Введение

Стабильность аналита во взятой пробе или образце можно определить как сохранность его физико-химических свойств во времени. Следовательно, нестабильность можно представить как функцию изменения этих свойств с течением времени, выраженную в виде уравнения неустойчивости.

Нестабильность — основополагающее, но не особенно заметное свойство качества пробы. Требования ISO 15189:2012 к качеству и компетентности лабораторий [1] включают общие требования к документированной процедуре контроля времени и температуры в момент транспортировки в как того требуют заказанные тесты и предписывают условия хранения пробы на преаналитическом этапе (пункт 7.2.5). Новая версия документа ISO 15189:2022 [2], находящаяся на стадии внедрения, дополнительно включает специальные требования к обработке, подготовке и хранению проб:

7.2.7.2 Критерии запроса на дополнительные исследованя. В лаборатории должны существовать процедуры и соответствующие условия для защиты проб пациентов, обеспечения их целостности, а также предотвращения потери или повреждения проб во время их обработки, подготовки и хранения.

7.2.7.3 Стабильность пробы

Когда это необходимо, должно быть задано допустимое время между сбором пробы и выполнением исследования с учетом стабильности аналита в первичной пробе, и это время должно контролироваться.

Эти новые требования означают, что лаборатория должна признавать и контролировать сроки от сбора проб до исследования и от взятия проб до утилизации. Этот временной предел обычно называют пределом стабильности.

Одной из основных целей разработки систем взятия проб на протяжении многих лет было улучшение стабильности аналитов. Реализованы различные физические (ограничение контакта с воздухом, отделение клеточного компонента, охлаждение и т.д.) или химические (системы ингибирования деградации белков, антисептики и т.д.) механизмы. На нестабильность аналитов влияют условия обращения с пробами, это необходимо регулярно оценивать в каждой медицинской организации в контексте постоянного технологического усовершенствования.

Несмотря на то, что стабильность проб — основополагающая характеристика способности лабораторий предоставлять результаты высокого качества, оценка предела стабильности не является явным нормативным требованием к производителям устройств для диагностики in vitro. Европейской директивой IVD 98/79/EC Европейского парламента [3] указана в отношении контейнеров для проб — необходимость оценки стабильности изделия как части требований к контейнеру, а не стабильности аналитов. Новая Директива ЕС 2017/746 [4] (которая вступила в силу в мае 2022 г. с переходным периодом до мая 2027 г. для медицинских изделий, уже имеющихся на рынке), напротив, включает следующее требование в отношении стабильности:

Приложение II, 6.1.1: Верификация и валидация продукции, которая должна быть включена в техническую документацию. В этом разделе должны быть описаны различные типы проб, которые могут быть проанализированы, включая их стабильность, хранение, если это применимо, условия их транспортировки и, для срочных методов анализа, информацию о периоде времени между сбором проб и их исследованием, а также условия хранения, такие как продолжительность, температурные пределы и циклы замораживания/оттаивания.

Упомянутые выше стандарты прямо ориентированы на управление рисками как для лабораторий, так и для производителя, и степень оценки стабильности должны отражать это. Поэтому важно документировать влияние на пациента потери стабильности образца, которая может проявляться либо как единичный результат у пациента с конкретной невыявленной проблемой (например, задержка транспортировки), либо как общий эффект различия в процедурах обращения с пробой (например, определение глюкозы в пробирке с целевым стабилизатором по сравнению с определением в сыворотке без стабилизатора, наряду с другими биохимическими аналитами) [5, 6].

Для большинства аналитов, используемых в рутинной практике, опубликованы многочисленные экспериментальные исследования стабильности. Однако многие из них проводились с использованием устаревших систем взятия, без вакуума или системы разделения. Существуют библиографические компиляции исследований стабильности с рекомендуемыми пределами стабильности, подготовленные различными профессиональными группами: Немецкое общество клинической химии и лабораторной медицины (DGKL) [7], Американская ассоциация клинической химии (AACC) [8] и Институт клинических и лабораторных исследований (CLSI) [9—11]. Хотя эти исследования проводились с использованием устаревших методов или экспериментов низкого качества, они продолжают существенно влиять на лабораторную практику и рекомендации по стабильности.

