Введение
С развитием интегративного подхода в биологии увеличивается список генов, которые изучаются на предмет ответственности за предрасположенность к некоторым заболеваниям [1], отвечающих за склонность к определенным видам спорта [2], контролирующих проявление морфофункциональных [3] или психологических особенностей [4]. Так, например, разные генотипы генов разобщающих белков (UCP1, UCP2 и UCP3) могут влиять на склонность к ожирению или, наоборот, к занятию спортом на профессиональном уровне [2, 3].
Из морфологических особенностей телосложения, которые изучаются в связи с полиморфизмом генов, чаще всего анализируются показатели общего жироотложения, поскольку избыточная масса тела и ожирение способствуют повышенному риску развития многих хронических заболеваний, таких как гипертония, сахарный диабет 2-го типа, рак эндометрия, и других сопутствующих расстройств [5]. Ожирение является полигенным заболеванием, однако физическая активность ослабляет влияние генетического фактора на развитие избыточной массы тела [6]. Нередко бывает, что наличие психологических расстройств ассоциировано с морфологическими особенностями телосложения. Так, например, есть данные о том, что депрессия и тревожность положительно связаны с ожирением [7—9].
Одним из генов, который чаще всего рассматривают в связи с предрасположенностью к различным психическим расстройствам, является ген COMT. Ген COMT кодирует фермент катехол-О-метилтрансферазу, который участвует в катализе эндогенных катехоламинов (дофамина, норадреналина и адреналина). У человека этот ген расположен на 22-й хромосоме в области q11.1-q11.2. В гене COMT в 158-м кодоне обнаружен однонуклеотидный полиморфизм (SNP) (108A/G или Val158Met, rs4680) [10]. Замена аллеля G (дикий тип) на A меняет аминокислоту валин на метионин. Данная замена приводит к снижению активности фермента в 3—4 раза в префронтальной коре и миндалевидном теле, что может привести к развитию некоторых нейропсихологических особенностей [11, 12].
В современной научной литературе анализируются разные варианты ассоциаций полиморфизма rs4680 с морфофункциональными особенностями [4, 13—17]. Так, например, ранее было установлено, что у мужчин, имеющих генотипы A/A или A/G (A/A в большей степени), более высокие показатели артериального давления, частоты сердечных сокращений, соотношения обхватов талии и бедер и сагиттального абдоминального диаметра по сравнению с обладателями G/G генотипа [13]. Подобная тенденция находит отражение в работах ряда авторов: среди лиц, страдающих ожирением, большинство имеют генотип A/G и A/A [4, 14]. В другом исследовании дети, носители аллеля G, показали более высокое потребление богатой жирами пищи по сравнению с детьми с гомозиготами A/A [15]. В целом у носителей G аллеля и генотипа G/G выше частота встречаемости сахарного диабета 2-го типа и больших значений индекса массы тела (ИМТ) [16]. Другая группа ученых [17] в свою очередь вовсе не обнаружила связи между генотипами COMT и ИМТ.
В связи с вышеизложенными весьма противоречивыми данными литературы целью нашего исследования был поиск возможных ассоциаций между полиморфизмом rs4680 гена COMT и морфофункциональными особенностями студенческой молодежи России и Приднестровья.
Материал и методы
В работе были использованы результаты комплексного антропогенетического обследования юношей и девушек из трех регионов России (Саранск и села Зубово-Полянского района Мордовии; Самара) и г. Тирасполя (Приднестровская Молдавская республика, территория Молдавии). Всего обследован 451 респондент в возрасте 16—23 лет. По этнической принадлежности респонденты преимущественно русские: у 83,1% респондентов отец и мать русские; у остальных один из родителей по национальности русский, а другой — украинец, либо оба родителя украинцы. Средний возраст участников исследования составил 18,8 года для респондентов мужского пола и 19,0 лет — для женского пола. Все материалы комплексного обследования, анализируемые в работе, собраны с соблюдением правил биоэтики (экспертное заключение Комиссии МГУ по биоэтике, протокол №55 от 26.03.15), подписанием протоколов информированного согласия и деперсонифицированием данных.
