В марте 1959 г. во Владивостоке произошла крупная вспышка неизвестной инфекционной болезни, охватившая более 300 человек за период 3—5 дней [1]. Заболевание у большинства пациентов протекало тяжело. В начале болезни были ярко выражены характерные для скарлатины симптомы: мелкоточечная сыпь на гиперемированном фоне кожи, ангина, бледность носогубного треугольника, увеличение подчелюстных лимфатических узлов, «малиновый» кончик языка. Через несколько дней отмечались желтушность кожных покровов, увеличение печени, боль в суставах и животе, что опровергало диагноз скарлатины [1—4]. На основании клинико-эпидемиологических данных, полученных при изучении вспышки заболевания, и анализа литературы было сделано заключение, что инфекция является неизвестной в медицине самостоятельной нозологической формой. Так как клинические проявления новой болезни схожи со скарлатиной, было принято решение назвать ее дальневосточной скарлатиноподобной лихорадкой (ДСЛ) [1]. И только спустя 7 лет, в 1966 г., В.А. Знаменский, путем самозаражения бактериями псевдотуберкулеза, доказал, что возбудителем ДСЛ является Y. pseudotuberculosis [5]. С тех пор изучение бактерий этого вида иерсиний напрямую связано с инфекционным процессом особой клинической формы псевдотуберкулеза — ДСЛ [6].

Значительную роль в вирулентности Y. pseudotuberculosis играют токсины возбудителя [7—9]. К настоящему времени есть сведения о нескольких белковых токсинах этих бактерий: термостабильном летальном токсине (ТСТ), термолабильном летальном токсине (ТЛТ), цитотоксине (YopE — Yersinia outer protein — белке III системы секреции), суперантигене (YPM — Y. pseudotuberculosis mitogen), цитотоксическом некротизирующем факторе (CNFY — cytotoxic necrotizing factor Yersinia) [7—17].

Первое сообщение о термолабильном токсическом веществе Y. pseudotuberculosis (ТЛТ) было опубликовано в России в 1927 г. [18]. Бульон, в котором выращивали бактерии псевдотуберкулеза, содержал вещество, являющееся высокотоксичным для лошадей, действие его нейтрализовалось антитоксической иммунной сывороткой. В 1996 г. российскими учеными был разработан трехступенчатый способ очистки термолабильного токсина [7, 19]. Было установлено, что белок имеет мол. массу 200 кДа, при температуре 56 °C в течение 30 мин теряет биологическую активность [10]. Изучение биологических свойств ТЛТ позволило установить, что он обладает широким спектром действия на моделях не только млекопитающих, но и других организмов, включая моллюсков и даже растений. В частности, было выявлено дермонекротическое действие ТЛТ, которое нейтрализовалось специфичными антителами. При инкубации с макрофагами перитонеальной полости мышей ТЛТ резко снижал их окислительную активность, что приводило клетки к гибели [20]. Было показано, что ТЛТ нарушает процесс эмбриогенеза морского ежа [11]. При воздействии на клетки растений женьшеня (Panax ginseng) ТЛТ индуцировал экспрессию защитных генов растения — фенилаланинаммоний-лиазы (PAL) и β-1,3-глюканазы (Pg-glu1), в 2—4 раза по сравнению с контрольными клетками уже на первые сутки. Поскольку белки PAL и Pg-glu1 являются специфичными маркерами, характеризующими иммунный ответ клеток женьшеня, обнаруженный факт продукции этих белков свидетельствует о быстром распознавании токсина и индукции защитного ответа растительными клетками [21].

Для молекулярной идентификации ТЛТ, очищенный с помощью ионно-обменной хроматографии на колонке с DEAE-целлюлозой и высокоэффективной гельфильтрации на колонке Superose 6 препарат белка, выделенного из штамма Y. pseudotuberculosis 2517 (рис. 1),

Семейство цитотоксических некротизирующих факторов объединяет ряд высокомолекулярных бактериальных цитотоксинов, включающее, помимо CNFY Y. pseudotuberсulosis, три токсина (CNF1, CNF2, CNF3) Escherichia coli. Первым в 1983 г. был выделен CNF1 E. coli [23]. Далее у штаммов кишечной палочки были обнаружены CNF2 и CNF3. Ген токсина СNF1 Е. coli, сnf1, локализован на хромосоме и входит в состав последовательности «островка патогенности» HPI [24]. Ген cnfE3 также находится в составе хромосомной ДНК E. coli, а ген cnfE2 является частью плазмиды этих бактерий. При сравнении их последовательностей обнаружено, что гены cnfE2 и cnfE3 идентичны cnfE1 на 85 и 70% соответственно [25, 26].