Фундаментальная проблема в обеспечении согласованности между исследованиями заключается в том, что лишь немногие определяют и публикуют уравнения нестабильности или делятся «сырыми» данными. Обычно результаты выражены в виде пределов стабильности, полученных с применением вариабельной максимально допустимой ошибки (MPE). Существенные различия наблюдаются даже тогда, когда можно ретроспективно рассчитать уравнения неустойчивости по опубликованным данным исследования [12]. Для обеспечения сопоставимости результатов необходимо знание конкретных условий, в которых проводились исследования. Однако во многих публикациях, описывающих подобные исследования, не предоставляется адекватной информации, например, о сборе, обработке, хранении или транспортировке проб, а также инструментах и методах анализа и т. д. Учитывая подобные недоработки, в 2019 г. Рабочая группа по преаналитике Европейской федерации клинической химии и лабораторной медицины (EFLM WG-PRE) опубликовала «Чек-лист для отчетности об исследованиях стабильности» (CRESS) [13]. Эта рекомендация была призвана побудить авторов таких исследований прозрачно предоставлять единую информацию для интерпретации и метаанализа.

Однако Чек-лист (CRESS) не содержит рекомендаций о том, как разработать исследование стабильности или оценить его результаты. Существует лишь несколько национальных [14], и никаких международных рекомендаций по этой теме. Поэтому цель данной рекомендации — заполнить этот пробел. В представленной статье основное внимание уделяется тому, как разработать исследования для тех образцов, которые наиболее часто анализируются в клинических лабораториях (т.е. крови и мочи). Для других проб это также может быть применимо, но в случае проведения исследования биоматериала с матрицей, не описанной в этой рекомендации, необходимо будет учитывать характеристики интересующего типа биоматериала. Принимая во внимание долгосрочную аналитическую вариацию из-за смены лотов материала или оборудования, предлагаемый дизайн исследования также может быть применен к долгосрочному хранению биологических проб (биобанкинг).

Несмотря на то, что клинические лаборатории могут проводить исследования стабильности для верификации заявлений производителей о стабильности, основная ответственность за выполнение этой задачи лежит на компании-поставщике. Все данные о стабильности, включая условия стабильности, изученные периоды времени и статистическую достоверность предоставленных уравнений нестабильности, должны быть предоставлены вместе с реагентами. Поскольку устройства для взятия проб — фундаментальный фактор, определяющий стабильность, сотрудничество с производителями этих устройств имеет принципиально важное значение.

Дизайн исследования

Условия стабильности

Каждый производитель или лаборатория должны определить, какие условия должны быть проверены, в зависимости от оценки степени риска, с учетом предполагаемых процедур взятия проб и обращения с ними. Для того или иного аналита необходимо исходить из понимания причин его деградации или роста. Количество исследований, которые необходимо провести, будет зависеть от количества выявленных переменных, за исключением времени, которое будет использоваться как единственная независимая переменная при планировании исследований, как описано ниже.

Общие переменные, которые способствуют нестабильности аналита в пробах, включают:

— Клеточный метаболизм и лизис клеток. При контакте с клетками происходит обмен веществ даже без разрушения клеток [16—18]. Лизис клеток приводит к высвобождению ферментативного материала, что может привести к изменению метаболизма компонентов. Пробы крови центрифугируются, а сыворотка или плазма отделяются от клеток (с помощью физического барьера или переноса в другой контейнер), чтобы остановить влияние клеточного метаболизма на состав сыворотки или плазмы. После центрифугирования некоторые клетки (особенно тромбоциты) и фрагменты клеток обычно остаются в сыворотке и в большей степени в плазме, в зависимости от метода и условий, использованных для разделения. Пробы мочи могут содержать различное количество воспалительных или эпителиальных клеток и микроорганизмов, что влияет на стабильность [19, 20].

— Контакт с воздухом; диффузия и испарение. Открытие пробирки во время проведения исследования вызывает испарение, приводящее к увеличению концентрации большинства аналитов [21] и диффузии растворенных газов с потерей углекислого газа и последующим увеличением pH [8, 22, 23]. Даже если контейнер держать закрытым, эти процессы необходимо учитывать, поскольку некоторые газы могут диффундировать через стенки контейнера, особенно в пластиковых контейнерах [22—25]. Сбор мочи происходит при контакте с воздухом, хотя впоследствии ее можно перенести в вакуумные контейнеры.