У участников исследования во всех регионах были измерены следующие параметры: масса и длина тела, обхватные размеры корпуса (обхваты талии и бедер) и жировые складки (под лопаткой, на животе, на предплечье и голени). Для антропометрического обследования были использованы следующие приборы: напольные весы и антропометр для измерения массы и длины тела, сантиметровая лента (для измерения обхватов корпуса), калипер GPM (для определения толщины жировых складок на корпусе и конечностях) [18]. На основе измерения активного и реактивного сопротивления биологических жидкостей и клеточных мембран организма был определен компонентный состав тела участников обследования с помощью биоимпедансного анализатора «Медасс АВС-01» [19].
Для молекулярно-генетического анализа использовали геномную ДНК (n=451), полученную с помощью набора реагентов для выделения ДНК из различного биологического материала Diatom DNA Prep 200 (ООО «Лаборатория Изоген», Россия) согласно протоколу производителя. Анализ полиморфных вариантов гена COMT осуществляли после проведения полимеразной цепной реакции с помощью набора GenePak PCR MacterMixCore (ООО «Лаборатория Изоген», Россия) согласно протоколу производителя. Использовали следующие пары праймеров: F 5’- TACTGTGGCTACTCAGCTGTGC-3’ и R 5’- GTGAACGTGGTGTGAACACC — 3’. Условия амплификации включали начальную денатурацию при 94 °C в течение 4 мин и тридцать циклов, состоящих из трех стадий: денатурация 1 мин при 94 °C, отжиг праймера 1 мин при 55 °C, элонгация 1 мин при 72 °C. На последней стадии проводилась заключительная элонгация при 72 °C в течение 10 мин. Для выявления SNP (A/G) полиморфизма продукт амплификации делили на равные аликвоты по 10 мкл, одну из которых обрабатывали эндонуклеазой рестрикции NlaIII (5 ед. на пробу) при 37 °C в течение ночи. Продукты рестрикции фракционировали в 2% агарозном геле с прокраской бромистым этидиумом. Результаты анализировали и фотографировали на приборе «BioDocAnalyze».
Для статистической обработки полученных данных использован пакет программ Statistica 10.0. Для оценки достоверности различий в распределениях генотипов был применен непараметрический критерий χ2. На предварительном этапе статистического анализа все морфофункциональные признаки были проверены на нормальность распределения с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Для ненормально распределенных признаков была использована логарифмическая трансформация данных, то есть логарифмирование исходных значений морфологических и функциональных признаков, имеющих ненормальное распределение, с целью приведения их к нормальному распределению. Чтобы исключить влияние региональных особенностей на результаты исследования, значения всех морфологических и функциональных признаков были нормированы (проведена процедура стандартизации) отдельно для юношей и девушек каждого населенного пункта. После нормирования морфофункциональных признаков антропогенетические данные юношей и девушек были объединены в общую выборку для 4 регионов. Для изучения межгрупповых морфологических и функциональных различий у носителей разных генотипов были применены: 1) одномерный дисперсионный анализ с применением F-критерия Фишера для проверки статистических гипотез об однородности средних арифметических значений морфофункциональных признаков; 2) многомерный канонический дискриминантный анализ — как основной метод для выявления и описания межгрупповой изменчивости признаков [20—24]. Канонический дискриминантный анализ был применен для общей выборки юношей и девушек (N=451): в качестве группирующего признака использовались генотипы гена COMT, а в качестве зависимых переменных — комплекс морфофункциональных признаков.
Результаты и обсуждение
В обобщенной выборке было выявлено 3 аллельных варианта генотипов гена COMT: A/A, A/G и G/G. Достоверных различий в частотах распределения аллелей A и G у юношей и девушек выявлено не было (p>0,05). В связи с этим в дальнейшем анализировали частоты генотипов и аллелей в объединенной по полу выборке. Наблюдаемые частоты встречаемости генотипов гена COMT у обследованного контингента (табл. 1) соответствуют равновесному распределению Харди-Вайнберга (χ2=0,018; p=0,992). Наши результаты согласуются с данными других исследователей, которые показали, что у русских жителей Новосибирска и американцев европейского происхождения также чаще встречается аллель G (частоты встречаемости 0,539 и 0,535), чем аллель A (0,461 и 0,465 соответственно) [25, 26].
