Острые лейкозы (ОЛ) — гетерогенная группа клональных заболеваний системы кроветворной ткани, возникающих вследствие мутаций и (или) эпигенетических нарушений в кроветворных клетках, приводящих к блоку дифференцировки, апоптоза и бесконтрольной пролиферации. По морфологическим и иммунофенотипическим критериям атипичных «бластных» клеток ОЛ подразделяют на лимфоидные, миелоидные и (ОЛСФ).

Заболеваемость острыми миелоидными лейкозами (ОМЛ) в России составляет около 3—5 человек на 100 тыс. населения в год, причем среди населения старше 60 лет она резко возрастает и достигает 12—13 человек на 100 тыс. В среднем 5-летняя общая выживаемость пациентов в возрасте до 60 лет, по данным больших кооперативных исследовательских групп, составляет 35—50%, варьируя от 10 до 90% в зависимости от молекулярно-генетических особенностей лейкемии.

Острые лимфобластные лейкозы/острые лимфобластные лимфомы (далее — ОЛЛ) обусловлены онкогенной трансформацией клеток-предшественниц гемопоэза преимущественно лимфоидной направленности дифференцировки. ОЛЛ может встречаться у лиц любого возраста, при этом 60% пациентов с ОЛЛ моложе 20 лет. ОЛЛ является самой распространенной опухолью кроветворной ткани у детей, составляя 30% всех злокачественных опухолей детского возраста.

Классификация ОЛ, предложенная в 1976 г. (FAB), была основана исключительно на морфологических и цитохимических критериях и в связи с бурным накоплением знаний о молекулярно-генетических основах канцерогенеза в 2008 г. была пересмотрена и дополнена генетическими, иммунологическими и эпидемиологическими маркерами. В современную классификацию включены хромосомные транслокации, играющие важную роль в патогенезе заболеваний: BCR-ABL t(9;22)(q34;q11), TEL-AML1 t(12;21)(p33;q22), MLL-AF4 t(4;11)(q21;q23), E2A-PBX1 t(l;19)(q23;p33), MLL-ENL t(11;19)(q23;p33), SIL-TALI, PICALM-AF10 t(10;11)(p33;q14-21); RUNX1-RUNX1T1 t(8;21)(q22;q22.1), CBFB-MYH11 inv(16)(p13.1;q22) и t(16;16)(p13.1;q22), PML-RARA t(15;17) (q24;q21), MLLT3-MLL t(9;11)(p22;q23). В классификации ВОЗ 2016 г. было дополнительно уделено внимание мутациям генов KIT, FLT3-ITD, FLT3-TKD, NPM1, CEBPA, IDH1/IDH2, RUNX1, ASXL1 и TP53 — для которых доказаны важное прогностическое значение при отдельных вариантах ОЛ и возможность создания эффективных таргетных лекарственных препаратов [1, 2].

На сегодняшний день спектр выявленных молекулярно-генетических аномалий при ОЛ очень широк: от точечных однонуклеотидных замен до крупных хромосомных транслокаций. В табл. 1 представлена частота встречаемости отдельных молекулярно-генетических дефектов при различных формах ОЛ у детей и взрослых. Следует отметить, что опухолевые клетки с выявленными отдельными генетическими аномалиями могут появляться в кровотоке и исчезать в процессе клональной эволюции и давления со стороны терапевтических воздействий. Отдельные генетически детерминированные субклоны лейкозных клеток, существуя по отдельности или в сочетании, обусловливают индивидуальное течение заболевания. Поэтому для повышения эффективности диагностики и мониторинга течения ОЛ актуальным является обеспечение доступного и быстрого исследования, охватывающего максимальное количество известных генетических аномалий.

Таблица 1. Частота встречаемости отдельных молекулярно-генетических дефектов при ОЛ у детей и взрослых

В соответствии с обновленными российскими клиническими рекомендациями [3, 4], важное диагностическое значение при ОЛ имеют результаты классического морфологического и цитохимического исследования костного мозга, а также определение иммунофенотипа бластных клеток в аспирате костного мозга, пунктатах опухолевых образований лимфоузлов или венозной крови. Для дифференциальной диагностики В-линейных ОЛЛ наиболее важными маркерами являются CD19, CD20, CD22, CD24 и CD79a; для Т-линейных ОЛЛ такими маркерами являются CD1a, CD2, CD3 (мембранный и цитоплазматический), CD4, CD5, CD7 и CD8. К специфичным миелоид-ассоциированным антигенам относятся CD11b, CD11c, CD13, CD15, CD16, CD33, CD64, CD65, CD66b, MPO. Иммунофенотип бластных клеток при ОМЛ оценивается по экспрессии CD13, CD14, CD15, CD33, CD34, HLA-DR, CD41a, CD61, CD235a и характеризуется разнообразием профилей экспрессии поверхностных маркеров, обусловливающих тот или иной вариант фенотипа ОМЛ [4].

Исследование хромосомных транслокаций производится, как правило, классическим методом кариотипирования либо методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), а также при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). При этом следует отметить, что использование технологий ПЦР имеет неоспоримые преимущества в связи с более высокой чувствительностью, меньшей трудоемкостью и затратностью, хотя и требует особого внимания при выполнении анализа в связи с повышенным риском контаминации образцов.