— Воздействие света. Непрозрачные материалы для ограничения воздействия на пробу светового излучения различной степени в течение всего процесса используются нечасто. Некоторые аналиты нестабильны в зависимости от интенсивности, продолжительности и типа воздействия света [26].

— Ориентация пробирок и перемешивание. Перемешивание является фактором, влияющим на скорость биохимических реакций. Это важный аспект для проб, которые необходимо транспортировать на большие расстояния. Вертикальная ориентация пробирок с сывороткой обеспечивает полную коагуляцию и уменьшает смешивание ее компонентов, а также позволяет избежать прилипания фибрина к внутренней стенке крышки пробирки [7].

— Адсорбция. В пластиковых контейнерах или пробирках с разделительным гелем возможен перенос компонентов из пробы в материал пробирки/геля и наоборот. Это особенно актуально для детекции некоторых микроэлементов, лекарств или гормонов [27—29].

— Температура является важным катализатором химических реакций, вызывающих снижение стабильности [30—34].

— Консерванты. В некоторых системах для взятия проб к пробам добавляют консерванты для изменения их поведения (антикоагулянты или прокоагулянты), инактивации или предотвращения роста микроорганизмов [35—37], или улучшения стабильности конкретного аналита (т.е. пробирки со стабилизатором глюкозы), пробирки с ЭДТА и ингибиторами протеаз для анализа нуклеиновых кислот или пептидов) [38, 39]. Эти вещества могут изменить стабильность других аналитов.

— Вариабельность, обусловленная процессом взятия: к таким переменным относятся возможное ухудшение вследствие гемолиза или неправильное заполнение пробирки, что может повлиять на стабильность компонентов пробы. Эти эффекты следует ограничивать, соблюдая правила взятия проб [40].

— Аналитический метод: Аналитический метод определяет свойство аналита (например, активность фермента — против массы) или часть обнаруженной молекулы например, в иммунохимии антитела к молекуле или к ее фрагменту. Сообщалось о различиях в наблюдаемой стабильности даже при использовании очень похожих методологий [41].

Многие из этих потенциально влияющих факторов подвержены широкой межиндивидуальной вариабельности из-за различных концентраций клеток в пробе или генетической изменчивости механизмов деградации [42]. Среди опубликованных работ, эта межиндивидуальная вариабельность приводит к информации о разных коэффициентах наклона уравнений нестабильности для каждого субъекта, что со временем пропорционально увеличивает дисперсию полученных результатов и позволяет прогнозировать стабильность для конкретного субъекта тем менее точно, чем больше проходит времени.

Присутствие в пробе лекарств, добавок или микроорганизмов является возможной, плохо изученной причиной изменения ожидаемой стабильности, которую также следует принимать во внимание.

Возможно было бы разработать исследования стабильности путем изменения нескольких условий одновременно и использовать многомерные прогностические модели, однако, многие из упомянутых условий устойчивости не являются непрерывными переменными, а такие, которые являются, например температура, не влияют одинаково на все аналиты. Ретроспективный анализ различий тестируемых условий может быть затруднен, и это способствует неточности прогнозов нестабильности.

Следовательно, представляется более целесообразным определить набор стандартных условий устойчивости и проводить исследования «по одному», где все условия устойчивости фиксированы и оценивается только эффект во времени.

Планируя исследование, следует проверить наиболее распространенные местные методы хранения. Если пробы хранятся какое-то время в клиниках или кабинете врача, исследование стабильности аналитов в цельной крови может иметь большее значение, чем в плазме/сыворотке.

Стабильность проб может оцениваться при обычных температурах обращения, с помощью двух «базовых» методов: применяя местные условия (контейнеры и системы для взятия, аналитические методы и т. д.), каждый поставщик/лаборатория должен проводить исследования на пробах, хранящихся при температуре окружающей среды, или на охлажденных пробах (отражающих внелабораторные преаналитические процессы) и на охлажденных или замороженных пробах (отражающих внутрилабораторные преаналитические процессы). Целесообразно проверить и другие температуры, особенно если на анализируемое вещество оказывает существенное влияние этот фактор. В исследованиях следует строго контролировать, фиксировать и документировать температуру на каждом этапе исследования, поскольку это основная влияющая переменная.

