Введение

Активное изучение морфологии колоний микоплазм и ультраструктурной организации их клеток началось в 70-х годах прошлого века, хотя отдельные работы были опубликованы еще в 60-х годах. За прошедшее с тех пор время техники электронно-микроскопических исследований, в том числе приготовления и фиксации препаратов микоплазм, значительно прогрессировали, но данные, полученные в 60—80-х годах, принципиально не изменились.

Морфология и цитоструктурная организация колоний микоплазм описаны в монографиях и многочисленных статьях [1—3].

Так, еще в 60—70-е годы были обнаружены, а в последующем подтверждены следующие факты. Форма и размеры классических колоний (КК) микоплазм в большей степени зависят от условий культивирования, состава питательной среды, фазы роста культуры, посевной дозы, близости расположения колоний друг от друга и в меньшей степени — от видовой принадлежности микоплазм [1].

Мы впервые показали, что колонии микоплазм разных видов гетерогенны [4]. Они состоят из клеток, образующих КК, и клеток, образующих колонии не описанного ранее морфотипа — «микроколонии» (МК). Чистые культуры МК были получены путем воздействия на популяции микоплазм гомологичных антител, аргоновой нетермальной плазмы, длительного культивирования на бедных питательных средах и при других неблагоприятных воздействиях [5, 6].

Культуры МК разных видов микоплазм были выделены нами из сыворотки крови пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями верхних дыхательных путей, из синовиальной жидкости при ревматоидном артрите, из мочи и мочевых камней при мочекаменной болезни, из спермы человека, из соскобов уретры и влагалища обезьян разных видов, из спермы быков-производителей и из различных клеточных культур. Эти данные свидетельствуют о широком распространении обнаруженного феномена.

Основные отличия КК от МК заключаются в следующем: 1) диаметр КК составляет 100—300 мкм. Диаметр МК в 10—15 раз меньше; 2) КК разных видов микоплазм вырастают на агаре через 24—96 ч, тогда как МК всех исследованных видов при первичном выделении становятся видимыми при 10-кратном увеличении только на 8—10-е сутки культивирования, при дальнейшем пассировании — на 6—8-е сутки. Вместе с тем при малом размере МК их количество в популяции в 3—4 раза превосходит количество КК; 3) при световой микроскопии с объективами 10×, 20× и 40× было обнаружено, что МК по морфологии принципиально отличаются от классических колоний; 4) при сравнительном протеомном анализе КК и МК методом ВЭЖХ-МС в клетках КК M. hominis удалось идентифицировать 346 белков, а в МК — 291. Обнаружено падение экспрессии белков, участвующих в процессах репликации, трансляции, деления и синтеза АТФ, что свидетельствует о снижении основных процессов в клетках и переходе клеток в состояние энергетического дефицита. В то же время уровень экспрессии отдельных липопротеинов, факторов элонгации и нескольких белков с неизвестной функцией увеличивается более чем в 2 раза. Получены доказательства, что клетки МК используют в качестве источника углерода не простые сахара и аргинин, а фосфорилированные пентозы, образующиеся при катаболизме нуклеотидов [7].

Чрезвычайно маленький размер колоний и их медленное формирование — причины, объясняющие их ускользание от внимания исследователей. Скорее всего, их принимают за артефакты на поверхности агара, и дальнейшее исследование не проводят.

Цель настоящей работы — изучить морфологию и цитоструктурную организацию клеток МК с помощью электронной микроскопии: сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и негативного контрастирования. Такое исследование проведено впервые.

Материал и методы

Микоплазмы. В работе использованы следующие представители класса Mollicutes: Mycoplasma hominis H-34, полученная от доктора K. Lemcke (Listar Inst.of Preventive Med. London); Mycoplasma pneumoniae FH, полученная от доктора R. Chanock (Nat. Inst. of Health, Bethesda, USA); Mycoplasma gallisepticum PG 31, полученная от доктора E. Freundt (Inst. of Med. Microbicology Univer. of Aarhus) и Acholeplasma laidlawii, полученная от доктора C. Köler (Germany).

Среда культивирования. Для культивирования всех эталонных штаммов микоплазм и штаммов МК, выделенных из клинического материала от пациентов и полученных in vitro, использовали коммерческую среду фирмы «BD BBL» Mycoplasma agar base (США) 1,3% с 15% сыворотки крови лошади Биолот (Россия), 1% свежего дрожжевого экстракта и 1% аргинина или 1% глюкозы в зависимости от пищевых потребностей видов микоплазм. Все исследования проводили с культурами микоплазм, выращенными на агаре.

