Development and testing of the real-time polymerase chain reaction for identification and quantitative determination of the bovine respiratory syncytial virus

Nefedchenko A.V.; Glotov A.G.; Koteneva S.V.; Glotova T.I.

doi:https://doi.org/10.17116/molgen202038031145

Закрыть метаданные

Рекомендуем статьи по данной теме:

Нестабильность генома возбудителя холеры: роль в эволюции патогенности, лекарственной устойчивости и адаптации к меняющейся среде обитания. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2025;(2):3-13

Коронавирусы в патофизиологии человека: краткая история пандемии COVID-19. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2025;(4-2):55-63

Резюме / Abstract:

ВВЕДЕНИЕ

Респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (РСВ КРС), по международной классификации Bovine orthopneumovirus, является одним из важнейших этиологических агентов респираторных болезней телят. В настоящее время необходимы быстрые и надежные методы выявления и оценки концентрации этого возбудителя.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ

Разработка полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для выявления и количественной оценки РНК РСВ КРС и с ее помощью изучение количества вирусного генома в органах респираторного тракта у больных животных во время вспышек болезни.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Мишенью для амплификации служил ген протеина нуклеокапсида (N) вируса. мРНК гена GAPDH КРС была выбрана в качестве референсного гена. Для расчета количества вируса и гена GAPDH использовали панель положительных контрольных образцов с известной концентрацией. Количественную оценку концентрации вирусной РНК в пробах биоматериала проводили относительно уровня мРНК гена GAPDH крупного рогатого скота.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Аналитическая чувствительность ПЦР составила 1·10³ геномных эквивалентов в 1 см³ с высокой специфичностью и воспроизводимостью. Исследовали 273 пробы биологического материала от животных с респираторной патологией. Геном вируса выявили в 19,4% проб. РНК вируса чаще выявляли в легких — 10,61% положительных проб, реже — в слизистой оболочке трахеи и бронхов, а также в легочных лимфатических узлах — по 0,73% положительных проб. Концентрация вируса в пробах биоматериала была различной. Максимальные концентрации генома вируса определяли в легких (1,3±0,5—4,8±0,47 log₁₀ копий РНК BRSV/GAPDH).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанный набор может быть использован для количественного определения концентрации респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота при изучении патогенеза болезни, эффективности вакцин или противовирусных препаратов для животных.

Ключевые слова / Keywords:

крупный рогатый скот

респираторно-синцитиальная инфекция

респираторно-синцитиальный вирус

количественная полимеразная цепная реакция

геном

Авторы / Authors:

Нефедченко А.В.

ФГБУН «Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий» РАН (СФНЦА РАН) Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока

Глотов А.Г.

Котенева С.В.

Глотова Т.И.

Дата поступления:

21.06.2019

Дата принятия в печать:

15.12.2019

Закрыть метаданные

Введение

Респираторные болезни причиняют экономический ущерб молочному скотоводству, вызывая гибель или снижение скорости роста животных, увеличивая затраты на лечение, проведение диагностических и профилактических мероприятий [1—3].

Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) крупного рогатого скота (КРС), являющийся по международной классификации Bovine orthopneumovirus или Bovine respiratory syncytial virus (BRSV) одним из этиологических агентов респираторных болезней, относится к семейству Pneumoviridae, роду Orthopneumovirus [4]. Респираторно-синцитиальная инфекция (РСИ) КРС регистрируется во всех странах мира, где развит интенсивный тип ведения животноводства [5, 6].

У восприимчивых животных вирус вызывает бронхиолиты, бронхиты, интерстициальную пневмонию и эмфизему легких [5, 7].

Впервые о выявлении РСИ КРС в нашей стране было сообщено в 1975 г. [8]. Многие исследователи в своих работах уделили большое внимание изучению особенностей распространения болезни и разработке средств и методов ее диагностики [9—12].

Актуальными являются определение эпизоотической ситуации по РСИ КРС в крупных молочных животноводческих хозяйствах, особенно с наличием импортированного скота, исследование тропизма вируса к органам респираторного тракта и его количественная оценка в них. Такие исследования необходимы для оптимизации противоэпизоотических мероприятий, изучения эффективности вакцин и противовирусных препаратов для животных [13—16].

Известно, что РСВ КРС проявляет близкое родство с РСВ человека и вызывает у телят клинические симптомы и патологические изменения, сходные с таковыми у детей [7, 16].