Исследуемые сроки хранения будут зависеть от общепринятых методов транспортировки и обращения с пробами. Следует учитывать общепринятые на местном уровне временные рамки для преаналитической обработки проб, включая необходимость транспортировки в отдаленные лаборатории и время, необходимое для обработки проб (центрифугирование или добавление консервантов). Кроме того, необходимо учитывать продолжительность и способ исследования пробы, занимающей значительное время работы с ней при комнатной температуре, а также время хранения пробы в случае последующих дополнительных запросов.

Поскольку процессы сбора, транспортировки и исследования проб обычно занимают часы, а не дни, рекомендуемой единицей продолжительности является час, чтобы наклон уравнения нестабильности выражал часовое процентное изменение, более точно отражая время рутинной работы с пробой.

При наличии изменений в работе оборудования или значительной вариабельности какого-либо индикатора качества работы оборудования, следует перепроверить его влияние на стабильность.

Рекомендация: Используйте схему «Проверяйте по одному набору переменных за раз», основанную на изучении влияния времени на стабильность аналитов в пробах, собранных, обработанных и хранящихся при фиксированном наборе условий стабильности.

Рекомендация: Количество условий стабильности и периоды времени, подлежащие изучению, должны быть определены в соответствии с общепринятыми на местном уровне процедурами сбора, обработки, транспортировки и хранения проб.

Выбор испытуемого/пробы

Количество и тип испытуемых, включенных в исследование стабильности, важны для обеспечения статистической достоверности модели и возможности ее переноса на популяцию со схожими характеристиками.

Вместо здоровых добровольцев рекомендуется использовать пробы пациентов. Таким образом, исследуемые пробы демонстрируют большую межиндивидуальную вариабельность и включают клинически значимые концентрации аналита.

Поскольку исходная концентрация аналита может повлиять на его стабильность [25], исследования стабильности следует проводить в пробах с концентрациями, близкими к уровню пределов клинического решения, с учетом типа лаборатории и интересующей популяции. Однако в большинстве случаев концентрация в пробе перед исследованием неизвестна, за исключением контролируемых случаев. Таким образом, отбор исследуемых затрудняется, и часто исследуемые пробы представлены в концентрациях в пределах биологического референтного интервала.

Для возможности переноса результатов исследования стабильности и во избежание неверной интерпретации выявленных отклонений, сбор проб и преаналитическая обработка должны быть стандартизированы прежде любых других действий, имеющих отношение к результатам анализа. Неправильное обращение с пробой на преаналитическом этапе может привести к изменению стабильности: гемолиз, бактериальное загрязнение или контакт с воздухом. Таким образом, следует обеспечить сбор и обработку проб перед экспериментальным исследованием в сроки, соответствующие наилучшей лабораторной практике.

Для исследований стабильности чрезвычайно важно одновременно собирать несколько эквивалентных проб от одного и того же лица. Обычно это предполагает получение большего количества образцов. В различных ситуациях, например, при сборе крови, важно помнить, что качество пробы может меняться в результате процесса сбора, главным образом потому, что пробу необходимо получить путем индукции венозного стаза. Кроме того, эмоциональное напряжение пациента, связанное с самой венепункцией, может привести к выбросу в кровь гормонов или других веществ.

Сообщалось о значительных различиях между результатами из разных пробирок, полученных при одной венепункции. Следовательно, чтобы обеспечить эквивалентность всех пробирок, следует позаботиться о том, чтобы венепункция выполнялась стандартизированным способом в соответствии с текущими рекомендациями [40]. В идеале, чтобы избежать систематических ошибок, вызванных сбором, порядок отбора проб для разных условий/длительности хранения должен быть рандомизированным.

Исследования стабильности должны моделировать ошибочные задержки в обработке проб. Для моделирования хранения проб между сбором и обработкой (например, центрифугированием) мы советуем получать каждую пробу, связанную с каждым периодом хранения, в отдельной специальной первичной пробирке. Это особенно важно при использовании вакуумных пробирок, поскольку аликвотирование пробы приведет к контакту пробы с воздухом и возможному загрязнению. Чтобы отразить «реальные» рутинные процедуры, необходимо использовать первичные пробирки для каждого моделирования условий хранения. Эти пробы должны быть рандомизированы после сбора и обработаны в соответствии с инструкциями поставщика.