Основное диагностическое значение при ОЛ на сегодняшний день в реальной практике имеет морфологическое исследование костного мозга, которое выполняется по направлению специалиста-гематолога. Однако следует отметить, что первичная диагностика онкогематологических заболеваний на амбулаторном приеме участкового терапевта в ряде случаев вызывает затруднения ввиду неспецифичности первичных полиморфных клинических симптомов, которые часто скрываются под «масками» других, более распространенных заболеваний. Изменение количества лейкоцитов венозной крови при первичной диагностике ОЛ может варьировать в широких пределах — от 0,1·10⁹/л до 100·10⁹/л. Причем в 38% случаев уровень лейкоцитов не выходит за пределы нормы или даже снижен, а в 44% случаев обнаруживается лишь умеренный лейкоцитоз. Только у 18% пациентов отмечается гиперлейкоцитоз выше 50·10⁹/л. При этом у 20% пациентов в венозной крови отсутствуют бластные клетки, а у остальных содержание бластных форм может колебаться от нескольких процентов до 80—90% [6, 7]. Широко используемый в лабораториях поликлиник гематологический 3-diff. анализатор в ряде случаев может не выявить сдвиги в периферической крови пациента с лейкозом. Наличие умеренной анемии и тромбоцитопении из-за низкой настороженности медицинского персонала на амбулаторном этапе не всегда воспринимается как повод для подозрения на ОЛ. В связи с вышеизложенным длительность верификации диагноза в реальной практике составляет от нескольких недель до нескольких месяцев. В то же время использование высокочувствительных молекулярно-генетических тестов в дополнение к стандартной диагностике могло бы выявить присутствие аномальных молекул нуклеиновых кислот, ассоциированных с лейкомогенезом, уже на ранних стадиях заболевания и тем самым повысить шансы на более точную диагностику за более короткие сроки.

Несмотря на успехи современных технологий терапии ОЛ, их рецидив возникает примерно у 20% детей и более чем у 50% взрослых. Поэтому чрезвычайно важно своевременно оценить прогностические критерии классификации риска и осуществлять в процессе терапии мониторинг остаточной (резидуальной) болезни [5]. Минимальная остаточная болезнь (МОБ) означает присутствие в костном мозге небольшого количества лейкозных клеток, которые не могут быть обнаружены при световой микроскопии, но определяются более чувствительными методами исследования, способными выявлять 1 лейкозную клетку не менее чем среди 10⁴ нормальных клеток. Выявление даже единичных лейкозных клеток значительно повышает риск развития рецидивов заболевания [8], что имеет большое значение для своевременного решения противорецидивной терапии или необходимости трансплантации костного мозга [9].

Для оценки МОБ широко применяются два метода — многопараметрическая проточная цитометрия и количественная ПЦР. Обсуждаются также возможности использования технологий цифровой ПЦР и секвенирования следующего поколения (NGS). Каждая из методик отличается по чувствительности к обнаружению МОБ, а также по фенотипическим вариантам ОЛ и схемам лечения, для которых она была рекомендована в клинических исследованиях. Так, проточная цитометрия приемлема для большинства (>90%) случаев ОЛ и может достигать чувствительности 10^–3—10^–4 (1 опухолевая клетка на 1000—10 000 нормальных клеток). Анализ с ее помощью достаточно быстрый и обладает хорошей прогностической оценкой терапевтического ответа [10, 11]. Однако имеются и определенные ограничения иммуноцитометрии: образцы должны быть проанализированы как можно быстрее после взятия, а постиндукционная регенерация нормальных лимфоидных клеток, экспрессирующих антигены, характерные и для опухолевых клеток, может привести к ложноположительным результатам, гипоклеточность образца костного мозга и фенотипический сдвиг также могут стать причиной ошибочных результатов [12].

Метод секвенирования следующего поколения (NGS), завоевывающий все большие позиций в медико-биологических исследованиях, в отличие от количественной ПЦР позволяет с более высокой чувствительностью обнаружить множественные генетические аномалии. Недавние исследования показали, что мультиплексное тестирование NGS проб пациентов с ОМЛ позволяет одновременно выявлять мутации в нескольких сотнях ампликонов с чувствительностью от 0,1 до 0,001% [13]. Однако важными недостатками использования NGS, лимитирующими широкое внедрение этого метода в клиническую практику, являются технологическая сложность, высокая стоимость оборудования и расходных материалов, длительность тестирования, отсутствие стандартизированных методик и общепризнанных вычислительных алгоритмов.

Методы, основанные на количественной ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), позволяют определять генетические нарушения с чувствительностью, не уступающей методу проточной цитометрии. При этом возможно детектировать химерные транскрипты, возникающие вследствие сбалансированных хромосомных транслокаций, генные мутации, а также проявления избыточной активности генов в нормальных гемопоэтических клетках, которые становятся сверхэкспрессированы в опухолевых клетках (EVI1, WT1, HMG2, PRAME и др.). Исследования возможностей ПЦР-РВ в мониторинге МОБ показали, что постоянный высокий уровень химерных транскриптов или повышение их уровня после достигнутого ранее молекулярного ответа с высокой достоверностью предсказывают предстоящий рецидив [14]. В связи с доступностью и высокой чувствительностью ПЦР-РВ была рекомендована к практическому использованию для оценки МОБ при ОЛ [15].