Наиболее детально был изучен токсин СNF1 Е. coli. Белок СNF1 синтезируется в виде гидрофильного полипептида [27, 28], на полярных концах аминокислотной последовательности которого находятся 2 домена [29]. Один — N-терминальный, схож по аминокислотному составу с митогеном, продуцируемым Pasteurella multocida, который вызывает у свиней развитие прогрессирующего атрофического ринита. Карбоксильный домен длиной около 100 аминокислот имеет гомологию с дермонекротическим токсином (DNT) и незаменим для цитотоксической активности CNF1.

Немецкие ученые Z. Knust и G. Schmidt [30] в 2010 г. описали тканеспецифические особенности токсинов семейства CNFs, определяемые субстратной специфичностью к рецепторам клеток, и определили общий для всех представителей семейства механизм действия. После взаимодействия рецепторспецифичного аминоконцевого домена с поверхностным рецептором токсин попадает в клетку, где происходит отщепление карбоксильного домена CNF, обладающего активностью против эукариотических малых ГТФаз, относящихся к Rho-семейству. В результате активности карбоксильного домена CNF происходит дезаминирование остатка глутамина в позиции 63 малой ГТФазы с образованием глутаминовой кислоты, что вызывает образование конститутивно активного белка, не способного гидролизовать ГТФ [25, 31]. С учетом важнейшей роли малых ГТФаз Rho-семейства в регуляции клеточных функций такая модификация существенно влияет на физиологию эукариотической клетки. В частности, стимулированная активностью CNF токсина конститутивная активность Rho-белков приводит к репликации клеточной ДНК без сопутствующего клеточного деления — образованию эффекта «многоядерности». Многоядерная клетка образуется в результате митоза (или серии митозов), который не сопровождается цитотомией (образованием дочерних клеток) [32]. Эффект был исследован на разных линиях клеточных культур СНО, Vero, HeLa и Hep-2 [23, 27].

В 2002 г. впервые было опубликовано сообщение о том, что Y. pseudotuberculosis продуцирует токсин, биологическая активность которого в культуре клеток Hep-2 была сходна с действием CNF1 E. сoli [16]. В работе представлены данные, полученные при исследовании 33 штаммов Y. psudotuberculosis серотипов IA, IB, II, III и V, среди которых многоядерность в эукариотических клетках вызывали 2 штамма Y. pseudotuberculosis III серотипа — YPIII и IP2666c. После удаления плазмиды вирулентности у штамма YPIII действие токсина на клетки Hep-2 сохранялось и не подавлялось антителами, способными нейтрализовать CNF1 E. сoli. Остальные исследованные штаммы Y. pseudotuberсulosis, в том числе III серотипа, имели делеции внутри гена cnfY и не проявляли биологическую активность при воздействии на культуру клеток. Ген, способный продуцировать активный токсин, был секвенирован и анализ сравнения показал, что нуклеотидная последовательность гена cnf Y. pseudotuberculosis была на 65,1% идентична последовательности гена cnf E. сoli. Авторы также сравнили нуклеотидную последовательность выявленного гена cnfY у штамма YPIII с последовательностью гена cnf штамма СО92 Y. pestis, которые оказались идентичными более чем на 99%. Однако у гена cnf Y. pestis была выявлена делеция размером 931 п.н.