В случае сохранения обработанных проб следует моделировать обычные рутинные условия. При использовании вакуумных пробирок со встроенными системами разделения (например, геля) для большинства распространенных аналитов рекомендуется проводить прямое исследование из первичной пробирки. В этом случае также рекомендуется получать отдельные пробы для каждого периода хранения, поскольку в случае задержки исследования образец останется центрифугированным и закрытым в основной пробирке.

Если локальный процесс включает аликвотирование, исследование стабильности может быть проведено с аликвотой. Следует помнить, что использование оставшихся проб, их объединение или добавление, всегда будет приводить к появлению новых потенциальных ошибок. Если по этическим, техническим или финансовым причинам другой дизайн исследования невозможен или если это стандартный метод обращения с пробами в местной лаборатории, это следует принять во внимание при объяснении эффекта нестабильности основной пробирки.

CRESS включает обширный чек-лист аспектов, которые следует учитывать и которые являются фундаментальной частью рекомендаций по сбору проб [9—11].

Рекомендация: Перед анализом пробы для исследований стабильности следует собирать и хранить в идеальных рутинных условиях.

Рекомендация: Во избежание неверных манипуляций с данными рекомендуется использовать отдельные первичные пробирки для каждого исследуемого периода хранения.

Рекомендация: Предпочтительнее использовать пробы от пациентов, поскольку они лучше отражают интересующие концентрации аналитов, чем пробы здоровых людей.

Дизайн эксперимента

Как указано в ISO 35:2017 [43]; Наличие нестабильности для конкретного набора условий оценивается путем одновременного получения нескольких проб пациента и поддержания их в одних и тех же контролируемых условиях стабильности в течение переменного времени. Пробы следует анализировать таким образом, чтобы минимизировать аналитическую ошибку. Этого можно достичь путем жесткого контроля случайной ошибки определением повтора и систематической ошибки с помощью двух стратегий:

— Если анализ проводится в нескольких сериях, по мере достижения каждой временной точки исследования (исследования в режиме реального времени) перед каждой аналитической серией следует проводить строгий внутренний контроль качества (и, при необходимости, повторную калибровку), чтобы минимизировать погрешность между сериями. Между аналитическими сериями не должно быть изменений в лоте реагентов.

— Анализируйте все пробы в одной аналитической серии, исключая погрешность между сериями (изохронные исследования). Это возможно только в том случае, если пробы могут храниться в эталонных условиях, где существует установленный и задокументированный метод долгосрочной стабилизации, например, криоконсервация проб в глубокой заморозке. Если пробы хранятся в глубокой заморозке, но не анализируются за один раз, рекомендуется проанализировать по крайней мере каждую пробу целиком за один раз.

В любой модели исследование стабильности должно сопровождаться строгими внутренними процессами контроля качества, и следует избегать смены лотов реагентов, контрольного материала или вмешательства в измерительное оборудование во время исследования проб. Существование эталонного метода долгосрочного хранения может быть основано на других исследованиях или предварительном исследовании, проведенном для демонстрации его обоснованности и охватывающем предполагаемый период исследования. Эта информация должна включать количество допустимых циклов замораживания/оттаивания и предоставлять информацию о способе оттаивания и гомогенизации. Эта информация особенно важна, если образец будет храниться в первичной пробирке.

Для увеличения воспроизводимости и обнаружения выбросов следует использовать повторные измерения. Значительные ошибки, превышающие сходимость, будут обнаружены как различия между повторами. Для проб с адекватной воспроизводимостью среднее значение результатов повторных измерений считается наилучшей оценкой истинного значения. Исследования в дублях достаточно, если нет информации о низкой воспроизводимости аналитического метода, в этом случае количество повторов может быть увеличено.