Независимо от выбранного метода исследования анализ разных генетических дефектов в силу своих молекулярных особенностей требует различного подхода. Так, тесты для определения уровня t(9;11) (p21.3;q23.3) MLLT3-KMT2A обычно обладают самой низкой чувствительностью (≈1 на 10³) из-за относительно низкого уровня экспрессии транскрипта MLLT3-KMT2A, тогда как тесты на выявление мутации NPM1 достигают чувствительности до 1 на 10⁵ из-за высокого уровня экспрессии мутантного аллеля [16, 17]. Кроме того, динамика МОБ при ответе на терапию также различается в зависимости от анализируемого молекулярного маркера [18]. Ряд показателей, таких как мутации генов DNMT3A, ASXL1, TET2, NRAS, KRAS, DNMT3A, ASXL1, IDH1, IDH2, MLL-PTD или повышенные уровни экспрессии WT1, EVI1, могут сохраняться даже в ремиссии, свидетельствуя о сохранении клонального гемопоэза при отсутствии лейкозного клона клеток, поэтому не могут однозначно выступать в качестве индикаторов МОБ. Вместе с тем их обнаружение может быть весьма полезным высокочувствительным дополнением оценки риска развития рецидива при использовании в комбинации с другими, более специфичными маркерами МОБ [12].

Таким образом, точная диагностика и выбор эффективной схемы терапии ОЛ требуют понимания особенностей различных генетических аномалий, их влияния на протекание заболевания, а также технологических нюансов их выявления и использования в персонифицированной терапии ОЛ.

В Российской Федерации, к сожалению, до сих пор отсутствуют зарегистрированные наборы для молекулярно-генетических исследований при ОЛ, хотя включение генетических маркеров заболевания в клинические рекомендации и классификацию лейкозов уже с 2016 г. обусловливает актуальность их скорейшего появления на рынке медицинских изделий для in vitro диагностики.

При этом обнаружение одних модификаций на сегодняшний день возможно только высокотехнологичными методами секвенирования ввиду особенностей расположения дефектов ДНК. Для выявления же других мутаций возможно использование менее трудоемкого, но в то же время высокочувствительного метода ПЦР-РВ.

Далее приводятся нескольких молекулярно-генетических маркеров, наиболее перспективных, на наш взгляд, для разработки стандартизованных методов и наборов для диагностики и мониторинга ОЛ методом ПЦР-РВ.

Слияние генов PML-RARA. Хромосомная транслокация t(15;17) (q24;q21) приводит к слиянию гена альфа-рецептора ретиноевой кислоты (RARA) на хромосоме 17 и гена промиелоцитарной лейкемии (PML) в хромосоме 15 с образованием химерного гена PML-RARA [19]. Его наличие является высокоспецифичным диагностическим критерием острого промиелоцитарного лейкоза (ОПЛ) — особого подтипа ОМЛ, хорошо отвечающего на специфическую таргетную терапию [20].

Описано как минимум три кластера точек разрыва (breakpoint cluster region, bcr) гена PML: в интроне 6 (между экзонами 6 и 7), в экзоне 6 и интроне 3 (между экзонами 3 и 4), также известные как bcr1, bcr2 и bcr3 соответственно. В гене RARA идентифицирована только одна точка разрыва (интрон 2). В зависимости от места слияния химерного участка молекулы нуклеиновой кислоты формируются три различных варианта транскрипта PML-RARA: длинный (также известный как L, или изоформа bcr1), вариант V (bcr2, наиболее частый вариант) и короткий (S, или bcr3). Это наиболее распространенные транскрипты PML-RARA, выявленные у 90—95% пациентов [21].

Ген PML принимает участие в ряде важных биологических процессов, таких как p53-зависимый и -независимый апоптоз и старение, самообновление стволовых клеток, эпигенетическая регуляция и транскрипция гемопоэтических стволовых клеток [22]. При слиянии с RARA химерный ген придает опухолевым клеткам пролиферативное преимущество, приводя к прогрессирующему накоплению промиелоцитов. Наряду с влиянием на клеточную трансформацию PML-RARA обеспечивает опухолевым клеткам особую чувствительность к лечению. Использование полностью-транс-ретиноевой кислоты (ATRA) в сочетании с химиотерапией или ATRA в сочетании с триоксидом мышьяка (ATO) превращает этот некогда фатальный лейкоз в вполне излечимую болезнь как у детей, так и у взрослых [21].

Кроме того, PML-RARA является очень важным маркером при оценке МОБ. Ряд крупных исследований доказал, что самый важный период ОПЛ для оценки МОБ при лечении пациента с помощью ATRA или ATO заключается в достижении отрицательного результата в ПЦР PML-RARA в конце консолидирующего курса терапии [23, 24]. На сегодняшний день признанным «золотым стандартом» для молекулярного мониторинга ОПЛ являются количественные подходы ПЦР-РВ [25].

Слияние генов CBFB-MYH11. Перестройки в хромосоме 16 inv(16)(p13q22) и t(16;16)(p13.1;q22) обнаруживаются примерно в 4% случаев первично диагностированного ОМЛ и ассоциированы с подтипом M4Eo, который характеризуется присутствием миеломоноцитарных бластов и атипичных эозинофилов [26]. В результате таких модификаций формируется химерный ген, состоящий из фрагментов генов CBFB (CBFβ) (core binding factor beta subunit) на 16q22 или MYH11 (smooth muscle myosin heavy chain 11) на 16p13.1. Присутствие CBFB-MYH11 свидетельствует о хорошем прогнозе течения ОМЛ, с длительными периодами ремиссии и высоким показателем выживаемости [27]. Наряду с цитогенетическим методом и FISH для выявления транслокации CBFB-MYH11 также используется ПЦР-РВ [28]. При этом, поскольку при перестройке хромосомы разрывы в генах CBFB и MYH11 могут возникать в различных местах, формируя различные по длине гены и транскрипты [29, 30], для достоверного анализа прибегают к одновременному использованию нескольких пар праймеров, успешно формируя мультиплекс [31].

