание зачастую не позволяет составить более или менее точное представление о биологии опухолевых клеток и субпопуляционной структуре бластной популяции, оно является наиболее понятным и однозначно воспринимаемым для клинических врачей. В то же время такой вариант представления данных наиболее пригоден для гармонизации ИФТ в рамках многоцентровых исследований, поскольку результат в данном случае зависит практически только от корректного определения границ негативности/позитивности при проведении проточной цитометрии и аккуратности выбора области анализа целевой популяции бластов. При этом влияние настроек прибора существенно ниже, а различиями в используемых сочетаниях антител и флуорохромов в большинстве случаев можно пренебречь. Недостатком указания количества позитивных клеток является возможная вариабельность значений, близких к пороговым уровням, особенно при использовании различающихся антител и их сочетаний с флуорохромами.
Определение интенсивности экспрессии антигенов по уровню флуоресценции на шкале проточного цитометра [7], предлагаемое крупными исследовательскими группами, несет больше биологической информации об опухолевых клетках, однако напрямую зависит не только от сочетаний антител и флуорохромов, но и от настроек прибора и стабильности его работы. Кроме того, такая система описания результата проведения иммунофенотипирования крайне субъективна.
Определение интенсивности экспрессии по «сдвигу» пика флуоресценции относительно негативной контрольной популяции [8] несколько более обосновано, особенно при наличии четко сформулированных критериев для определения степени экспрессии [8]. Но и в этом случае гармонизация исследования может быть затруднена, как и интерпретация заключения при постановке окончательного диагноза.
Кроме прочего, даже при использовании интенсивности экспрессии антигенов как основного описываемого параметра, все равно описание иммунофенотипа опухолевой популяции начинается с превышения количества позитивных по данному антигену клеток над каким-либо пороговым уровнем [8—9].
Таким образом, наиболее приемлемым следует признать описание процентного содержания позитивных по исследуемому антигену опухолевых клеток среди всей бластной популяции.
Описание экспрессии антигенов сразу в нескольких форматах (например, качественном (есть/нет) и количественном (% позитивных клеток)) по всем изученным параметрам сделает заключение слишком громоздким и плохо воспринимаемым. Однако использование сочетания количественного (для большинства антигенов) и качественного по отдельным маркерам описания возможно.
Описание итогового иммунофенотипа
В качестве суммарного иммунофенотипа указывается сочетание антигенов, экспрессия которых определяется на более чем 20% опухолевых клеток в случае мембранного окрашивания, и более чем 10% — при окрашивании внутриклеточном [11]. Указание в данной графе антигенов, экспрессия которых не выявлена, необходимо для отдельных маркеров, принципиальных в отношении установления ИФТ-варианта болезни (CD10, CD34, HLA-DR и т. д.). Описанием же суммарного иммунофенотипа бластов можно пренебречь, если позитивность/негативность достаточно явно отражена в описании экспрессии антигенов, а также может быть сформулирована в тексте итогового заключения.
Классификация ОЛ
Итоговый ответ по проведенному иммунофенотипированию не может ограничиваться только описанием иммунофенотипа опухолевых клеток. Врач КЛД не должен перекладывать ответственность за интерпретацию антигенного профиля бластов на лечащего врача или других профильных специалистов. Для уточнения иммунофенотипической классификационной категории ОЛ использование результатов применения других диагностических технологий недопустимо. При этом данных грамотно проведенной проточной цитометрии вполне достаточно для того, чтобы классифицировать ОЛ в соответствии с принятыми классификациями. Основными на данный момент классификациями ОЛ являются система ВОЗ в редакции 2016 г. [12], но для ОЛЛ чаще всего используется адаптированный под каждую конкретную исследовательскую группу вариант классификации группы EGIL [8, 9, 11]. К тому же при проведении диагностического иммунофенотипирования учитываются различные аспекты из обеих основных систем, прежде всего на этапе определения линейности ОЛ.
Классификационные категории ОЛЛ хорошо известны и детально описаны [8, 9, 11]. Как для В-линейных, так и для Т-линейных ОЛЛ определение иммуноварианта базируется только на экспрессии перечисленных в классификации маркеров, в то время как определение других антигенов позволяет получить дополнительную информацию об опухолевых клетках, но не должно изменять определение классификационной группы [8, 9]. Так, для В-линейных ОЛЛ определение варианта (при верифицированном В-линейном ОЛЛ) основывается только на экспрессии CD10, а также легких и тяжелых цепей молекулы иммуноглобулина M (мембранной и внутриклеточной), а экспрессия таких антигенов, как CD34, CD20, CD45 и др. не должна учитываться в формулировании итогового заключения [8]. При этом следует помнить, что наиболее «зрелый» вариант В-линейного ОЛЛ (BIV по EGIL) не обязательно является лейкемическим эквивалентом лимфомы Беркитта, поэтому определяться должен только по наличию мембранной экспрессии молекулы иммуноглобулина [13].
При Т-линейных ОЛЛ классификация базируется на экспрессии CD1a, CD2, CD3, CD5 и Т-клеточных рецепторов αβ- или γδ-типа, но не TdT, CD34 и др. [8, 9].