Сканирующая электронная микроскопия. Препараты всех изучаемых штаммов были приготовлены в виде отпечатков с поверхности монослоя на агаре 2—3-суточных культур КК и 8—10-суточных культур МК. Монослой МК формируется только к этому сроку. Контролем служили отпечатки с поверхности незасеянных стерильных чашек. Для получения отпечатков агаровые блоки помещали на предметные стекла так, чтобы зона роста находилась под блоком. Фиксацию проводили 96° этиловым спиртом путем нанесения капель спирта по мере его впитывания каждые 15—20 мин в течение 8—10 ч. Ночью стекла сохраняли во влажной камере при +4 °C. Утром блоки аккуратно удаляли, отпечатки просушивали на воздухе при комнатной температуре. Затем отпечатки напыляли золотом, толщина слоя 5 нм.

Другие препараты представляли собой культуры КК и МК, выращенные на агаре и фиксированные в чашках Петри в парах 10% формалина в течение 1 сут. Затем с фиксированных культур делали отпечатки на кремниевую подложку. Отпечатки подсушивали на воздухе при комнатной температуре. На поверхность полученных препаратов напыляли золото толщиной слоя 5 нм. Исследования проводили в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 5,0—10,0 kV при рабочем увеличении от 300× до 20 000× на двулучевом ионно-электронном сканирующем микроскопе Quanta 200 3D («FEI Company», США). Модуль для напыления SP1-MODULE Sputter Coater (SPI, «Supplies», США).

Трансмиссионная электронная микроскопия. Негативное контрастирование. Структура колоний и ультраструктурная организация клеток КК детально изучены. Этим методом морфология МК и цитоструктура их клеток исследуются впервые. Отпечатки монослоя МК всех исследуемых видов на 8—9-е сутки культивирования делали непосредственно на медные сетки, применяемые для электронной микроскопии. Контролем служили отпечатки с поверхности стерильного агара. После подсушивания отпечатков на воздухе в течение 15 мин при комнатной температуре проводили негативное контрастирование 1% водным раствором уранил ацетата в течение 10 с. Препараты высушивали и исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа СМ-12 («Philips», США) в условиях напряжения 80 кВ при рабочих увеличениях микроскопа от 10 000× до 60 000×.

Результаты и обсуждение

При сравнительном исследовании морфологии КК 4 представителей класса Mollicutes с помощью СЭМ у них не было выявлено каких-либо видовых принципиальных особенностей, что согласуется с данными микоплазмологов, указывающих на невозможность видовой дифференциации микоплазм по морфологии колоний из-за их сходства.

По данным СЭМ, КК всех исследованных видов состоят из клеток шаровидной формы. В некоторых колониях клетки объединены между собой гомогенным веществом средней электронной плотности — экстрацеллюлярным матриксом, который покрывает колонии так плотно, что не всегда удается выявить форму отдельных клеток. Матрикс играет, вероятно, структурообразующую и протективную роль. Никаких не описанных ранее структур в КК не обнаружили (рис. 1, а, б).

Рис. 1. Сканирующая электронная микроскопия. Отпечаток с агара типичной классической 4-суточной колонии Mycoplasma hominis.

а — колония состоит из шаровидных клеток. Ув. 2500; б — стрелки указывают на поры в экстрацеллюлярном матриксе, окружающем колонии. Ув. 600; в, г — отпечатки с агара 10-суточных микроколоний: в — Mycoplasma gallisepticum. Ув. 5000; г — Acholeplasma laidlawii. Ув. 10 000.

МК всех исследованных видов микоплазм коренным образом отличаются от КК по морфологии и структуре. Они, как и КК, имеют плотный центр — участок высокой электронной плотности, а вся остальная часть колонии состоит из клеток палочковидной формы, которые в результате особого взаиморасположения формируют спиралевидную или винтообразную структуру с отдельными «лопастями», составленными из параллельно расположенных рядов палочковидных клеток, тесно прилегающих друг к другу боковыми поверхностями (рис. 1, в, г). МК всех видов микоплазм так же, как КК, содержат некоторое количество гомогенного вещества, объединяющего клетки, и не имеют специфических видовых особенностей.

Упорядоченное расположение палочковидных бактерий в почти параллельных друг другу рядах, формирующих форму винта или спирали, является удивительным. Подобная структура колоний ранее не была известна.

Особого внимания заслуживают факты выявления в составе КК или рядом с ними отдельных палочковидных клеток и групп клеток, аналогичных тем, из которых состоят МК (рис. 2, а, б).

