По оценкам ВОЗ, в 2018 г. во всем мире туберкулезом заболели 10 млн человек (диапазон значений 9,0—11,1 млн), и этот параметр в последнее время остается на стабильном уровне [1]. Несмотря на очевидные различия в вирулентности и трансмиссивности отдельных генотипов [2, 3], патогенез туберкулеза, особенно на поздних стадиях, по-прежнему остается малоизученным. Ранее нами было высказано предположение о том, что в процессе многомесячного лечения в казеозном содержимом туберкулезных очагов может развиваться специфическая микробиота, формирующая полимикробный биофильм (БФ), устойчивый к проводимой противотуберкулезной терапии и способствующий выживанию возбудителя [4]. Проведенные нами исследования свидетельствуют, что клинические штаммы туберкулеза исключительно редко способны к продукции поверхностных гидрофобных БФ [5], несмотря на то, что это достаточно хорошо описанное явление [6]. Однако модельные эксперименты на лабораторных животных не подтверждают наличие в очагах туберкулеза очевидных БФ [7], авторы описывают только микроскопические БФ-подобные структуры [7]. В предыдущем исследовании мы обнаружили, что от одного и того же больного могут выделяться штаммы, как неспособные к продукции БФ (мокрота), так и активно продуцирующие БФ (загрудинный холодный абсцесс) на жидкой питательной среде [4]. По всей видимости, таким медленно растущим микроорганизмам, как Mycobacterium tuberculosis, в условиях роста в верхних дыхательных путях достаточно затруднительно продуцировать БФ, в то же время условия роста в стерильных условиях загрудинного абсцесса, вызванного гематогенным заносом, могут быть более благоприятными для продукции БФ in vivo. Вполне возможно, что во многих случаях длительная персистенция туберкулеза в легких сопровождается формированием в очаге туберкулеза полимикробного БФ, как это было показано нами в модельном эксперименте [5]. Целью настоящего исследования являлся анализ микробного разнообразия казеозного некроза туберкулезных очагов молекулярно-биологическими методами.

Материал и методы

Соблюдение этических норм. Настоящее исследование одобрено Этическим комитетом ФГБНУ «НЦ ПЗСРЧ». Исследуемый материал в подавляющем большинстве представлял иссеченные туберкуломы. Для исключения избирательного размножения микрофлоры 12 биопсийных образцов собраны непосредственно после операции хирургом. Образцы в количестве 1—3 г материала помещались в пробирки с двумя объемами концентрата DNA/RNA Shield (2X concentrate, «Zymo Research»), в ряде случаев биопсийный материал собирали, как описано ранее, в 1% раствор CTAB в 50% изопропиловом спирте [8].

Выделение геномной ДНК из биоптатов. Экстракцию ДНК штаммов микобактерий туберкулеза (МБТ) проводили из образцов, фиксированных вышеназванными способами, из 100 мг нерастворимого субстрата. Для уменьшения влияния ингибиторов ПЦР проводили предварительную обработку образцов протеиназой K («AppliChem») и хлороформом, как описано ранее [4]. ДНК выделяли набором DNeasy Blood&Tissue Kits («Qiagen»).

ПЦР проводили в варианте с детекцией электрофорезом или с детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ) на амплификаторе CFX-96 («БиоРад»). Олигонуклеотидные праймеры разработаны на основе известных структур (табл. 1) [9], зонды сконструированы в рамках данного исследования. Праймеры и зонды синтезированы в НПФ «Синтол» и ЗАО «Евроген». Амплификацию для молекулярного клонирования вели на паре консервативных бактериальных праймеров EUB500F/EUB1000R для гена 16S рРНК. Целевой ампликон очищали и концентрировали с помощью набора Cleanup Mini (ЗАО «Евроген»). Молекулярное клонирование ПЦР продуктов проводили с помощью набора CloneJET^TM PCR Cloning Kit («Thermo Scientific», США). Подготовку компетентных клеток и трансформацию проводили, используя стандартные методики [10]. Секвенирование по Сэнгеру выполняли в ЗАО «Евроген».

Таблица 1. Список использованных праймеров и зондов

ПЦР с эубактериальными праймерами и TaqMan зондами (см. табл. 1) проводили в течение 40 циклов с AmpliTaq Gold 360 Master Mix («Applied Biosystems») в присутствии 1х раствора энхансера из того же набора на амплификаторе CFX-96 («Biorad»). Режим амплификации: 95° — 10 мин, активация полимеразы; 95° — 40 с; 56° — 10 с; 72° — 40 с. Ключевым вопросом этого раздела исследования стало достижение нулевого фона в отрицательном контроле на протяжении 40 циклов амплификации. Эта задача была достигнута применением AmpliTaq Gold 360 («Applied Biosystems») полимеразы и использованием других реактивов и воды максимальной чистоты.