В настоящее время надежной модели РСИ человека не существует, хотя предпринимались попытки воспроизведения инфекции на шимпанзе [16], крупном рогатом скоте [17, 18], овцах [18], хлопковых крысах [19], мышах [20, 21].

Предполагается, что КРС может представлять собой альтернативную модель инфекции человека и использоваться не только для изучения конечной концентрации вируса в легких, как у хлопковых крыс или обезьян, но и для оценки динамики изменения клинических симптомов и концентрации вируса на каждой стадии болезни [20].

Количественная оценка накопления РСВ КРС в легких затруднительна по причине слабого размножения вируса в культуре клеток. Перспективным в этом направлении может быть использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. В доступной зарубежной литературе есть сообщения об оценке титра вируса при искусственном заражении телят-гнотобионтов только в назофарингеальных смывах или бронхоальвеолярном лаваже [22, 23], о поражении легких вирусом судили по результатам иммуногистохимического исследования легочной ткани [24—26].

С помощью количественной ПЦР возможно определить концентрацию возбудителей, которые плохо размножаются в культурах клеток или легко разрушаются. При этом для оценки сохранности нуклеиновых кислот в пробах применяют скрининг эталонных генов: 18S рРНК, GAPDH, ACTB, PRKG1, TBP и др. [27], экспрессия которых может варьировать в зависимости от вида ткани и условий эксперимента.

В настоящее время в качестве эталона (положительного контроля) для количественной оценки экспрессии генов в ПЦР используется ген Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Уровень мРНК GAPDH в различных органах КРС достаточно стабилен [27], поэтому мы использовали его для количественной оценки РНК РСВ КРС.

Цель исследования — разработка ПЦР в реальном времени для выявления и количественной оценки РНК РСВ КРС и с ее помощью изучение количества вирусного генома в органах респираторного тракта у больных животных во время вспышек болезни.

Материал и методы

Исследования проводили на крупных молочных комплексах (мегафермы) в момент вспышек массовых респираторных болезней животных. Всего исследовали 273 пробы биоматериала, отобранные случайным образом от телят, возраст которых составлял от 10 дней до 6 мес: 171 пробу легких, 45 — носовых выделений, 24 — экссудата из трахеи, бронхов и носовых синусов, 14 — слизистой оболочки бронхов и трахеи, 10 — лимфатических узлов и 9 — бронхов, отобранных от павших и вынужденно убитых с диагностической целью животных. Пробы доставляли в замороженном состоянии или транспортной среде в течение не более 12 ч с момента отбора в лаборатории, в которой хранили при –80 ^оС.

Перед исследованием пробы биоматериала растирали в фарфоровых ступках со стерильным песком, гомогенизировали и готовили 10% суспензии на физиологическом растворе, которые центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин и исследовали в ОТ-ПЦР. Густые пробы носовых выделений и экссудата перед центрифугированием разводили стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:5. Для выделения РНК использовали по 100 мкл осветленного супернатанта.

В работе использовали штамм вируса РСВ КРС РС-Б, полученный из БелНИИЭВ им. С.Н. Вышелесского. Концентрация вируса была определена методом титрования в первично-трипсинизированной культуре легких теленка и составила 10^3,⁵ ТЦД₅₀/см³.

Экстракция РНК и обратная транскрипция

РНК выделяли из 100 мкл гомогенизата органов или носовых выделений с помощью набора Литех (Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Очищенную РНК ресуспендировали в 50 мкл РНК-буфера. Для проведения обратной транскрипции использовали 10 мкл выделенной РНК. Реакцию проводили с помощью набора Реверта-L (Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. После проведения реакции объем пробы составлял 40 мкл.

Праймеры и зонды

Подбор праймеров и зондов осуществляли с использованием нуклеотидных последовательностей, полученных из международной базы данных GenBank. При выравнивании полученных последовательностей, а также анализе и расчете праймеров и зондов, изучении их специфичности применяли компьютерные программы Vector NTI 9.0 (Informax, США) и интернет-ресурсы базы данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) в режиме онлайн. В качестве внутреннего контроля использовали праймеры и зонды к мРНК гена GAPDH крупного рогатого скота (табл. 1).