Слияние генов AML1-ETO (RUNX1-RUNX1T1). Химерный ген AML1-ETO обнаруживается примерно в 4—12% случаев острого миелолейкоза у взрослых пациентов и 12—30% детских случаев. Он формируется в результате транслокации хромосом 8 (разрыв в гене AML1) и 21 (разрыв в гене ETO) — t(8;21)(q22; q22). N-концевой участок образующегося химерного белка принадлежит гену AML1 (он же RUNX1), являющемуся альфа-субъединицей фактора связывания CBF. По этой причине он обладает свойством транскрипционного фактора, осуществляя регуляцию процессов дифференцировки клеток крови. Однако присутствие на C-конце фрагмента ETO (он же MTG8, или RUNX1T1) блокирует эту важную функцию, препятствуя нормальной дифференцировке клеток и тем самым запуская лейкомогенез [32, 33]. Согласно результатам исследований генетических изменений при развитии ОМЛ, наличие гена AML1-ETO само по себе не является причиной или прогностическим маркером заболевания, а оказывает влияние на прогрессию лишь в сочетании с другими поломками в ДНК [34], такими как мутация гена с-kit N822K [35] или изменения экспрессии ряда генов, включая микроРНК [36]. При этом лишь часть патогенетических сдвигов вызвана непосредственным влиянием AML1-ETO (например, индукция экспрессии протоонкогена c-jun, участвующего в регуляции дифференцировкии, апоптоза и пролиферации клеток) [37]. Таким образом, детекцию транслокации t(8;21) при первичной диагностике ОЛ следует сочетать с выявлением других молекулярно-генетических маркеров. Однако использование AML1-ETO для оценки МОБ, демонстрирующее отсутствие остаточного опухолевого клона сразу после курса терапии, является благоприятным прогнозом [38].

При выборе метода исследования AML1-ETO для первичной диагностики отдается предпочтение не одному, а комбинации методов ПЦР и FISH, при сохранении важности цитогенетического исследования [39], однако для мониторинга терапии рекомендуется использование ПЦР [40, 41]. На сегодняшний день проводятся исследования для использования изотермических методов амплификации ДНК при диагностике AML-ETO: LAMP, CPA, IMSA, хотя пока их возможности в мультиплексных реакциях до конца не изучены [42].

Слияние генов ETV6-RUNX1 (TEL-AML1). Хромосомная транслокация t(12;21)(p13;q22), приводящая к слиянию генов ETV6 (он же TEL) и RUNX1 (он же AML1), является наиболее частой (до 25% случаев) генетической аномалией у детей с ОЛЛ из B-линейных предшественников [43]. Она возникает в пренатальном периоде и обусловливает предрасположенность к заболеванию, тогда как лейкомогенез провоцируется возникновением в клетках дополнительных генетических аномалий, таких как дополнительные мутации генов ETV6, RUNX1, PAX5, JAK2 и др. [44]. Показано, что экспрессия химерного ETV6-RUNX1 провоцирует накопление активных форм кислорода (АФК, ROS), вызывающих повреждение ДНК и, как следствие, формирование драйверных генетических поломок [45]. Однако в то же время выявление ETV6-RUNX1 у пациента с острым лейкозом обещает благоприятный прогноз, чувствительность опухоли к лекарственной терапии и повышение шансов на полную ремиссию [46]. Поэтому химерный транскрипт является важной мишенью для диагностики, прогнозирования и даже возможной терапии острых лейкозов.

Исследования на присутствие химеры ETV6-RUNX1 в клетках-предшественниках осуществляются методом как FISH, так и ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией. Кроме того, производится апробация применения методов мультиплексной амплификации участков ДНК для выявления этой транслокации (методом лигат-зависимой амплификации зонда (MPLA)) [47].

Слияние генов E2A-PBX1. Генетическй локус E2A располагается в хромосоме 19 и дает начало двум генетическим продуктам — E12 и E47, являющимся результатом альтернативного сплайсинга исходного транскрипта. Продукты синтеза E12 и E47 содержат участки связывания с ДНК в областях промоторов/энхансеров генов иммуноглобулинов (Ig), тем самым провоцируя синтез Ig [48]. Показано, что E2A играет важную роль в развитии, созревании и дифференцировке B-лимфоцитов, в том числе через прямое участие в реаранжировке цепей Ig, являющейся ключевой для созревания B-клеток [49]. Кроме того, E2A принимает активное участие и в формировании Т-лимфоцитов [50].

PBX1 (Pre-B cell leukemic homeoboX1) относится к группе гомеодоменных белков и способен связываться с белками HOX и MEIS, формируя гетеродимерные комплексы, принимающие участие в развитии ряда злокачественных заболеваний, включая меланому и рак молочной железы [51]. В нормальных лимфоидных клетках ген PBX1 не экспрессируется.