Исследование структуры гена cnfY в основном проводили на модели токсина CNFY, продуцируемого штаммом YPIII [29, 33, 34]. Очищенный препарат CNFY вызывал специфическую активацию одного представителя ГТФаз Rho-семейства, ГТФазы RhoA, которая приводила к морфологическим изменениям в клетках HeLa. В то же время активации других ГТФаз этого семейства, белков Rac1 и Cdc42, цитотоксин иерсиний не вызывал. В отличие от CNF1 E. coli, CNFY не вызывает формирование филоподий или ламеллоподий, хотя и приводит к изменениям в цитоскелете [33]. Исследования на разных клеточных линиях показали, что CNFY не взаимодействует с рецепторами клеток линий Сасо-2 и СНО-К1, на которые реагирует CNF1 E. сoli. Однако с рецепторами клеток линии HeLa, Hep-2 и НЕК293 связывались оба токсина. Помимо этого, CNFY способствует адгезии бактерий псевдотуберкулеза на клетках HeLa, и снижает восприимчивость клеток к их отслойке, индуцированной трипсином. [34]. Гены белков семейства CNFs, в том числе и CNFY, имеют сходство в N-терминальной последовательности с геном токсина Pasteurella multocida (PMT) [29]. Этот домен способствует проникновению и доставке C-терминального домена в цитозоль эукариотической клетки. В результате исследований с клеточными ингибиторами была определена дополнительная новая функция этой области в модуляции ответов токсинов при изменении рН во время интоксикации и доставки С-каталитического домена в цитозоль [35]. Показано, что токсины CNFY и CNF1 индуцируют апоптоз в клетках рака простаты человека (LNCaP) посредством активации белка RhoA [36].

Помимо исследований на эукариотических клетках, действие токсина изучали в процессе развития инфекции in vivo [37—39]. При условиях оптимальной температуры и рН среды было выявлено, что CNFY играет роль в вирулентности возбудителя, способствуя его распространению в лимфатических тканях и органах инфицированных мышей линии BALB/c, индуцирует воспалительные реакции, и это приводит к обширному разрушению тканей, изменению кишечной микрофлоры и дисбактериозу [40]. При действии белка CNFY у животных появлялись некротические участки в инфицированных тканях, а также значительно снижалось количество фагоцитов и натуральных киллеров в селезенке [37]. Таким образом, исследования CNFY полностью подтвердили ранее опубликованные результаты, касающиеся активности ТЛТ [7, 10, 20]. Удаление гена cnfY из генома Y. pseudotuberculosis, продуцирующего этот токсин, приводило к нарушению способности бактерий мигрировать в брыжеечные лимфатические узлы, печень, селезенку и вызывать гибель мышей. С другой стороны, подавление функции CNFY увеличивает интерферон-γ-опосредованные ответы у организма и вызывает его иммунотолерантность, при которой иммунная система устойчиво воспринимает чужеродный антиген как собственный и не отвечает на него. Процесс сопровождается преждевременным перепрограммированием при транскрипции патогена к его персистирующему состоянию [40].

Цитотоксин CNFY является эффективным иммуногеном [38, 39]. Обнаружено, что Y. pseudotuberculosis, продуцирующие CNFY, являются вирулентными при аэрозольном заражении мышей. У животных, вакцинированных CNFY, полученным при клонировании гена cnfY, вырабатывался иммунитет. Однако эти антитела не защищали мышей при заражении их вирулентным штаммом Y. pseudotuberculosis, содержащим ген токсина с делециями. Отдельным направлением исследований является изучение взаимодействия CNFY с другим токсинами Y. pseudotuberculosis, в частности, кодируемыми плазмидой вирулентности pYV токсинами Yop. Получены данные, что наличие токсина CNFY в штаммах Y. pseudotuberculosis значительно усиливает транслокацию белков Yop посредством активации ГТФ-связывающих белков клеточной мембраны [37, 41]. С другой стороны, активность CNFY фактически альтернативна активности одного из Yop-токсинов, токсина YopE: YopE, кодируемым геном, расположенным на плазмиде вирулентности pYV: YopE инактивирует ГТФ-связывающие белки, в то время как CNFY переводит их в конститутивно активное состояние [42].