Таблица 1. Частоты встречаемости генотипов и аллелей гена COMT в объединенной выборке студентов
| Генотипы и аллели | Юноши (n=220) | Девушки (n=231) | Объединенные данные (n=451) |
| A/A | 0,232 (51) | 0,200 (46) | 0,215 (97) |
| A/G | 0,477 (105) | 0,528 (122) | 0,503 (227) |
| G/G | 0,291 (64) | 0,272 (63) | 0,282 (127) |
| A | 0,470 (207) | 0,463 (214) | 0,467 (421) |
| G | 0,530 (233) | 0,537 (248) | 0,533 (481) |
Примечание. В скобках приведены численности носителей генотипов и аллелей в обследованных группах.
Полиморфизм гена COMT rs4680 чаще всего рассматривают в связи с психологическими особенностями личности [10—12]. Многие ученые [10], изучающие полиморфизм гена COMT rs4680, придерживаются гипотезы воина/беспокойного человека (англ. warrior/worrier hypothesis). Носители аллеля A беспокойные (уровень тревожности определяется с помощью различных тестов, например, Композитного международного диагностического интервью) [11], у них более низкая ферментативная активность белка, следовательно, более высокий уровень дофамина в префронтальной коре; более низкий болевой порог, повышенная уязвимость к стрессу, вместе с этим они любознательные и осуществляют в большинстве случаев более эффективную обработку информации (показано в ряде исследований с применением метода магнитно-резонансной томографии и опросников, таких как Висконсинский тест сортировки карточек и трехмерный опросник личности) [10]. Люди, имеющие аллель G, «воины». Они менее любознательные, обладают более высокой ферментативной активностью катехол-О-метилтрансферазы, следовательно, более низким уровнем дофамина; у них более высокий болевой порог, лучшая стрессоустойчивость, хотя и с небольшим снижением исполнительной когнитивной функции в большинстве случаев. Некоторые данные свидетельствуют о том, что аллели G связаны с шизофренией, а аллели A связаны с тревожностью [10, 11]. В последнее время помимо изучения гена COMT психогенетиками ведется поиск ассоциаций полиморфизма rs4680 с морфологическими и функциональными особенностями человека [4, 13—17].
Средние значения длины и массы тела юношей составили 177,5 см и 71,3 кг; девушек — 164,0 см и 56,4 кг. Все обследованные студенты условно здоровы. У 13,5% респондентов значения ИМТ превышали 24,9 кг/м2, что свидетельствует об избыточной массе тела или ожирении, а у 12,6% студентов отмечен дефицит массы тела (ИМТ <18,5 кг/м2). ИМТ был вычислен по формуле: ИМТ=P/L2, где P — масса тела в килограммах, L — длина тела в метрах. В целом морфологическая характеристика обследованных юношей и девушек соответствует известным литературным данным, в которых представлены особенности телосложения молодежи этих регионов [27].
Показатели, полученные в нашем исследовании с помощью биоимпедансного анализатора, были использованы для более точной характеристики физического (соматического) состояния обследованных юношей и девушек, а также для количественной оценки жировой и скелетно-мышечной массы в организме. Неинвазивный метод биоимпедансометрии позволяет определить уровень физического развития индивида. Жировая масса отражает общее количество липидов в организме, а тощая масса — это безжировая масса тела (в том числе скелетно-мышечная масса). Активная клеточная масса, которая характеризует количество клеток, вовлеченных в метаболические процессы, также является частью тощей массы. Основной обмен веществ показывает общий уровень метаболизма (ккал/сут), в то время как удельный обмен — это основной обмен, пересчитанный на площадь поверхности тела в м2. Арктангенс отношения реактивного и активного сопротивлений называется фазовым углом. Его значения меньше 5,4° соответствуют гиподинамии, от 5,4° до 7,8° — норме, а величина угла выше 7,8° характерна для спортсменов [19]. Средние величины фазового угла в рассматриваемой выборке составляют 7,6° для юношей и 6,7° для девушек, что соответствует нормальному уровню физического развития обследованных респондентов [19].
Существуют 2 гипотезы, объясняющие возможные причинно-следственные механизмы связей полиморфизма генов дофаминовой системы и особенностей телосложения. Одна концепция предполагает, что более высокая доступность дофамина приводит к возрастающей чувствительности к вознаграждению и более сильной мотивации потреблять вкусную пищу, которая может привести к перееданию и ожирению [28]. Другая гипотеза гласит, что низкие уровни дофамина в мозге человека могут компенсироваться чрезмерным потреблением пищи для достижения удовольствия [29].