В результате экспрессии слитного гена E2A-PBX1 могут возникнуть две формы химерного продукта: E2A-PBX1a и E2A-PBX1b, являющиеся продуктами альтернативного сплайсинга PBX1 и обладающие равной способностью к трансформации клеток. Химерный транскрипт выявляется в 5—7% случаев детского ОЛЛ, являясь маркером неблагоприятного прогноза. Транслокация E2A-PBX1 влечет за собой развитие и других генетических изменений, возникающих в различных генах и усиливающих прогрессию ОЛ. Среди них делеция гена Pax5, которая ускоряет деление предшественников и усиливает эффект блокировки дифференцировки B-клеток [52]. Показана вовлеченность Pax5 в сигнальных путях, ассоциированных с апоптозом и регуляцией клеточного цикла [53].

Выявление транслокации t(1;19) является важным показателем в дифференциальной диагностике и выборе схемы лечения ОЛЛ. При этом для выявления МОБ у детей с ОЛЛ детекция E2A-PBX1 методом количественной ПЦР в реальном времени рассматривается как наиболее перспективный метод [54, 55].

Слияние генов BCR-ABL1. В 1960 г. P. Nowell и D. Hungerford впервые опубликовали данные о необычно короткой хромосоме, наблюдаемой в лейкоцитах пациентов с ХМЛ [56]. Ее дальнейшее исследование привело к обнаружению реципрокной транслокации хромосом 9 и 22 (t(9;22)(q34;q11)), которая стала одним из важнейших маркеров ХМЛ.

Транслокация t(9;22) приводит к образованию слитного гена из фрагментов нерецепторной тирозинкиназы ABL1, располагающейся в хромосоме 9, и гена BCR, располагающегося в кластере разрывов 22 хромосомы. ABL1 относится к группе белков, впервые обнаруженных в вирусах мышиной лимфосаркомы Абельсона [57], и сочетает в себе тирозинкиназный домен, сайты связывания ДНК и актина. Это позволяет ему непосредственно участвовать в формировании молекулярного ответа на повреждение ДНК [58]. Показано участие ABL1 в репарации ДНК и активации апоптоза или аутофагии при ее значительных повреждениях [59]. Ген BCR дает начало протеину, относящемуся к классу белков, активирующих ГТФазу (GTPase activating proteins, GAPs) [60].

В процессе транслокации возможно образование нескольких вариантов химерного гена BCR-ABL1 в зависимости от точки разрыва гена BCR. В нем отмечается 3 основных области, где наиболее часто случаются разрывы:

1. Основной (большой) кластер разрыва (Major breakpoint cluster, M-BCR) располагается в районе 12—16 экзонов гена, получивших обозначения b1—b5. Транскрибируемая с такого гена матричная РНК имеет стыки экзонов b2a2 или b3a2 (где a2—3 — экзон гена ABL1) и обозначается p210 (по молекулярной массе образуемого белка 210 кДА). BCR-ABL1 p210 характеризует около 95% всех случаев ХМЛ [61].

2. Малый (минорный) кластер разрыва (minor breakpoint cluster, m-BCR) — участок 1 и 2 экзонов гена BCR, обозначаемых как e1 и e2. При разрыве в этой области образуется мРНК с точкой слияния e1a2 и протеином массой 190 кДА — BCR-ABL1 p190.

3. Микрокластер разрыва (micro breakpoint cluster, μ-BCR) обнаруживается между 19 и 20 экзонами и дает начало белку с молекулярной массой 230 кДА (BCR-ABL1 p230).

Белок BCR-ABL1 p190 наиболее часто отмечается при ОЛЛ, где общая встречаемость химерного гена BCR-ABL1 среди взрослых пациентов составляет от 11 до 29%, из которых до 80% случаев — вариант p190. Среди детского ОЛЛ BCR-ABL1 в целом встречается лишь в 1—3% случаев, но большинство их также принадлежит p190. Присутствие химерного BCR-ABL1 является показателем неблагоприятного прогноза для пациента с ОЛЛ, как взрослого, так и ребенка. Таргетная терапия ингибиторами тирозинкиназы позволяет значительно повысить шансы пациента и увеличить выживаемость [62—64]. При ОМЛ транскрипт BCR-ABL1 встречается крайне редко и требует дифференциальной диагностики от фазы бластного криза ХМЛ.

Транскрипт p230 относится к редким вариантам BCR-ABL1 и обнаруживается при ХМЛ и хроническом нейтрофильном лейкозе, хотя отмечены редкие случаи встречаемости химеры p230 и при ОМЛ [65]. Влияние транслокации с формированием BCR-ABL1 p230 транскрипта на процесс лейкомогенеза в целом схож с таковыми для p210 и p190, хотя отмечен более длительный период латентного течения заболевания и менее агрессивное его течение [66]. Таким образом, выявление транслокаций BCR-ABL1 при ОЛ имеет важное прогностическое значение.

ПЦР является одним из основных и часто используемых методов качественной и количественной детекции транскрипта BCR-ABL1 в клетках крови при мониторинге Ph-позитивных ОЛ, тогда как для первичной диагностики рекомендованы цитогенетический метод, FISH, а в научных исследованиях большой вклад вносит микрочипирование [67]. На сегодняшний день разработан ряд наборов реагентов для выявления транскриптов p190, p210 и p230 методом ПЦР в реальном времени с высокой чувствительностью [68].