Рис. 2. Сканирующая электронная микроскопия. Типичные классические колонии Mycoplasma hominis и отдельные палочковидные элементы микроколоний.

а — внутри классической колонии. Ув. 16 000; б — в непосредственной близости к классической колонии. Ув. 4000.

Длина палочковидных клеток колеблется в широком диапазоне — от 200 до 1200 нм. Форма палочек несколько варьирует. Одни более мелкие и слегка изогнутые. Один конец имеет большую электронную плотность, другой — значительно тоньше и очерчен нечетко. Другие клетки более крупные с равномерным диаметром, их концы четко очерчены, прямые или округлые (рис. 3). В составе колоний присутствуют также клетки длиной 2000 нм и больше, которые, вероятно, появляются в результате отсутствия синхронизации между репликацией генома и делением клеток. Поперечник всех клеток составляет приблизительно 100 нм.

Рис. 3. Сканирующая электронная микроскопия микроколоний Acholeplasma laidlawii. Колония состоит из палочковидных клеток. Ув. 24 000.

А — мелкие клетки с нечетко очерченными концами; Б — более крупные клетки с четко очерченными концами и отдельные длинные клетки.

Примененный метод исследования не позволил определить способ деления клеток. Следует отметить, что оба метода приготовления препаратов в виде отпечатков колоний на стекле и на кремниевой подложке в принципиальном отношении дали одинаковые результаты.

Далее мы приводим данные об ультраструктурной организации МК микоплазм и их клеток, полученные с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ). Принципиальной разницы в ультраструктуре МК разных видов, как и при исследовании в СЭМ, не выявили. Поэтому дальнейшее описание относится в равной степени ко всем 4 представителям класса Mollicutes. МК, исследованные этим методом, так же, как при СЭМ, имели винтообразную или спиралевидную форму. В периферической части колонии хорошо видны прилегающие боковыми поверхностями палочковидные клетки, составляющие параллельные ряды (рис. 4, а). ТЭМ позволила выявить цитоструктурные особенности отдельных клеток, которые не были обнаружены при СЭМ.

Рис. 4. Трансмиссионная электронная микроскопия. Негативное контрастирование 1% уранил ацетатом.

а — периферическая часть колонии Mycoplasma gallisepticum. Палочковидные клетки, тесно прилегающие друг к другу боковыми поверхностями и расположенные параллельными рядами. Ув. 10 000; б — продольная борозда на поверхности клеток Achleplasma laidlawii, расширяющаяся к одному из концов. Ув. 45 000; в — кистеобразное расщепление борозды на одном конце некоторых клеток Mycoplasma hominis; г — продольная исчерченность поверхности клеток Mycoplasma hominis. Ув. 60 000.

При большом увеличении (45 000—60 000×) на поверхности подавляющего большинства клеток выявляется продольная борозда (рис. 4, б). Иногда она имеет одинаковую ширину вдоль всей поверхности бактерий, но чаще у одного или обоих концов борозда расширяется. Нередко один из ее концов расщеплен продольно, что напоминает кисть (рис. 4, в). В составе одной колонии имеются клетки с ровными и волнообразными контурами.

Поверхность некоторых бактериальных клеток имеет параллельную продольную исчерченность (рис. 4, г).

Итак, представленные данные свидетельствуют о том, что способ приготовления препаратов путем прямых отпечатков с питательной среды на сетку для электронной микроскопии и последующее изучение отпечатков с помощью метода негативного контрастирования позволили исследовать ультраструктуру МК в целом, не нарушая их архитектонику. СЭМ и метод негативного контрастирования взаимно подтвердили данные об уникальной и одинаковой ультраструктурной организации МК 4 представителей класса Mollicutes: M. hominis, M. pneumoniae, M. gallisepticum и A. laidlawii.

В 2019 г. опубликованы наши данные о частоте выделения МК из клинического материала от пациентов с хроническими воспалительными процессами, о методах получения этих форм in vitro, об их физиологических особенностях и чувствительности к антибиотикам. Идентичность или близкое родство клеток КК и МК соответствующих видов были доказаны культуральными, биохимическими, серологическими и следующими молекулярно-генетическими методами: определением сходства последовательностей генов 16 S рРНК клеток КК и МК M. hominis; получением одинаковых результатов в ПЦР с праймерами генов домашнего хозяйства — ala S, sec Y, hsR, lys S M. hominis и одинаковыми результатами ПЦР, полученными при сравнении ДНК клеток КК всех 4 изучаемых видов микоплазм и клеток МК, выделенных из их популяций [5, 6]. Предварительные результаты полногеномного секвенирования свидетельствуют о минимальном количестве нуклеотидных несовпадений (эти исследования продолжаются).