Расчет общего количества эубактериальной ДНК (эубДНК) и количества микобактериальной ДНК (мбтДНК) в очаге выполняли по формуле y= –0,3065x+7,1774, полученной эмпирически по калибровочной кривой (рис. 1). В качестве стандартной матрицы использовалась ДНК штамма M. tuberculosis с известной концентрацией, как это было описано ранее [5].

Рис. 1. Калибровочная кривая, использованная для получения эмпирической формулы расчета отношения порогового значения Ct к десятичному логарифму количества геном-эквивалентов исследуемых бактерий.

Для полногеномного секвенирования (NGS) библиотека генов 16S рРНК подготовлена с помощью наборов Nextera DNA Flex Library Prep («NEB») и GS Junior («Roche») в соответствии с рекомендациями производителей. Контроль качества ампликоновых библиотек проводили с помощью электрофореза. Высокопроизводительное секвенирование проведено на платформах Miseq («Illumina») и 454 GS Junior («Roche»). Результаты секвенирования в виде стандартных файлов коротких прочтений (fastq формат) депонированы в базу данных NCBI, биопроект PRJNA609038 [11]. Для обработки метагеномных библиотек использовались алгоритмы платформы QIIME2 2019.4 [12]. Качество последовательностей проверялось с помощью FastQC 0.11.8 [13].

Результаты и обсуждение

Исходной причиной, послужившей отправной точкой представленной работы, стал ретроспективный анализ клинических ПЦР-исследований хирургического материала, выполненных в Иркутской областной клинической туберкулезной больнице. В течение 2018—2019 гг. 388 образцов хирургического материала были исследованы ПЦР-методом (GeneXpert) на наличие ДНК МБТ и мутаций устойчивости к рифампицину. По результатам исследования GeneXpert, в 222 (57%) образцах не обнаружено устойчивости к рифампицину, в 131 (34%) случае устойчивость присутствовала, в 35 (9%) случаях ДНК МБТ не была обнаружена. Исследуемый материал в подавляющем большинстве представлял собой иссеченные туберкуломы.

Здоровые легкие исторически считались стерильными, однако за последнее десятилетие эта концепция изменилась. В здоровых легких человека описано достаточно разнообразное бактериальное сообщество [14, 15]. По всей видимости, присутствие небольшого количества бактерий в легких является признаком хорошего здоровья [16]. Большинство бактерий в нижних отделах легких происходит из верхних дыхательных путей и ротовой полости [17]. Вопрос о том, является ли колонизация легких бактериями стабильной и/или транзиторной, остается открытым до настоящего времени [16]. Во многом остаются неизвестными состав и роль микробиоты легких. Известно, что микробиота легких имеет низкую плотность, 10³—10⁵ колониеобразующих единицы на 1 г ткани легких (КОЕ/г), как было показано в модельных экспериментах [18]. Легкие человека содержат около 2,2×10³ бактериальных геномов на 1 см² поверхности [19]. Плотность микробной популяции в легких значительно меньше, чем плотность микробиоты толстой кишки, которая демонстрирует наиболее густонаселенный микробный пейзаж в организме человека, с общей численностью до 10¹¹ КОЕ/г [14]. Популяция микроорганизмов в легких значимо не отличается количественно от популяции двенадцатиперстной кишки — около 10⁴ микробов на 1 мл содержимого [20].

В табл. 2 приведены сравнительные оценки концентрации ДНК M. tuberculosis относительно общего бактериального обсеменения. Следует отметить, что в образцах 3, 4 и 7 не обнаружена ДНК M. tuberculosis, в образцах 5, 6, 10, 11 количество микобактериальной ДНК колеблется от 0,1 до 10% относительно общего количества бактериальных геномов. «Истинными» очагами туберкулезного некроза можно считать только образцы 1, 2, 8, 9 и 12. Другими словами, микробиота >¹/₂ из 12 исследуемых образцов состояла в 90% случаев из микроорганизмов, отличных от этиологического агента, вызвавшего образование туберкулезного очага. Широкое распространение крайне низких (10% и менее) концентраций ДНК возбудителя туберкулеза в очаге явилось достаточно неожиданным результатом для самих авторов исследования.

Таблица 2. Сравнение количества геном-эквивалентов микобактерий в 1 г некротического содержимого туберкулезного очага относительно общего количества эубактериальной ДНК