Все процитированные работы по характеристике активности CNFY были проведены с белком, выделенным из штамма YPIII (последовательность гена cnfY штамма YPIII зарегистрирована в базе данных GenBank под номером AF324349). Среди изолятов Y. pseudotuberculosis, изолированных на территории РФ, также встречаются штаммы, несущие полноразмерный ген cnfY. В частности, полноразмерный ген cnfY длиной 3045 п.н. был обнаружен у штамма Y. pseudotuberculosis PV696, выделенного из объекта окружающей среды на территории Приморского края во время вспышки ДСЛ. cеквенирование амплифицированного варианта гена этого штамма показало, что он на 99,9% идентичен гену cnf Y. pseudotuberculosis, штамма YPIII, представленному в базе данных GenBank [16], и содержит 3 точечные мутации: A₅₇₈G, A₉₁₄G, G₁₁₈₃A. Все мутации являются несинонимическими, в результате этих мутаций в последовательности белка имеются аминокислотные замены Asn₁₉₂Ser, Glu₃₀₄Gly, Ala₃₉₄Thr. При регистрации последовательности гена цитотоксина в базе данных GenBank было присуждено название «аллель 2 гена cnf Y. pseudotuberculosis (KR028010)». Несмотря на замены, активность российского варианта CNFY полностью совпадает с активностью, описанной для CNFY из штамма YPIII, включая феномен появления многоядерных клеток (рис. 2)

На сегодняшний день в России псевдотуберкулез в виде ДСЛ встречается преимущественно в виде спорадических случаев. Вспышек заболевания, характерных для 1950—1980-х годов, в настоящее время не фиксируется. Причины этого явления носят скорее эпидемиологический характер и в данном обзоре не рассматриваются. Тем не менее бактерии продолжают выделять из продуктов питания растительного происхождения, объектов внешней среды и мелких мышевидных грызунов. Так что опасность новой волны заболевания продолжает сохраняться, что обусловливает необходимость продолжения работ по характеристике штаммов, вызывающих ДСЛ. Как показали наши исследования, ген cnfY выявлен во всех штаммах Y. pseudotuberculosis, изолированных в РФ в период 1966—2015 гг. из разных источников, в том числе от больных с диагнозом ДСЛ [4]. Интересно и важно, что большинство изолятов, в том числе все изоляты, выделенные от больных с ДСЛ, содержат значительные делеции в гене cnfY — в области фрагмента, кодирующего карбоксильный Rho-связывающий домен, имелась протяженная делеция размером 946 п.н., а в области гена, кодирующего аминотерминальный домен, имелась вторая делеция, размером 300 п.н. [43, 44]. Помимо этих двух делеций, аллель cnfY, доминирующий среди российских изолятов, содержит ряд нуклеотидных замен, одна из которых — Т₃₅₅G приводит к образованию стоп-кодона. Нуклеотидная последовательность этого варианта гена токсина зарегистрирована в базе данных GenBank под названием «аллель 1 гена cnf Y. pseudotuberculosis (KR028011)».

Таким образом, как показывают исследования, вариант гена, кодирующего полнофункциональный белок CNFY, содержат единичные штаммы бактерий псевдотуберкулеза. Однако изоляты, которые имеют аллель 1, несущий существенные делетированные области и замены, способны вызывать такую тяжелую форму псевдотуберкулеза, как ДСЛ. Эти факты провоцируют очевидные вопросы: Почему Y. pseudotuberculosis, выделенные от людей с диагнозом ДСЛ, содержат аллель cnfY, кодирующий инактивированный токсин? И существует ли вероятность, что штамм, ассоциированный с ДСЛ и несущий полноразмерный ген цитотоксина, может циркулировать в природных очагах? В поисках ответов на поставленные вопросы нами было проведено исследование, в котором in vitro на культуру клеток Hep-2 одновременно действовали CNFY и бактериями псевдотуберкулеза, изолированными от больного ДСЛ [46]. В результате мы наблюдали не только многоядерность, но и формирование выраженных филоподий и ламеллоподий по периметру клеток (рис. 3),

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Тимченко Н.Ф. — e-mail: ntimch@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-6051-292X

Псарева E.K.— е-mail: ekaterinapsareva@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-4215-7319

Ермолаева С.A. — e-mail: drermolaeva@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-3396-6816

Автор, ответственный за переписку:

Псарева Е.К. — е-mail: ekaterinapsareva@gmail.com

Как цитировать:

Тимченко Н.Ф., Псарева Е.К., Ермолаева С.А. Цитотоксический некротизирующий фактор Yersinia pseudotuberculosis. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(4):158-164. https://doi.org/10.17116/molgen201937041