Слияние генов PICALM-MLLT10 (CALM-AF10). Слитный ген PICALM-MLLT10 (известный так же как CALM-AF10) относится к редким генетическим нарушениям, однако встречается в ассоциации с различными онкогематологическими заболеваниями: ОЛЛ, ОМЛ, диффузная гистоцитарная лимфома, гранулоцитарная саркома. Он формируется в результате транслокации 10 и 11 хромосом (t(10;11)(p13;q14)), объединяющей под одним промотором участки генов киназы фосфатидилинозитола, клатрин-связывающего белка PICALM (локализация 11q23) и гена, ассоциированного с развитием лимфоидной, миелоидной либо смешанной лейкемии в хромосоме 10 (MLLT10) (10p13). Благодаря взаимодействию с клатрином PICALM принимает участие в регуляции клеточного эндоцитоза. Кроме того, для клатрина описано влияние на митоз клетки, что также может вовлекать белок, кодируемый PICALM [69]. Роль PICALM в гемопоэзе, где его называют также CALM (clathrin assembly lymphoid myeloid leukemia), описывается с различных позиций. Для него показано участие в созревании эритроцитов, где выключение гена PICALM приводит к развитию микроцитарной и гипохромной анемии за счет ограничения включения железа в гемоглобин [70].

Ген MLLT10 кодирует белок AF10, являющийся транскрипционным фактором. Функция AF10 в клетке еще недостаточно исследована, хотя показано его взаимодействие с немодифицированным гистоном H3 и способность к активации его гена за счет деметилирования участка Lys-79 [71].

Выявление транскрипта PICALM-MLLT10 является признаком неблагоприятного прогноза течения злокачественного заболевания и высокого риска рецидива. Отдельные исследования in vitro демонстрируют вероятность обеспечения повышенной лекарственной устойчивости у клеток, содержащих данный генетический дефект [72]. Кроме того, показано, что пациенты с PICALM-MLLT10, как правило, имеют повышенный уровень тромбоцитов и меньшую длительность общей выживаемости [73]. Методы выявления PICALM-MLLT10 успешно включены в мультиплексные варианты ПЦР, обеспечивая доступный и экономически эффективный метод диагностики и мониторинга ОЛ [74].

Слияние генов SIL-TAL1. Ген TAL1 располагается в локусе 1p32 и кодирует белок — транскрипционный фактор, принимающий важное участие в эмбриогенезе и гемопоэзе. Наибольший уровень экспрессии TAL1 обнаруживается в гемопоэтических стволовых клетках, плюрипотентных и мультипотентных клетках-предшественниках [75]. Одной из основных мишеней данного белка является рецепторная тирозинкиназа c-KIT, участвующая в регуляции клеточной пролиферации [76]. Повышенная активность TAL1 через активацию c-KIT способна усиливать деление клеток, а сниженная, напротив, тормозить его и способствовать переходу в апоптоз. По мере развития и созревания клеток крови эритроидного и мегакариоцитарного рядов экспрессия TAL1 снижается, а в лимфоцитах — вовсе прекращается. Зрелые Т- и В-лимфоциты TAL1 не экспрессируют [77].

Изменения в работе TAL1 встречаются примерно в 20—30% случаев Т-ОЛЛ [78]. При этом описано несколько разновидностей дефектов данного гена, приводящих к изменению его активности [79]. В результате одной такой делеции размером около 90 т.п.н. происходит выпадение 5’-некодирующего региона TAL1 и его слияние с начальным некодирующим регионом генов SIL. Ген TAL1 начинает экспрессироваться под промотором SIL [79]. Поскольку SIL гены постоянно активны в пролиферирующих клетках, они обеспечивают постоянный синтез TAL1, провоцируя развитие Т-ОЛЛ [80]. На сегодняшний день нет однозначного ответа на вопрос о влиянии SIL-TAL1 на прогноз Т-ОЛЛ [81, 82]. Тем не менее описан механизм влияния TAL1 на деление клеток при блокировке дифференцировки, что делает его перспективной мишенью для терапии этой формы лейкоза [83] и соответственно маркером эффективности терапии [84]. Несмотря на то что размер делеции позволяет относить данную перестройку к хромосомным транслокациям, цитогенетический метод детекции SIL-TAL1 менее предпочтителен, чем ПЦР-РВ, особенно при оценке МОБ [84].

Реаранжировки MLL (MLL-r). Транслокации, приводящие к реаранжировкам гена лейкемии смешанного типа (mixed-lineage leukemia), — MLL-реаранжировки (MLL-r) встречаются примерно в 5% ОЛЛ и 5—10% ОМЛ у взрослых. Их важной особенностью является участие в развитии ОЛ у детей с младенческого возраста: до 70% детских ОЛЛ и 50—66% детских ОМЛ. При этом наличие MLL-r обусловливает неблагоприятный прогноз и низкую выживаемость юных пациентов (5-летняя выживаемость 34—39% в сравнении с 60—96% при отсутствии данной транслокации) [85].