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что патологические процессы, вызванные M. tuberculosis, как и ряд других (бронхиальная астма, муковисцидоз) [16], драматически изменяют гомеостаз глубоких отделов респираторного тракта, в результате чего возможности к размножению микроорганизмов в легких (в первую очередь патологической микробиоты, включая МБТ) значимо возрастают. Можно предполагать, что исследуемые бактериальные сообщества в туберкулезных очагах делятся как минимум на 2 типа: 1) микобактериальная казеома (туберкулома), в которой 70% геномов и более соответствуют МБТ; 2) полимикробное сообщество, в котором концентрация МБТ колеблется от 0 до 10%. Мы можем предположить, что туберкуломы с малым количеством МБТ и большим разнообразием сателлитной микробиоты могут отличаться более благоприятным течением и таких больных легче вылечить. В то же время нами обнаружена относительно небольшая концентрация бактериальных геномов в туберкулезных очагах (около 10⁶ геном-эквивалентов на 1 г некротического содержимого туберкуломы). По всей видимости, основную массу казеозного содержимого исследуемых туберкулезных очагов составляли отмершие ткани легкого, а не распространенный полимикробный БФ, как ожидалось нами ранее [4]. При этом нельзя исключать, что в процессе формирования и успешной терапии туберкуломы в ходе организации казеозного некроза может происходить ряд процессов, сходных с сукцессией, наблюдаемых в природных микробных сообществах, т.е. последовательная смена состава микробного консорциума, вызванная изменениями в условиях существования, питающем субстрате и присутствием или отсутствием антибиотиков.

В табл. 3 приведены результаты секвенирования по Сэнгеру 39 клонов, полученных при молекулярном клонировании ампликонов фрагмента гена 16S рРНК. ДНК выделена из 5 образцов некротического содержимого. Ограничением данного раздела исследования является то, что проанализированные пять образцов не совпадают с образцами из табл. 2. В силу утраты исходного материала (казеозного содержимого) проведение количественной оценки мбтДНК и эубДНК было невозможно. Как видно из табл. 3, около ²/₃ идентифицированных родов сателлитной микробиоты казеом относились к грамотрицательным палочкам и около ¹/₃ — к грамположительным коккам. Можно предполагать, что образец 2 (см. табл. 3) принадлежал к «истинным» микобактериальным туберкуломам, в то время как в составе 4 других образцов обнаружено достаточно широкое микробное разнообразие.

Таблица 3. Таксономическая идентификация фрагментов гена 16S рРНК, полученных по результатам молекулярного клонирования и секвенирования по Сэнгеру, 5 образцов из некротических очагов больных туберкулезом

Примечание. Полужирным шрифтом выделены мажерные таксоны (преобладающие в образце).

Две случайным образом выбранные туберкуломы были подвергнуты NGS исследованию. Следует отметить, что эти образцы также отличны от всех описанных ранее. Основной причиной отсутствия взаимосвязи между разделами настоящего исследования стали большие затруднения, связанные с получением ампликонов гена 16S рРНК, в том числе для метагеномного NGS исследования. Эти затруднения, по всей видимости, связаны с присутствием высоких концентраций ПЦР ингибиторов в казеозном содержимом. В итоге авторам исследования удалось получить стабильно воспроизводящиеся результаты с использованием AmpliTaq Gold 360 Master Mix («Applied Biosystems»), описанные в первом разделе. На рис. 2 приведены результаты метагеномного анализа ампликоновых библиотек, полученных методом NGS для содержимого двух туберкулом. Если в одном случае преобладающим таксоном являются микобактерии (см. рис. 2, справа), то во втором — представители рода стафилококков. Помимо микобактерий, единственным общим таксоном, минорным в обоих случаях, являются анаэробные пропионовокислые бактерии.

Рис. 2. Результаты метагеномного анализа ампликонов гена 16S рРНК содержимого двух туберкулом.

На диаграмме слева видно, что в составе микробиоты казеозного очага преобладали бактерии рода Staphylococcus, что значимо отличает ее от микробиоты казеозного очага справа, где доминирующим таксоном является род Mycobacterium.

Заключение

В общей сложности в рамках представленного исследования изучены 19 образцов казеозного содержимого туберкулом легких. Несмотря на различия в примененных подходах, можно однозначно сделать выводы о том, что существует значительное количество случаев, когда оперируемые туберкуломы имеют относительно небольшую концентрацию микобактерий — 10% и менее. В настоящий момент это невозможно предсказать до проведения хирургического лечения. Подавляющее большинство случаев туберкулеза легких, описанных в исследовании, было диагностировано с помощью рентгенологического исследования, а больные не имели бактериовыделения в окружающую среду. Нерешенным остался вопрос, является ли наблюдаемое различие в концентрации микобактерий внутри туберкулезного очага динамическим или статичным. Другими словами, происходит ли рост или снижение количества микобактерий по отношению к сателлитной микробиоте в процессе лечения при росте или регрессии туберкуломы. Следует также отметить, что полученные нами количественные оценки общего количества бактериальной ДНК на порядок и более ниже ожидаемой концентрации (10⁹), полученной нами в модельных экспериментах [5]. При этом количество микобактериальной ДНК было сравнимо или превышало количество, полученное в модели полимикробного БФ in vitro [5]. По всей видимости, на ранних этапах формирования хронического туберкулезного очага (туберкулома) возникающий полимикробный БФ представлен микроскопическими образованиями, подобно описанным некротическим кластерам в модельном эксперименте на морских свинках [7].

Финансирование. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 20-015-00078 А).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.