В результате применения дисперсионного анализа были найдены различия у юношей — носителей разных генотипов по нескольким морфофункциональным признакам. Для девушек достоверные различия у обладателей разных генотипов были найдены только по одному признаку — фазовому углу. Средние значения признаков, по которым были обнаружены достоверные различия (p<0,05), приведены в табл. 2. Девушки и юноши — носители генотипа G/G имеют более низкие значения фазового угла по сравнению с обладателями двух других генотипов. Ввиду аналогичных тенденций в группах юношей и девушек следующий этап статистической обработки данных был проведен в объединенной выборке юношей и девушек; его результаты описаны более подробно.
Таблица 2. Результаты дисперсионного анализа морфофункциональных характеристик для носителей различных генотипов гена COMT
| Признаки | Генотипы | F-критерий Фишера | p-уровень значимости | ||
| A/A | A/G | G/G | |||
| Юноши | |||||
| Фазовый угол, ° | 7,7±0,1 | 7,7±0,1 | 7,4±0,1 | 3,94 | 0,02 |
| Активная клеточная масса, кг | 37,4±0,7 | 36,5±0,4 | 34,8±0,7 | 3,77 | 0,02 |
| Скелетно-мышечная масса, кг | 34,0±0,5 | 33,3±0,4 | 32,2±0,5 | 3,31 | 0,04 |
| Основной обмен веществ, ккал/сут | 1796,1±23,3 | 1768,6±14,0 | 1715,8±23,5 | 3,77 | 0,02 |
| Удельный обмен веществ, ккал/м2 | 936,1±8,5 | 941,5±5,9 | 916,8±6,6 | 3,70 | 0,03 |
| Девушки | |||||
| Фазовый угол, ° | 6,9±0,1 | 6,7±0,1 | 6,5±0,1 | 3,62 | 0,03 |
Примечание. В таблице приведены значения признаков в виде M±m, где M — среднее арифметическое значение, m — ошибка среднего арифметического значения.
На следующем этапе статистической обработки данных был применен канонический дискриминантный анализ (КДА), который так же, как и дисперсионный анализ, предназначен для выявления достоверных различий между группами, однако возможности КДА значительно превосходят возможности дисперсионного анализа. В результате применения КДА наряду с установлением статистической достоверности межгрупповых различий получаются новые дискриминантные функции, называемые каноническими переменными, которые описывают основные направления межгрупповой изменчивости. Морфологический смысл канонических переменных трактуется по их стандартизованным коэффициентам для исходных морфофункциональных признаков (табл. 3), и в нашем случае появляется возможность описания межгрупповых морфофункциональных особенностей у носителей разных вариантов генотипов гена COMT. Наряду с выявлением межгрупповых особенностей КДА позволяет представить полученные результаты в иллюстративной форме — в виде координатного расположения индивидуальных и среднегрупповых значений канонических переменных у носителей разных генотипов (рис. 1, 2).
Таблица 3. Результаты канонического дискриминантного анализа комплекса морфофункциональных признаков по генотипам гена COMT
| Признаки | 1-я каноническая переменная | 2-я каноническая переменная |
| Масса тела | –1,45 | 1,31 |
| Длина тела | –0,01 | 0,56 |
| Обхват бедер | 1,21 | –1,50 |
| Жировая складка на предплечье | –0,12 | –0,39 |
| Жировая складка на голени | 0,26 | 0,80 |
| Фазовый угол | 0,54 | 0,60 |
| Скелетно-мышечная масса | 0,47 | –0,67 |
| Удельный обмен веществ | 0,54 | 0,01 |
| Доля суммарной изменчивости | 0,76 | 1,00 |
| Средние значения канонических переменных для разных генотипов гена COMT | ||
| Генотипы | 1-я каноническая переменная | 2-я каноническая переменная |
| A/A | 0,11 | 0,24 |
| A/G | 0,17 | –0,10 |
| G/G | –0,37 | –0,02 |
Примечание. Приведены стандартизованные коэффициенты канонических переменных.
Рис. 1. Расположение индивидуальных значений канонических переменных для носителей различных генотипов гена COMT.