Ключевым вопросом дизайна исследования является количество необходимых проб. Размер выборки связан с вероятностью обнаружения эффекта нестабильности (= размер эффекта). В предлагаемой модели регрессии величина эффекта связана с наклоном аппроксимирующей линии. Наклон, практически, не отличающийся от нуля, указывает на отсутствие нестабильности, а это означает, что при любой изученной продолжительности хранения разница с базовым образцом не отличается от нуля. Очень дискретные эффекты с наклонами уравнения регрессии, близкими к нулю, потребуют очень большого размера выборки, длительного периода хранения и минимальной аналитической ошибки (см. раздел о проверке).

Оценить необходимый размер выборки можно, если априорно известны данные об уравнении устойчивости и дисперсии результатов, хотя существуют разногласия по поводу метода расчета и надежности [44]. Например, исследование с наклоном -0,2%/ч (=5% снижение за 24 ч) с учетом α- и β-ошибок 0,05 и 0,2 соответственно, потребует размера выборки 100, что эквивалентно 20 субъектам с 5 временными точками наблюдения.

Временные точки хранения представляют собой моменты в течение общего времени исследования, в которые оценивается потеря стабильности. В идеальных условиях в регрессионной модели временные точки случайны и равномерно распределены для любого субъекта в течение всего времени исследования. Это часто технически сложно, поэтому фиксированные временные точки для всех субъектов могут быть целесообразными при условии, что сохраняется равномерное распределение и включено не менее пяти временных точек. Для проверки соответствия уравнения неустойчивости линейной модели необходимо как минимум пять временных точек [45].

Каждый производитель/лаборатория должен выбрать подходящий дизайн исследования для типа пробы и аналитов, подлежащих измерению. Предложения по дизайну исследований для некоторых распространенных проб представлены в табл. 1.

Таблица 1. Предложение по выбору дизайна (основная стратегия выделена жирным шрифтом)

Рекомендация: если есть доказательства использования эталонного метода долгосрочной стабильности, такого как глубокая заморозка, можно выбрать изохронный план (измерение всех проб в конце исследования в одной серии), чтобы ограничить влияние аналитических отклонений между сериями.

Рекомендация: исследования стабильности должны сопровождаться строгим внутренним контролем качества и коррекцией систематических ошибок, чтобы свести к минимуму потенциальное влияние аналитической ошибки.

Рекомендация: измерения следует проводить как минимум дважды, чтобы ограничить влияние аналитической случайной ошибки. Среднее значение результатов повторных измерений считается лучшей оценкой истинного значения.

Рекомендация: для всех субъектов могут быть использованы фиксированные временные точки. Для достижения верного уравнения нестабильности необходимо как минимум пять временных точек.

Оценка исследования

После анализа проб данные следует проверить на наличие грубых ошибок. Ошибки повторных измерений можно оценить, сравнивая коэффициент вариации (CV%) с обычным коэффициентом вариации используемого анализатора (CVa %). Повторы с CV%, превышающим CVa % более чем в три раза, следует просмотреть и, в случае подозрения на ошибку, устранить. Если количество выбросов в эксперименте превышает 5% от общего числа проб, аналитические характеристики следует тщательно проанализировать.

Вычисленное среднее значение повторных результатов впоследствии будет использоваться в качестве наилучшей оценки истинного значения для дальнейшей статистической оценки.

Потеря стабильности аналита определяется как разница между значением базовой пробы (t₀) и значением каждого последующего тестовой пробы (t_x). Для сравнения наблюдаемой разницы с допускаемыми погрешностями и для облегчения сравнения величин относительная разница выражается в процентах (PD%) по формуле

t_x — Средняя концентрация исследуемой пробы n за время x; t₀ — средняя концентрация базальной пробы n.

Корректировку уравнения нестабильности можно произвести с помощью регрессионного анализа с использованием поправки метода наименьших квадратов. Уравнение нестабильности не содержит коэффициента пересечения с нулем, поскольку подразумевается, что базовая выборка сама по себе не имеет нестабильности. Следовательно, уравнение регрессии должно пройти через начало координат, также известное как «Регрессия через начало координат» (RTO). В этом случае степень согласия рассчитывается с использованием «простого R²» [46], который рассчитывает остатки относительно нуля, а не среднего значения данных. Их интерпретация эквивалентна интерпретации коэффициента детерминации (R²). Следует соблюдать осторожность, поскольку даже при разрешении принудительной регрессии через начало координат не все статистические пакеты действительно вычисляют простой R².