Таблица 1. Праймеры и зонды, использованные в работе для проведения ПЦР в режиме реального времени

Вид	Ген	Последовательности	Размер (п.н.)	Источник
BRSV	Протеин нуклеокапсида (N)	5-ATGCTGCAGGACTAGGTATAATGG-3 5-ACACTGTAATTGATGACCCCATTCTC-3 5-(FAM) ATGCTGCCAAAGCATATGCGGAACA CA-3(BHQ1)	120	Собственная разработка
Bos taurus	GAPDH	5-GATGGTGAAGGTCGGAGTGAAC-3 5-GTCATTGATGGCGACGATGT-3 5-(ROX)-CTGGTCACCAGGGCTGCTT-3(BHQ2)	100	[27]

Постановка ПЦР

ПЦР проводили в 30 мкл смеси, содержащей 5 мкл кДНК, 10 pMol каждого праймера и зонда, готовую смесь реактивов БиоМастер ПЦР-РВ («Биолабмикс», Россия). Программа амплификации: 5 мин 95 °C, затем 45 циклов 95 °C 15 с и 60 °C 1 мин.

Положительные контрольные образцы

Положительные контрольные образцы были получены в результате клонирования синтезированных ДНК-фрагментов, несущих вирусоспецифическую вставку, в плазмиду pCR2.1 (Invitrogen, США) с использованием для трансформации клеток Escherichia coli линии TOP 10 (Invitrogen).

Определение концентрации ДНК

Для определения концентрации плазмидной ДНК применяли коммерческий набор реагентов Quant-iT DNA HS (Invitrogen) и флуориметра QUBIT (Invitrogen).

Количественная оценка вирусной РНК

Для расчета количества РНК в образце была построена стандартная кривая амплификации с 10-кратными разведениями положительных контрольных образцов для генов гликопротеина N и GAPDH с известной концентрацией. Количество РНК вируса и GAPDH в образце оценивали путем сопоставления Ct образца со стандартной кривой и выражали в log₁₀ копий РНК вируса на 10⁵ копий GAPDH (log₁₀ BRSV/GAPDH) [15].

Верифицикация результатов

Для верификации результатов дополнительно проводили исследование проб биоматериала тест-системой на основе ПЦР для диагностики РСИ КРС, разработанной в ИЭВСиДВ СФНЦА РАН: свидетельство о Госрегистрации №ПВР-1-8.9/02499. Данная тест-система была разработана для выявления фрагмента гена гликопротеина F-вируса.

Результаты и обсуждение

В табл. 1 приведены нуклеотидные последовательности праймеров и зондов. Специфичность выбранных олигонуклеотидов на этапе расчетов анализировали, применяя программу nucleotide Blast NCBI. По результатам исследований, установили, что выбранные праймеры и зонды не имели гомологии с ДНК КРС и основными вирусами, участвующими в этиологии респираторных болезней: вирус инфекционного ринотрахеита (Bovine herpes virus type 1, BoHV-1), вирус вирусной диареи (Bovine pestivirus type A, B, H, (BVDV)), коронавирус (Bovine coronavirus, BoCV), риновирус (Bovine Rhinovirus, BoRV) и вирус парагриппа-3 (Bovine parainfluenza type 3 virus, PI-3).

Положительные контрольные образцы (ПКО) использовали для оценки эффективности прохождения ПЦР в реальном времени, для чего были приготовлены последовательные 10-кратные их разведения. Исследование проводили в трех повторностях. Разведения ПКО вносили по 5 мкл на реакцию. Чувствительность реакции для выявления гена нуклеопротеина N РСВ КРС составила 2,5·10³ геномных эквивалентов на 1 см³, а гена GAPDH — 1,2·10³ геномных эквивалентов на 1 см³ с сильной линейной зависимостью (R²) — 0,9873 и 0,9976 соответственно. Коэффициент воспроизводимости для разных разведений колебался от 0,32 до 3,57%, что свидетельствует о высокой эффективности реакции (табл. 2).

Таблица 2. Точность количественного определения ПКО BRSV и GAPDH

ПКО		Пороговый цикл (Ct) различных концентраций ПКО (log₁₀/см³)							R²
ПКО		9	8	7	6	5	4	3
BRSV	Ср. Ct±Ст.О.	13,39±0,39	15,55±0,55	18,92±0,30	22,82±0,20	24,70±0,12	28,99±0,86	33,84±0,66	0,9873
BRSV	КВ, %	2,88	3,54	1,60	0,86	0,49	0,32	0,65	0,9873
GAPDH	Ср. Ct±Ст.О.	16,74±0,60	19,47±0,46	22,26±0,58	26,45±0,46	29,44±0,32	32,71±0,37	35,76±0,31	0,9976
GAPDH	КВ, %	3,57	2,35	2,61	1,75	1,07	1,13	0,87	0,9976

Примечание. Начальная концентрация положительных образцов составила 2,5·10¹⁰ ГЭ/мл для BRSV, и 1,2·10¹⁰ ГЭ/мл для GAPDH. Среднее Ct±стандартное отклонение (Ст.О.). Коэффициент вариации (КВ).