Феномен, привлекший наше особенное внимание при СЭМ, — наличие в составе КК всех исследованных видов отдельных палочковидных клеток и даже винтообразных структур, составленных из таких клеток. При световой микроскопии с увеличением 480× уже в 2-суточной популяции среди КК видны зачатки МК, которые на 6—8-е сутки культивирования становятся видимыми при увеличении 120×.

Приведенные данные свидетельствуют об изначальной гетерогенности популяций клеток разных видов микоплазм. Гетерогенность популяций бактериальных клеток — хорошо известный феномен [8, 9]. Генетическое разнообразие клеток наблюдали даже в пределах одной колонии [10, 11]. Известно также, что при определенных условиях M. pulmonis и M. mobile способны формировать мелкие колонии, диаметр которых в 4 раза меньше обычных колоний [12, 13].

Условия культивирования, различные неблагоприятные физические и химические воздействия и даже факторы иммунной системы организма хозяина являются стрессорами, индуцирующими изменения в геноме микоплазм [14, 15].

Сотрудники Казанского института биохимии и биофизики в своих работах описали различные морфологические изменения клеток M. gallisepticum, M. hominis и A. laidlawii, вызванные тепловым шоком и другими неблагоприятными воздействиями [16]. Принципиальное отличие наших данных от данных коллег заключается в том, что изменения формы клеток, описанные указанными выше авторами, носят транзиторный характер. При исключении неблагоприятных воздействий клетки реверсируют в исходные формы. МК, изучаемые нами, никогда не реверсировали в КК при их многократном пассировании в течение 5 лет и исключении воздействия всех неблагоприятных факторов, при обогащении питательной среды дополнительными компонентами, а также при пассировании клеток МК в клеточных культурах и организме мышей и кроликов.

Таким образом, популяции микоплазм исходно были не только гетерогенны, но и стабильны в своей гетерогенности.

Мы предполагаем, что клетки МК — результат генетической дивергенции, вызванной закрепившимися мутациями, предотвращающими возможность реверсии в исходное состояние.

Известно, что для всех видов микоплазм при малом размере их генома характерны высокий темп мутационных процессов, выраженная нестабильность генома, его реорганизация, в частности из-за горизонтального переноса генов и возможной перегруппировки генов внутри их геномов [17, 18].

Клетки МК имеют существенные преимущества в сравнении с клетками КК. Они резистентны к различным неблагоприятным факторам, в том числе к антибиотикам, к которым чувствительны клетки КК. Несмотря на меньший размер колоний, их клетки обладают большей энергией размножения; количество МК в одной популяции в 3,5—4 раза превышает количество КК. Меньший размер МК объясняется, по всей вероятности, их особой структурной организацией — плотной упаковкой палочковидных клеток, тесно прилегающих друг к другу. Следовательно, в эволюционном плане с точки зрения сохранения вида эти клетки более совершенны.

В современной социобиологии существует концепция родственного альтруизма. В мире бактерии — это гибель одной части генетически родственных бактерий ради выживания остальной части популяции. С точки зрения эволюции так происходит клонирование клеток, имеющих определенные преимущества, что и поддерживается естественным отбором [19]. Не является ли описанное нами явление примером «родственного альтруизма» микоплазм?

Заключение

Удивительными представляются абсолютное сходство морфотипа МК всех изученных видов микоплазм и одинаковая ультраструктурная организация их клеток. Можно предположить, что их формирование и развитие происходит по единой схеме или, возможно, они имеют общего предка.

Из клинического материала от пациентов и животных мы часто выделяем МК, типировать которых до вида имеющимися у нас тест-системами не удается, но с универсальной тест-системой «МИК-КОМ» (ООО «ИнтерЛабСервис») они типируются как представители семейства Mycoplasmataceae — M.spp. Эти наблюдения свидетельствуют о более широком распространении обнаруженного феномена, чем мы ранее предполагали, возможно, об его универсальности для всех видов семейства Mycoplasmatacea. Мы надеемся, что результаты изучения протеома и геномного секвенирования клеток МК приблизят нас к пониманию их природы.

Благодарности. Авторы выражают благодарность директору ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» академику РАМН Гинцбургу Александру Леонидовичу за возможность выполнить эту работу в рамках бюджетного финансирования. Авторы выражают глубокую признательность проф. Юлии Михайловне Романовой за интерес к работе, дискуссии и помощь в оформлении работы.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.