Туляремия — зоонозная системная природно-очаговая бактериальная инфекционная болезнь, характеризующаяся симптомами общей интоксикации, лихорадкой, воспалительными изменениями в области входных ворот инфекции, регионарным лимфаденитом, склонностью к затяжному течению. Возбудитель туляремии — мелкая грамотрицательная полиморфная (преимущественно кокковидная) неподвижная палочка Francisella tularensis. Систематическое положение возбудителя туляремии по определителю микроорганизмов Берджи [1] следующее: тип BXIV; Proteobacteria, класс III; «Gammaproteobacteria», порядок V; «Thiotrichales», семейство III; Francisellaceae, род I; Francisella, виды — F. tularensis и F. philomiragia. Внутри вида F. tularensis различают 4 подвида: subsp. tularensis (синоним — неарктический, тип A), subsp. holarctica (синоним — голарктический, тип B), subsp. mediasiatica и subsp. novicida. Внутри подвида holarctica группы штаммов были объединены в три биовара: различающиеся по чувствительности к эритромицину — bv. I EryS и bv. I1 EryR, и выделенные в Японии — bv. japonica [1].
В последнее время род Francisella значительно расширился и включает в себя уже свыше десятка видов. К условно-патогенному для человека и животных виду F. philomiragia добавились виды F. hispaniensis и F. opportunistica. Ранее названный подвид F. novicida-like включен в подвид F. tularensis subsp. novicida [1].
Следующую группу представляют возбудители заболеваний рыб, живущих в умеренных и теплых морях (F. noatunensis subsp. orientalis, син. F. asiatica) и рыб, живущих в холодных водах (F. noatunensis subsp. noatunensis, син. F. piscicida), вызывающие значительные экономические потери культивируемых и диких видов рыб, а также моллюсков (F. halioticida) из Северной и Южной Америки, Европы и Азии, среди которых появляются все новые и новые виды, например, F. marina sp. nov. Еще одна группа видов включает в себя эндоцитобионтов различных видов животных: эндосимбионты клещей — F. persica, симбионты морских инфузорий Адриатики — F. noatunensis subsp. endociliophora, симбионты морских инфузорий Антарктики — F. adeliensis. И, наконец, группа свободно живущих в водной среде микроорганизмов, таких как F. salina, F. uliginis, F. frigiditurris, F. salimarina [2—4].
Геном представителей рода Francisella состоит из хромосомной ДНК размером около 2 м.п.н. с относительно низким GC содержанием (табл. 1). Важно отметить, что незначительные вариации содержания G+C в геноме (32,3± 0,4) свидетельствуют о стабильной границе рода [5].
Плазмиды в пределах рода выявляются редко, среди эпидемически значимых подвидов (tularensis, holarctica, mediasiatica) плазмид не найдено [6].
Типирование туляремийного микроба является достаточно трудной задачей в связи с мономорфностью вида. Все подвиды (tularensis, holarctica, mediasiatica, novicida) являются филогенетически близкородственными и, несмотря на отличия по вирулентности и географическому происхождению, имеют небольшие генетические различия. Среднее значение нуклеотидной идентичности (ANI, average nucleotide identities), вычисленное с помощью метода парного геномного анализа для вирулентных подвидов (tularensis, holarctica, mediasiatica) составляет не ниже 99,3% [7].
Наибольшие отличия от других подвидов F. tularensis демонстрируют штаммы F. tularensis subsp. novicida (ANI=98%) [7]. Некоторые авторы давно обсуждают выделение условно-патогенных штаммов F. tularensis subsp. novicida в отдельный вид F. novicida.
Ранняя техника ДНК-типирования основывалась на исследовании рибосомальной 16S ДНК, которая показала гомологию между 4 подвидами от 98,5 до 99,9%. У большинства штаммов F. tularensis отличия составляют не более 6 нуклеотидов [8]. Выделение штаммов в отдельный вид принято при гомологии по 16S ДНК менее 95%. Именно по этому параметру часть исследователей оставляет подвид novicida внутри вида F. tularensis.