Ген MLL локализуется на участке хромосомы 11q23 и экспрессируется с образованием белка лизин(K)-специфичной метилтрансферазы 2А (KMT2A). Полипептид MLL после синтеза расщепляется ферментом треонин аспартазой 1 на 2 домена (MLL-N и MLL-C), каждый из которых впоследствии участвует в формировании белкового комплекса. Белок MLL относится к группе гистоновых метилтрансфераз, активирующих транскрипцию мишеневых генов. При изучении на мышиных моделях MLL признан ответственным за самоподдержание стволовых кроветворных клеток [86]. Его влияние на экспрессию генов кластера Hox (homebox) через гистоновые ацетилтрансферазы CBP/p300, MOZ, и MOF, и ацетилируемые ими гистоны H3K27, H3K9, и H4K16 обеспечивает регуляцию нормальной пролиферации клеток-предшественников кроветворения [87]. Для данного гена описано большое количество реаранжировок, которые ответственны за развитие ОЛ. Показано также, что пациенты с перестройками этой группы имеют хороший ответ на иммунотерапию CAR-T (chimeric antigen receptor T-cell) [88].

Около 36% от всех дефектов MLL-r представляет слитный ген MLL-AF4 [87], ответственный за развитие ОЛЛ, формируемого из В-клеток-предшественников в младенческом возрасте. Предполагается, что сам по себе ген MLL-AF4, образующийся в результате транслокации t(4,11)(q21,q23) на 11 хромосоме, не индуцирует развитие ОЛ, хотя активно способствует поддержанию лейкомогенеза [89]. Исследования демонстрируют, что драйверной функцией может обладать скорее родственный ему химерный ген AF4-MLL, формирующийся на 4 хромосоме, и сопутствующие генетические дефекты, такие как мутации гена RAS [90].

Ген MLL-AF9 является вторым по частоте вариантом реаранжировки MLL-r (около 19% от всех MLL-r) и также опосредует эпигенетические изменения в клетке через ассоциацию с гистоновыми белками. Наряду с MLL-AF4 он вовлечен в комплекс супер-элонгации (superelongation complex, SEC), ответственный за элонгацию транскрипции генов, в том числе ее изменения при лейкозах [91], и 29% генов-мишеней MLL-AF9 регулируются также MLL-AF4. MLL-AF9-позитивные клетки лейкемии, как правило, находятся в состоянии между CD34+ предшественниками и полностью дифференцированными моноцитами [92].

MLL-AF9 обнаруживается главным образом при ОМЛ взрослого населения, лишь в единичных случаях встречаясь при ОЛЛ. Однако среди детских ОЛ картина значительно отличается, и данная транслокация уже с почти равной частотой сопровождает обе формы ОЛ [87]. При этом детские лейкозы, сопровождаемые MLL-AF9, демонстрируют более агрессивное течение, высокую степень инвазии клеток [93], плохой прогноз выживаемости и устойчивость клеток к доксорубицину [94].

MLL-ENL представляет около 10% всех MLL-r при острых лейкозах и является результатом транслокации t(11;19)(q23;p13.3). Данная реаранжировка отмечается как при ОЛЛ, T- и B-клеточном, так и при ОМЛ [95]. Искусственное введение данной транслокации в клетки in vivo при помощи CRISPR-Cas позволило доказать непосредственное участие MLL-ENL в инициации лейкоза [96]. Также показано, что длительная экспрессия химеры MLL-ENL способствует поддержанию агрессивного лейкомогенеза, особенно в сопровождении сопутствующих генетических дефектов [97], и является потенциальной мишенью для терапии данных форм лейкозов [98].

MLL-AF6 (результат транслокации t(6;11)(q27;q23)) — относительно редкий генетический дефект при ОЛ (около 4% от всех MLL-r случаев), определяющий плохой прогноз главным образом при детских ОМЛ. Одной из мишеней MLL-AF6 является ген SHARP1, являющийся онкогенным драйвером ОМЛ и обеспечивающий поддержание жизнедеятельности опухолевых клеток. В кооперации с белком MLL-AF6 SHARP1 участвует в прогрессии заболевания и потому является потенциальной мишенью для терапии [99]. Таким образом, выявление MLL-AF6 транскрипта является поводом для выбора индивидуальной схемы терапии ОМЛ для повышения шансов на более благоприятный исход у пациента.

Экспрессия гена EVI1. Ген EVI1 (ген сайта экотропной вирусной интеграции 1), известный также как MECOM, или MDS1, располагается в хромосоме 3, локусе 3q26.2, имеет размер около 60 т.п.о. и включает 16 экзонов. Кодируемый им белок является транскрипционным фактором, специфичным для стволовых клеток и способным стимулировать самоподдержание клетки, ингибирование апоптоза и дифференцировки. У человека экспрессия EVI1 обычно ассоциирована с хромосомными перестройками при ОМЛ, миелодиспластическом синдроме [100], а также выявляется при хроническом миелолейкозе как маркер прогрессии в стадию бластного криза [101]. При этом сверхэкспрессия может быть вызвана такими генетическими изменениями, как инверсия inv(3)(q21q26), транслокации в пределах одной хромосомы (t(3;3)(q21;q26)) или между разными хромосомами (t(3;17)(q26;q22), t(2;3)(p21‐22;q26)) [102], а также возникать при их отсутствии, но в возможной ассоциации с мутациями других генов, таких как CEBPA, NPM1 [103]. Перестройки длинного плеча 3 хромосомы обнаруживаются в 4—5% всех случаев ОМЛ, среди которых около 50% затрагивают участок 3q26, где расположен ген EVI1 [104].

Несмотря на различие причин, повышение уровня экспрессии EVI1 является информативным прогностическим маркером и может рассматриваться независимо от наличия транслокаций. Показано, что величина экспрессии данного гена ассоциирована с общей выживаемостью взрослых пациентов с ОМЛ. При этом значение уровня EVI1 при анализе методом ПЦР в реальном времени успешно нормируется по таким генам домашнего хозяйства, как гидроксиметилбилансинтаза (HMBS, он же PBGD), β-глюкуронизаза (GUSB) и ABL протоонкоген 1 (ABL1) [102].