При гетерогенной экспрессии классифицирующих антигенов, несмотря на очевидное наличие нескольких субпопуляций опухолевых клеток, не рекомендуется указывать несколько классификационных групп. Предпочтение отдается не большей субпопуляции, а той, которая имеет более «зрелый» иммунофенотип. Например, при экспрессии CD10 на 25% бластов и отсутствии мембранной и цитоплазматической экспрессии IgM должен быть установлен BII-вариант, несмотря на то, что подавляющее большинство клеток имеет фенотип BI-ОЛЛ. Исключение делается только для экспрессии CD1a [8]. Вариант TIII (кортикальный Т-ОЛЛ) устанавливается при наличии данного маркера на поверхности более 20% бластов, вне зависимости от других особенностей иммунофенотипа [8]. Однако в данном случае, исходя из биологических особенностей опухоли, может быть применено исключение и из другого, упомянутого выше, правила. При выраженной экспрессии Т-клеточных рецепторов и гетерогенной экспрессии CD1a итоговый вариант может быть сформулирован как TIII/TIV.
При остром миелоидном лейкозе роль иммунофенотипирования в точном классифицировании опухоли существенно меньше, чем при ОЛЛ. Только острый эритробластный и острый мегакариобластный лейкозы могут быть относительно точно определены по антигенному профилю опухолевых клеток [8]. Все остальные варианты должны быть обозначены просто как ОМЛ, без дальнейших уточнений.
Кроме классификационной категории в итоговом заключении необходимо указать коэкспрессию всех маркеров линий гемопоэза, отличных от линии опухолевой популяции, а также важных маркеров негемопоэтических клеток (например, NG2).
Кроме того, может быть отдельно указана экспрессия каких-либо антигенов, если это имеет клиническое, прогностическое значение или важно для риск-стратификации больных. Так, например, для пациентов с Т-линейными ОЛЛ, получающих терапию по протоколам группы «Москва—Берлин», при стратификации на группы риска учитывается наличие на мембране не только CD1a, но и сформированной молекулы Т-клеточного рецептора одного из двух типов. Соответственно, наличие или отсутствие этих антигенов также может быть отдельно вынесено в заключение, помимо основного подтипа ОЛЛ.
Возможные комментарии
Кроме указанной выше информации, в заключение могут быть внесены любые комментарии, касающиеся проведенного исследования, прежде всего его технической стороны. Например, может быть указано на низкую клеточность или плохое качество материала. Пространных рассуждений относительно биологических особенностей опухоли, косвенно базирующихся на данных иммунофенотипирования, в комментариях следует избегать. Любые размышления о наличии тех или иных молекулярно-генетических перестроек или соответствии ОЛ какой-либо морфологической категории (например, по FAB-классификации) могут формулироваться только в виде предположений.
Следует отметить, что конкретное иммунофенотипическое заключение не может быть сформулировано только в случае существенных технических сложностей, но не фенотипических особенностей опухоли. Даже при гетерогенном профиле экспрессии антигенов его итоговое описание должно заканчиваться сформулированным заключением. В том случае, когда по иммунофенотипу ОЛ не может быть отнесен ни в одну классификационную категорию, включая ОЛСФ, случай должен быть отнесен к острому неклассифицируемому лейкозу.
Если при исследовании костного мозга не было обнаружено опухолевых клеток, а выявленные бласты, с учетом оценки маркеров аберрантности, представляют собой нормальные клетки-предшественники, то в заключении должно быть указано, что данные о ОЛ в исследуемом материале отсутствуют. Эта ситуация кардинально отличается от той, когда опухолевые клетки обнаруживаются, но в количествах, не превышающих пороговый уровень для диагностики ОЛ (20%). В таком случае целесообразнее указание соответствия иммунофенотипа тому или иному варианту О.Л. Однако это может быть сделано только в случае, если данная популяция четко идентифицируется при помощи ИФТ. При этом важно то, что заключение иммунофенотипирования не является диагнозом, но лишь указывает на наличие в костном мозге точного количества опухолевых клеток с антигенным профилем, соответствующим определенному типу лейкоза. В тех случаях, когда бластов слишком мало для уточнения окончательного варианта ОЛ, это должно быть отражено в комментариях.
Заключение
Полноценная стандартизация диагностической технологии невозможна без формирования сопоставимых бланков выдачи результатов для разных лабораторий. В перспективе приведение формата ответа по результатам диагностического иммунофенотипирования ОЛ в соответствие с приведенными рекомендациями в будущем может позволить более успешно применять метод проточной цитометрии в диагностике ОЛ в рамках многоцентровых кооперативных терапевтических исследований.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
Сведения об авторах
Попов А.М. — https://orcid.org/0000-0002-0889-6986
Мовчан Л.В. — https://orcid.org/0000-0002-0441-0109
Вержбицкая Т.Ю. — https://orcid.org/0000-0001-9329-1828
Гривцова Л.Ю. — https://orcid.org/0000-0001-9103-9688
Луговская С.А. — https://orcid.org/0000-0002-6405-3422