Почти 20% кодирующих генов в штаммах вирулентных для человека подвидов (tularensis, holarctica, mediasiatica) нарушены и представляют собой псевдогены или фрагменты генов по сравнению с генетически ближайшим подвидом novicida (рис. 1, табл. 1) [7, 9]. Перечень генов, общих и нарушенных, у отдельных подвидов приведены в работах ряда авторов [7, 10].
Рис. 1. Схема филогении F. tularensis. Цифры на ветвях указывают количество нарушений в генах.
Таблица 1. Сравнение строения геномов подвидов F. tularensis [2—3, 7, 10]
| Подвид | F.t.h. B.4 | F.t.h. B.6 | F.t.h. B.12 | F.t.h.j. B.16 | F.t.t. AI | F.t.m. | F.t.n. |
| Название штамма | OSU18 | FTA | LVS | FSC022 | SCHUS4 | FSC147 | U112 |
| Размер хромосомы (п.н.) | 1895727 | 1890909 | 1895994 | 1866490 | 1892819 | 1893886 | 1910031 |
| G+C содержание (%) | 32,16 | 32,16 | 32,15 | 32,1 | 32,26 | 32,25 | 32,48 |
| ISFtu1 | 63—66 | 59—61 | 59—61 | 58 | 50—53 | 59 | 1—2 |
| ISFtu2 | 42 | 42—44 | 44—46 | 57 | 16 | 17 | 17—20 |
| ISFtu3 | 2—4 | 2—4 | 2—4 | 2 | 3—4 | 4 | 4 |
| ISFtu4 | 1—2 | 1—2 | 1—2 | 2 | 1 | 1 | |
| ISFtu5 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | |
| ISFtu6 | 2—3 | 2—3 | 2—3 | 3 | 2—4 | 2 | 2 |
| Всего ISFtu | 108—116 | 109—113 | 101—113 | 123 | 74—89 | 83—84 | 25—29 |
| FPI копий/схема строения (рис. 2) | 2/2 | 2/2 | 2/2 | 2/2 | 2/1 | 2/1+50 a.о. | 1/1+50 а.о. |
| Кодирующие последовательности белки ORFs | 1424—1574 | 1434—1597 | 1438—1754 | 1509—1591 | 1465—1715 | 1406—1470 | 1649—1726 |
| Поврежденные ORFs/Псевдогены | 322—336 | 293—325 | 277—324 | 235—330 | 201—277 | 263—328 | 56—59 |
| % кодирующих генов | 70,01 | 70,68 | 70,72—84 | 87 | 72,98—88 | 71,08 | 89,16 |
Примечание. F.t.t. — F. tularensis subsp. tularensis; F.t.h. — F. tularensis subsp. holarctica; F.t.h. j. — F. tularensis subsp. holarctica bv. japonica F.t.m. — F. tularensis subsp. mediasiatica; F.t.n. — F. tularensis subsp. novicida.
В геноме туляремийного микроба обнаружены шесть типов часто повторяющихся инсерционных элементов (IS, insertion sequence) — ISFtu1 — ISFtu6. Наличие IS-элементов обнаруживается у всех видов и подвидов туляремийного микроба и количество их варьирует (см. табл. 1).
Сравнение геномов подвидов F. tularensis subsp. tularensis, holarctica и mediasiatica показывает высокую геномную гомологию — от 99,26 до 99,98%. Было показано, что различие не в размере генома или в составе генов, а в количестве геномных перестроек, в большинстве случаев обусловленных инсерционными элементами, обеспечивающими механизмы транслокации [11, 12].
Анализ генетического разнообразия методом микроэррей—гибридизации позволил идентифицировать 11 типов среди изолятов F. tularensis subsp. tularensis и 6 типов среди изолятов F. tularensis subsp. holarctica и выделить крупные области различия (RD, regions of difference), включающие сегменты некоторых генов, в том числе генов вирулентности. Метод позволил исследователям сделать вывод о более высокой степени гомологии между подвидами tularensis и mediasiatica по сравнению с подвидом holarctica, а также выявить существенные различия между подвидами в строении области различия RD1c и предложить метод типирования подвидов F. tularensis [13].