Значения по осям абсцисс и ординат указаны в среднеквадратичных отклонениях.
Рис. 2. Расположение средних значений канонических переменных для носителей различных генотипов гена COMT.
Значения по осям абсцисс и ординат указаны в среднеквадратичных отклонениях.
В табл. 3 приведены результаты КДА комплекса морфофункциональных признаков по генотипам гена COMT. Первая каноническая переменная описывает 76,0% суммарной изменчивости и достоверно разделяет носителей генотипов COMT (критерий лямбда Уилкса=0,93; p=0,0168). Отличия по второй канонической переменной статистически недостоверны (p=0,386).
На рис. 1 и 2 графически представлены результаты канонического дискриминантного анализа. На положительном полюсе изменчивости первой канонической переменной находятся индивиды с небольшой массой тела, хорошо развитой скелетно-мышечной массой, с относительно высокими значениями фазового угла, являющегося косвенным показателем физической активности человека. Такие индивиды обладают высоким уровнем удельного обмена веществ (см. табл. 3). Упомянутые морфофункциональные признаки обладают наибольшими по модулю значениями стандартизованных коэффициентов, следовательно, наибольшим вкладом в разделение носителей разных генотипов. Перечисленными выше особенностями обладают носители генотипа A/A и A/G. Для юношей и девушек, имеющих гомозиготный генотип G/G, характерны более низкий уровень обмена веществ и пониженные показатели скелетно-мышечной массы тела при более значительной общей массе тела (по сравнению с носителями генотипов A/A и A/G). Различия между обладателями генотипов A/G и G/G составляют 0,5 среднеквадратичного отклонения, что сопоставимо с величиной в 3 см для длины тела (среднеквадратичное отклонение по длине тела 6 см). Полученные результаты согласуются с данными других авторов, которые находят достоверные связи генотипа G/G гена COMT с предрасположенностью к ожирению и сахарному диабету 2-го типа [16], а также к потреблению богатой жирами пищи [15]. Таким образом, при обследовании разных возрастных групп (детей в возрасте 3—4 лет [15], молодежи 16—23 лет (в нашей работе) и 40-летних мужчин [16]) с использованием разных методов исследования выявлены общие тенденции, что может свидетельствовать об устойчивости связей полиморфизма гена катехол-О-метилтрансферазы с морфофункциональными характеристиками.
Полиморфизм rs4680 гена COMT влияет на количество дофамина в префронтальной коре мозга; в частности, генотип G/G связан с пониженным уровнем дофамина [10]. Этот же генотип по результатам нашего исследования ассоциирован с избыточной массой тела и пониженным обменом веществ, что косвенно подтверждает предположение о том, что низкая концентрация дофамина может привести к чрезмерному потреблению пищи и, как следствие, набору жировой массы тела [29].
Заключение
По результатам исследования выявлены устойчивые ассоциации полиморфизма rs4680 гена COMT с морфофункциональными признаками, характеризующими особенности компонентного состава тела и обмена веществ. Носители генотипа G/G обладают меньшей долей скелетно-мышечного компонента состава тела и низкой скоростью обменных процессов, пониженными показателями физической активности (низкие значения фазового угла) при повышенной общей массе тела по сравнению с индивидами, имеющими генотип A/A или A/G. Юноши и девушки, которые являются носителями хотя бы одного аллеля A, не склонны к пониженному уровню обмена веществ и повышенной массе тела по сравнению с обладателями гомозиготного генотипа G/G.
Несмотря на обнаруженные статистически значимые связи полиморфизма rs4680 гена COMT и особенностей состава тела юношей и девушек, предрасположенность к избыточной массе тела требует дальнейшего изучения с использованием других генетических маркеров и оценки влияния внешних факторов среды на ее развитие.
Выявленные статистически значимые ассоциации полиморфизма гена COMT с морфофункциональными показателями представляют интерес для исследователей, занимающихся изучением генетических основ морфологической конституции, а также могут быть использованы в прикладных аспектах, например, в предиктивной персонифицированной медицине.
Финансирование работы. Работа выполнена при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований №18-09-00290 «Биологические и социальные факторы микроэволюционных изменений морфофункционального статуса и уровня полового диморфизма в популяциях современного населения» и программы «Постгеномные технологии и перспективные решения в биомедицине».
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.