С помощью тестирования 10-кратных разведений контрольного штамма РСВ КРС РС-Б с заранее определенной концентрацией, равной 10^3,⁵ТЦД_50/см³, была оценена эффективность реакции для количественной оценки концентрации вирусной РНК. Для этого приготовили 7 последовательных 10-кратных разведений вируса, из которых выделили РНК и исследовали в ПЦР, а ее результаты сопоставили с данными кривой разведений ПКО. Предел чувствительности реакции составил 10^0,⁵ТЦД_50/см³ (рисунок), что соответствовало 5 log₁₀ ПКО/см³.

Эффективность амплификации разведений штамма РС-Б относительно разведений ПКО.

График стандартной кривой разведений ПКО BRVS построен на основании среднего трех повторных измерений. Приведены коэффициент детерминации (R²) и уравнение регрессии кривой (у). + — пороговый цикл для разведений штамма РС-Б.

С использованием разработанной ПЦР исследовали 273 пробы биоматериала от животных. Вирус выявили в 53 пробах, что составило 19,4% (табл. 3).

Таблица 3. Результаты выявления вируса РСИ КРС методом ПЦР в пробах биоматериала различного происхождения (n=273)

Биоматериал	Количество исследованных проб/положительных	Количество положительных проб от количества исследованных, %	Концентрация вируса в пробе, log₁₀ копий РНК BRSV/GAPDH
Носовые выделения	45/6	2,2	1,5±0,75—2,1±0,25
Экссудат из трахеи, бронхов, носовых синусов	24/11	4,03	0,3±0,21—2,8±0,15
Слизистая оболочка трахеи и бронхов	14/2	0,73	0,3±0,21—1,3±0,21
Бронхи	9/3	1,1	0,5±0,03—1,2±0,29
Легкие	171/29	10,61	1,3±0,5—4,8±0,47
Легочные лимфатические узлы	10/2	0,73	0,1±0,03—0,3±0,03
Всего	273/53	19,4	0,6±0,28—2,08±0,23

Из данных табл. 3 видно, что геном вируса чаще выявляли в легких — 10,61% положительных проб, пробах трахеального и бронхиального экссудатов — 4,03%, носовых выделениях — 2,2% и бронхах — 1,1%. Реже вирус обнаруживали в слизистой оболочке трахеи и бронхов, а также в легочных лимфатических узлах — по 0,73% положительных проб. Концентрация вируса в пробах биоматериала различалась, что, возможно, свидетельствует о различных стадиях развития инфекции у животных, при которых они были отобраны. Максимальные концентрации генома вируса определяли в легких (1,3±0,5—4,8±0,47 log₁₀ копий РНК BRSV/GAPDH), носовых выделениях (1,5±0,75—2,1±0,25 log₁₀ копий РНК BRSV/GAPDH) и экссудате трахеи, бронхов и носовых синусов (0,3±0,21—2,8±0,15 log₁₀ копий РНК BRSV/GAPDH).

Результаты в 100% случаев совпадали с данными, полученными при исследовании этих же образцов биоматериала при помощи ранее разработанной тест-системы с электрофоретической детекцией продуктов амплификации.

При создании набора для ПЦР в реальном времени, позволяющего провести идентификацию и количественную оценку РНК РСВ КРС в пробах биоматериала от животных, нами был выбран ген оболочечного гликопротеина N-вируса, поскольку он является одним из наиболее консервативных генов. В качестве гена сравнения и контроля ПЦР использовали мРНК гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), поскольку она наиболее стабильно экспрессируется в легких КРС на высоком уровне. Обе реакции обладали высокой чувствительностью и воспроизводимостью. Коэффициент воспроизводимости для разных разведений колебался от 0,32 до 3,57%, что свидетельствует о высокой эффективности реакции (см. табл. 2).