Аппроксимация RTO линейной моделью, наблюдаемая в большинстве публикаций, дает уравнение первой степени с одним коэффициентом (наклон; β) и без перекреста:

PD% = β × время (ч).

Эта модель облегчает понимание и возможность переноса результатов, но, возможно, не является наиболее подходящей. Из графического обзора линейной модели целесообразно оценить различные модели подгонки (полиномиальную, экспоненциальную), сравнивая увеличение коэффициента детерминации (простой R²), отражающего степень соответствия регрессионной модели. Для понимания результатов исследования может быть очень полезным графическое представление, отображающее зависимость PD% от времени на диаграмме рассеяния (рис. 1).

Рис. 1. Графическое представление процентной разницы (PD%) относительно времени хранения (часы).

Оценка уравнения неустойчивости методом регрессии через начало координат. Линейная модель с доверительным интервалом для наклона. ПДВ — предельно допустимая погрешность; SL — предел устойчивости.

После определения соответствия уравнения нестабильности необходимо доказать, что уравнение не может быть случайным, используя проверку гипотезы и демонстрируя, что наблюдаемый наклон не равен нулю на данном уровне значимости. Распространенным методом для этого является t-критерий, использующий стандартную ошибку наклона. Это также позволяет рассчитать доверительный интервал наклона, что удобно для переноса уравнения неустойчивости и для оценки качества исследования. Небольшие эффекты нестабильности будет трудно продемонстрировать, поскольку потребуется больший размер выборки. Если проверка гипотезы незначительна, сложно определить, нет ли потери стабильности или же конструкция слишком слаба, чтобы ее продемонстрировать.

Следует отметить, что рассчитанное уравнение неустойчивости служит скорее поясняющей, чем прогнозирующей моделью. Экстраполяция полученного уравнения нестабильности за пределы исследуемого периода времени не рекомендуется как в случае намерения продемонстрировать отсутствие потери стабильности за пределами максимального изученного времени хранения, так и в случае оценки будущей нестабильности. Если требуется дополнительное время хранения, необходимо провести новый эксперимент.

Как только проверка гипотезы докажет, что модель указывает на потерю стабильности, важно взглянуть на степень соответствия, обозначенную простым R². Желателен простой R²>0,7.

Чтобы выявить межиндивидуальную вариацию, мы рекомендуем провести графический анализ результатов, включая отдельную визуализацию каждого субъекта (рис. 2). Результаты следует нанести на диаграмму рассеяния, где PD% отложен по оси ординат (ось Y), а время хранения — по оси абсцисс (ось X), представляя каждого пациента, исследуемого с различным маркером. Индивидуальные уравнения регрессии обычно демонстрируют некоторую тенденцию к разбросу во времени, поскольку межиндивидуальная вариация проявляется в небольших изменениях наклона. Любой субъект с явными отклонениями от тенденции к регрессу должен побудить к продолжению исследования подобных результатов (например, аномальной клеточной структуры, использования лекарств и т.д.). Эти случаи можно считать выбросами только при условии, если они наблюдаются у субъекта чрезвычайно редко, как исключение по сравнению с остальной частью исследуемой популяции. Если наблюдается значительная часть субъектов со схожим поведением, следует заподозрить наличие неконтролируемой переменной нестабильности.

Рис. 2. Графическое представление процентной разницы (PD %) во времени (часы).

Индивидуальные кривые нестабильности для каждого субъекта.

Результат исследования стабильности конкретного аналита должен указывать на уровень значимости уравнения нестабильности и силу связи между временем хранения и PD%. Результаты рекомендуется выражать следующим образом:

— Если уравнение нестабильности статистически значимо (p<0,05) и имеет достаточную силу (простой R²>0,7), после применения линейной модели укажите: «В этих условиях ожидается увеличение/снижение аналита на n % в час» до х часов (максимальный изучаемый момент времени хранения)».

— Если уравнение нестабильности статистически значимо (p<0,05) и имеет достаточную силу (простой R²>0,7), после применения нелинейной модели указать: «В этих условиях происходит нелинейное увеличение/уменьшение концентрации аналита наблюдалось с течением времени» и в качестве примера укажите степень ухудшения состояния в выбранные моменты времени.