Экспрессия гена PRAME. PRAME-ген (preferentially expressed antigen of melanoma) располагается в 22 хромосоме, локусе 22q11.22, и впервые был описан в клетках меланомы, за что получил свое название. Однако впоследствии было установлено, что он относится к группе раково-тестикулярных генов (cancer testis antigens, CTAs), экспрессируется клетками гамет и опухолевыми клетками. Активность PRAME была обнаружена в 97% случаев меланомы, 80% случаев сарком, 70% исследованных случаев мелкоклеточного рака легких, 40% исследованных случаев рака почек и 30% случаев рака головы и шеи [105]. При этом при большинстве опухолей экспрессия PRAME в основном связана с метастазированием, лекарственной резистентностью и неблагоприятным прогнозом. То же отмечается при миелопролиферативных заболеваниях, однако ряд вариантов лейкозов с экспрессией PRAME, напротив, имеет лучший прогноз [106]. Показано, что уровень мРНК PRAME коррелирует с эффективностью лечения ОЛ у взрослых [107]. Исследования продемонстировали его участие в усилении пролиферации, подавлении дифференцировки, избегании апоптоза посредством блокировки ретиноевой кислоты [108]. По этой причине данный ген рассматривается не только как диагностический и прогностический фактор, но и как потенциальная мишень в терапии ОЛ [109, 110].

Экспрессия гена WT1. Ген WT1 (Wilms tumor 1) располагается в 11 хромосоме, локусе 11p13 и впервые был обнаружен в ассоциации с нефробластомой (опухолью Вильмса), отчего и получил свое название. Именно тогда были обнаружены значимые мутации в данном гене [111]. Кроме того, показана взаимосвязь экспрессии WT1 с развитием ретинобластомы, рака молочной железы, карциномы легких и др. При этом подавление экспрессии WT1 приводит к снижению роста опухолей, провоцируемых экспрессией KRAS [112]. Белок, синтезируемый с WT1, включает N-концевой участок трансактивации и C-концевой участок, состоящий из четырех «цинковых пальцев», которые обеспечивают связывание с геном фактора транскрипции EGR1. С их помощью WT1 способен взаимодействовать с различными белками, включая p53, TET2, TET3, VEGF и др. [113].

Повышенная экспрессия WT1 отмечена при ОМЛ у взрослых. ОЛ у детей демонстрируют не столь однозначные данные об активности этого гена, но также активно исследуются для поиска взаимосвязи уровня мРНК WT1 и прогноза течения заболевания. Отсутствие активности WT1 в здоровых клетках позволяет рассматривать данный ген как маркер при мониторинге течения заболевания и оценке МОБ при ОМЛ [114, 115], а также при ОПЛ в ассоциации с дефектом PML-RARa [116].

Экспрессия гена HMGA2. HMGA2 (high mobility group AT-hook 2) — ген, располагающийся в локусе 12q14.3 и кодирующий белок, относящийся к группе негистоновых белков высокой подвижности хромосом. Присутствие в составе белка доменов связывания ДНК позволяет ему осуществлять регуляцию транскрипции генов [117]. Сверхэкспрессия данного гена отмечается при различных онкологических заболеваниях [118], приводит к прогрессии заболевания [117] и рассматривается как независимый прогностический фактор, предсказывающий неблагоприятное течение ОМЛ [119]. Кроме того, показана вовлеченность HMGA2 в развитие лекарственной устойчивости ОМЛ к даунорубицину посредством регуляции Wnt/β-катенин — сигнального пути [120]. Таким образом, HMGA2 является важным участником диагностической панели для мониторинга течения ОЛ.

Экспрессия генов EVI1, PRAME, HMGA2 и WT1 успешно оценивается по уровню мРНК при помощи ПЦР в реальном времени [121—123].

Суммарная информация о различных генетических дефектах при острых лейкозах представлена в табл. 2.

Таблица 2. Характеристика молекулярно-генетических маркеров острых лейкозов

Заключение

Наряду с морфологическими, цитохимическими и иммунологическими исследованиями в диагностике острых лейкозов все большую актуальность приобретают методы выявления онкоассоциированных генетических нарушений в клетках крови. Современное развитие молекулярно-генетических технологий позволяет предложить более широкое использование в клинической практике дополнительных маркеров прогноза течения заболевания и мониторинга эффективности терапии. При этом высокая чувствительность и доступность метода ПЦР ставит на повестку дня вопрос включения молекулярно-генетических тестов уже на начальном этапе диагностического алгоритма острых лейкозов параллельно с рутинным гематологическим анализом. Проблема множественности возможных генетических аномалий лейкозных клеток может быть решена использованием мультиплексных технологий ПЦР-РВ и включением в панель тестов наряду с наиболее частыми химерными транскриптами и маркеров высокой экспрессии «эмбриональных» генов. К сожалению, на сегодняшний день внедрение подобных технологий во многом сдерживается отсутствием стандартизованных коммерческих тест-систем. Остается выразить надежду, что представленные в настоящем обзоре данные о природе молекулярно-генетических нарушений в клетках крови пациентов при лейкемии помогут разработкам будущих аналитических систем.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.