С помощью тестирования 10-кратных разведений контрольного штамма РСВ КРС РС-Б с известной концентрацией была определена диагностическая чувствительность реакции. Концентрация вируса, равная 10^3,⁵ ТЦД_50/см³, соответствовала 8 log₁₀ ПКО, а концентрация 10^0,⁵ ТЦД_50/см³— 5 log₁₀ ПКО. Наши результаты в общем виде согласуются с данными зарубежных исследователей, сообщавших о высокой чувствительности количественной ПЦР, равной 0,1 ТЦД_50/см³при тестировании вакцинного вируса и проб транстрахеальных лаважей от больных телят [28, 29].

Ранее нами было изучено распространение вируса в органах респираторного тракта телят, больных РСИ, при помощи ПЦР в электрофорезном формате, однако концентрацию агента определить не удалось по причине ограничения метода [30]. В настоящей работе при помощи количественной ПЦР в режиме реального времени нами была предпринята попытка определения количества генома вируса в пробах, отобранных от больных телят случайным образом, без учета стадии развития инфекции.

В нашей работе максимальное накопление вируса происходило в легких и носовых выделениях, что подтверждает данные об его тропизме к интерстицию легочной ткани [5, 7]. Концентрация вируса в бронхах была ниже, чем в легких, что может быть связано с миграцией возбудителя со слизистой оболочки в ткань легких и вызванными деструктивными изменениями в ней. Косвенным подтверждением этому является наличие интерстициальной пневмонии и эмфиземы легких при вскрытии трупов обследуемых телят.

Заключение

Проведена работа по созданию набора компонентов для выявления и количественного определения РНК РСВ КРС в пробах биоматериала от животных при естественном заражении во время вспышек инфекции. В результате определения диагностической и аналитической чувствительности набора показано, что он обладает высокой специфичностью и чувствительностью, благодаря чему может быть использован для идентификации и определения количества РСВ КРС при изучении патогенеза болезни, эффективности вакцин или противовирусных препаратов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Литература / References:

Grandin T. Welfare Problems in Cattle, Pigs, and Sheep that Persist Even Though Scientific Research Clearly Shows How to Prevent Them. Animals. 2018;8:124. https://https://doi.org/10.3390/ani8070124
Delabouglise A, James A, Valarcher JF, Hagglünd S, Raboisson D, Rushton J. Linking disease epidemiology and livestock productivity: The case of bovine respiratorydisease in France. PLoS One. 2017;12(12):e0189090. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0189090
Шабунин С.В., Шахов А.Г., Черницкий А.Е., Золотарев А.И., Рецкий М.И. Респираторные болезни телят: современный взгляд на проблему. Ветеринария. 2015;5:3-13. https://doi.org/10.17116/rosakush20151514-8
Virus Taxonomy: 2018b Release. International Committee on Taxonomy of Viruses. https://talk.ictvonline.org/
Глотов А.Г., Петрова О.Г., Глотова Т.И., Нефедченко А.В., Татарчук А.Т., Котенева С.В. и др. Распространение вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота. Ветеринария. 2002;3:17-21.
Taylor JD, Fulton RW, Lehenbauer TW, Step DL, Confer AW. The epidemiology of bovine respiratory disease: What is the evidence for predisposing factors? Can Vet J. 2010;51:1095-1102. PMID: 21197200.
Valarcher J-F, Taylor G. Bovine respiratory syncytial virus infection. Vet Res. 2007;38:153-180. https://doi.org/10.1051/vetres:2006053
Гуненков В.В., Халенев Г.А., Сюрин В.Н. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция. М.: Животноводство и ветеринария. 1975;8:70-76.
Глотова Т.И., Кунгурцева О.В., Глотов А.Г., Строганова И.Я., Войтова К.В., Гальнбек Т.В. Выделение и типирование респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота при помощи ОТ-ПЦР. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2010;10:59-64.
Глотов А.Г., Глотова Т.И., Котенева С.В., Нефедченко А.В., Войтова К.В. Особенности эпизоотической ситуации по респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах по производству молока. Ветеринария. 2010;7:21-25.
Глотов А.Г., Глотова Т.И., Строганова И.Я. Выявление респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота при помощи ОТ-ПЦР. Вопросы вирусологии. 2011;56(5):34-37.
Журавлева Е.А. Нозоареал респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота. Ветеринария. 2018;12:3-8. https://doi.org/10.30896/0042-4846.2018.21.12.03-08
Jordan R, Shao M, Mackman RL, Perron M, Cihlar T, Lewis SA, et al. Antiviral efﬁcacy of a respiratory syncytial virus (RSV) fusion inhibitor in a bovine model of RSV infection. Antimicrob Agents Chemother. 2015;59:4889-4900. https://doi.org/10.1128/AAC.00487-15
Meyer G, Deplanche M, Schelcher F. Human and bovine respiratory syncytial virus vaccine research and development. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2008;31(2-3):191-225. https://doi.org/10.1016/j.cimid.2007.07.008
Aranda SS, Polack FP. Prevention of Pediatric Respiratory Syncytial Virus Lower Respiratory Tract Illness: Perspectives for the Next Decade. Front Immunol. 2019;10:1006. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.01006
Kirolos A, Christides A, Xian S, Reeves R, Nair H, Campbell H. A landscape review of the published research output relating to respiratory syncytial virus (RSV) in North & Central America and Europe between 2011—2015. J Glob Health. 2019;9(1):010425. https://doi.org/10.7189/jogh.09.010425
Gershwin LJ, Schelegle ES, Gunther RA, Anderson ML, Woolums AR, Larochelle DR, et al. A bovine model of vaccine enhanced respiratory syncytial virus pathophysiology. Vaccine. 1998;16:1225-1236. https://doi.org/10.1016/S0264-410X(98)80123-0
Masot AJ, Gomez-Tejedor C, Gazquez A, Redondo E. Pathological study of experimentally induced bovine respiratory syncytial virus infection in lambs. Zentralbl Veterinarmed B. 1996;43:233-243.
Boukhvalova MS, Prince GA, Blanco JC. The cotton rat model of respiratory viral infections. Biologicals. 2009;37:152-159. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2009.02.017
Almeida RS, Domingues HG, Coswig LT, d’Arce RCF, de Carvalho RF, Arns CW. Detection of bovine respiratory syncytial virus in experimentally infected balb/c mice. Veterinary Research. 2004;35:189-197.
Rudd PA, Chen W, Mahalingam S. Mouse and Cotton Rat Models of Human Respiratory Syncytial Virus. Methods of Molecular Biology. 2016;1442:209-217. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3687-8_15
Boxus M, Letellier C, Kerkhofs P. Real Time RT-PCR for the detection and quantitation of bovine respiratory syncytial virus. Journal of Virological Methods. 2005;125(2):125-130. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2005.01.008
Kimman TG, Zimmer GM, Straver PJ, de Leeuw PW. Diagnosis of bovine respiratory syncytial virus infections improved by virus detection in lung lavage samples. Am J Vet Res. 1986;47(1):143-147.
Yaman T, Büyükbayram H, Özyıldız Z, Terzi F, Uyar A, Keles ÖF, et al. Detection of Bovine Respiratory Syncytial Virus, Pasteurella Multocida, and Mannheimia Haemolytica by Immunohistochemical Method in Naturally-infected Cattle. J Vet Res. 2018;62(4):439-445. https://doi.org/10.2478/jvetres-2018-0070
Klem TB, Sjurseth SK, Sviland S, Gjerset B, Myrmel M, Stokstad M. Bovine respiratory syncytial virus in experimentally exposed and rechallenged calves; viral shedding related to clinical signs and the potential for transmission. BMC Vet Res. 2019;15(1):156. https://doi.org/10.1186/s12917-019-1911-z
Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology. 2002;3(7):research0034.1—0034.11.
Zhao H, Liu J, Li Y, Yang C, Zhao S, Liu J, et al. Validation of Reference Genes for Quantitative Real-Time PCR in Bovine PBMCs Transformed and Non-transformed by Theileria annulata. Korean J Parasitol. 2016;54(1):39-46. https://doi.org/10.3347/kjp.2016.54.1.39
Timsit E, Maingourd C, Le Dréan E, Belloc C, Seegers H, Douart A, et al. Evaluation of a commercial real-time reverse transcription polymerase chain reaction kit for the diagnosis of Bovine respiratory syncytial virus infection. J Vet Diagn Invest. 2010;22(2):238-241. https://doi.org/10.1177/104063871002200211
Timsit E, LeDréan E, Maingourd C, Belloc C, Guattéo R, Bareille N, et al. Detection by real-time RT-PCR of a bovine respiratory syncytial virus vaccine in calves vaccinated intranasally. Vet Rec. 2009;165(8):230-233. https://doi.org/10.1136/vr.165.8.230
Котенева С.В., Войтова К.В., Глотова Т.И., Строганова И.Я., Глотов А.Г. Частота выявления генома респираторно-синцитиального вируса у крупного рогатого скота при вспышках бронхопневмоний на молочных комплексах. Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. 2016;3:18-21.