— Если полученный наклон не отличается от нуля (p>0,05), укажите: «В этих условиях не ожидается значительной потери стабильности аналита в течение x часов (максимальный изученный момент времени хранения)».

— Если полученный наклон значительно отличается от нуля, но полученный простой R²<0,7, укажите: «В этих условиях ожидается возможное увеличение/уменьшение содержания аналита на n % в час в течение x часов (максимальный изученный момент времени хранения), и нуждается в подтверждении».

Чтобы получить предел устойчивости (SL), полученный из уравнения нестабильности, необходимо определить максимально допустимую погрешность (МДП). SL соответствует расчетному времени хранения, где PD%=ПДВ , с использованием полученного уравнения нестабильности. Графически это соответствует нахождению соответствия по оси абсцисс линии ПДВ, отмеченной по оси ординат (рис. 1). При определении пределов устойчивости необходимо учитывать следующее:

— Уравнение нестабильности представляет собой среднее поведение исследуемых субъектов/пациентов. Доверительный интервал уравнения, рассчитанный с использованием стандартной ошибки наклона, представляет собой только изменчивость модели, связанную со статистической выборкой. Его не следует использовать для прогнозирования фактического ухудшения состояния данной пробы.

— Экстраполяция уравнения неустойчивости за пределы исследуемого временного интервала не рекомендуется.

— Спецификации ПДВ преаналитического ухудшения должны быть связаны с предполагаемым использованием лабораторных результатов и должны соответствовать аналитическим характеристикам качества. Выбор нижнего предела стабильности может повысить точность результатов, но предполагает изменения в лабораторной логистике, что повлечет за собой увеличение затрат. На 1-й стратегической конференции EFLM были определены три модели для выбора характеристик аналитических характеристик в следующем порядке значимости [47]: клиническая значимость, биологическая вариация и современное состояние (state-of-the-art). Мы рекомендуем использовать спецификации, полученные из исследования EuBIVAS (https://biologicalvariation.eu) [48].

Рекомендация: Определение выбросов должно основываться на большом коэффициенте вариации повторных измерений.

Рекомендация: Потеря стабильности должна быть выражена как относительная разница между значением базовой выборки и значением каждого последующего тестовой пробы в процентах (Процентная разница, PD %).

Рекомендация: Корректировку среднего уравнения глобальной нестабильности можно выполнить с помощью регрессионного анализа с использованием поправки метода наименьших квадратов без коэффициента пересечения (регрессия через начало координат). Если нелинейная аппроксимация существенно не улучшает степень согласия, предпочтение отдается уравнению первой степени.

Рекомендация: Межиндивидуальные различия следует исследовать путем графического сравнения индивидуальных показателей.

Заключительные замечания

Предоставленные рекомендации предназначены для оказания помощи поставщикам медицинских изделий для диагностики in vitro и лабораториям в разработке и интерпретации исследований стабильности в соответствии с правилами аккредитации производства и клинических лабораторий. Эта рукопись находится в свободном доступе для сообщества медицинских лабораторий и особенно для научных обществ, которые могут оказать большую помощь в ее разработке и распространении.

EFLM WG-PRE хотела бы призвать поставщиков и лаборатории проводить и публиковать новые стандартизированные исследования стабильности при различных привычных условиях работы и хранения. Представление всех данных в форме уравнения средней нестабильности необходимо для обеспечения их качества. Мы уверены, что эта рекомендация поможет направить этот процесс.

Выражение благодарности:

Благодарности: Этот документ от имени Рабочей группы по преаналитической фазе (WG-PRE) Европейской федерации клинической химии и лабораторной медицины (EFLM) был представлен, обсужден, рассмотрен и одобрен на пленарных заседаниях группы, чьи действующие члены перечислены на сайте EFLM: https://www.eflm.ес/сайт/страница/а/1156.

Финансирование исследований: Не заявлено.

Вклад авторов: Все авторы приняли на себя ответственность за все содержание этой рукописи и одобрили ее представление.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Информированное согласие: Не применимо.

Этическое одобрение: Не применимо.

Перевод: О.С. Плеханова

Редактор перевода: А.В. Мошкин