Анализировать всю хромосому позволяет метод мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов (MLVA — Multilocus VNTR-Analysis). Варьирование числа 25 VNTR (Variable-Number Tandem Repeat) локусов, используемых в методе, «разбросанных» по всему геному F. tularensis [14], позволил разделить коллекцию из 192 штаммов, выделенных в разных странах мира, на 4 подвида и 120 генотипов [15]. Метод показал высокую разрешающую способность для дискриминации близких генотипов внутри вида и подвидов.
Подвид F. tularensis subsp. tularensis показал значительную разнородность и делился методом MLVA на 2 популяции по генотипу, вирулентности, географическому распространению, преимущественным хозяевам и переносчикам — A.I и A.II. Более вирулентные штаммы A.I встречаются преимущественно в центральных и восточных штатах США, а A.II — в западных. Группа A.I далее делится на субпопуляции A.Ia и A.Ib. Штаммы F. tularensis subsp. tularensis A.I чаще инфицируют клещей видов Amblyomma americanum и Dermacentor variabilis и зайцев вида Sylvilagus floridanus. A.II чаще ассоциируется с клещами вида D. andersoni, оленьей мухой Chrysops discalis и зайцами вида S. nuttallii [16].
Среднеазиатский подвид остается самым малочисленным и малоизученным среди эпидемически значимых подвидов туляремийного микроба. На территории Казахстана штаммы F. tularensis subsp. mediasiatica изредка выделяются, в том числе и атипичные. Например, в 2003 г. в пойме реки Чу от клещей были выделены штаммы среднеазиатского подвида, чувствительные к оксациллину [17]. Начиная с 2011 г. установлена циркуляция штаммов подвида mediasiatica на территории Алтайского края и Республики Алтай [18, 19], а также Красноярского края. К настоящему времени в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФБУН ГНЦ ПМБ «ГКПМ-Оболенск» насчитывается около 40 штаммов данного подвида, в основном выделенных из клещей рода Hyaloma, Haemaphysalis concinna, Ixodes persulcatus, Dermacentor silvarum, а также сибирской красной полевки (Myodes rutilus) [19]. Значительные отличия между подвидами tularensis и mediasiatica были найдены в количестве инсерционных элементов, в строении области pdpD гена острова патогенности (FPI, pathogenicity island of F. tularensis, в области RD1c, а также в отсутствии областей RD17, RD20 [9, 13, 20].
Наиболее широко распространены в мире штаммы вирулентного для человека и животных подвида F. tularensis subsp. holarctica — в Европе, Азии, Японии, Северной Америке, Австралии и Тасмании. Исследованные методом MLVA штаммы подвида holarctica показали значительно меньшую разнородность при несравненно более широком географическом распространении и разделение на 5 групп (B.I—B.V): B.I — Евразия, B.II — Северная Америка и Скандинавия, B.III — Евразия и Северная Америка, B.IV — Северная Америка и Швеция, B.V — Япония [15].
Генетические основы различной степени вирулентности штаммов разных подвидов до сих пор недостаточно известны. Наиболее вирулентными для человека и животных являются штаммы F. tularensis subsp. tularensis, которые распространены только в Северной Америке. При ретроспективном исследовании заболеваемости туляремией в США было показано, что летальность для человека составляла при заражении штаммами группы A.I — 13% против A.II — 0%, A.Ia — 4% против A.Ib — 24%, LD50 (летальная доза для 50% популяции животных) для кроликов <101 м.к., DCL (безусловная смертельная доза, dosis certa letalis) для мышей 1—10 м.к. [16, 21].
Подвид F. tularensis subsp. holarctica характеризуется меньшей вирулентностью для человека, летальность для людей составляла в среднем по стране 7% (LD50 для кроликов >106 м.к., DCL для мышей 1—10 м.к.) [16, 21]. В экспериментах на модельных животных было показано, что вирулентность штаммов подвида F. tularensis subsp mediasiatica ниже, чем для штаммов subsp. tularensis, но выше, чем для штаммов подвида holarctica [19].
Способность штаммов F. tularensis выживать внутри клеток организма хозяина и вызывать заболевание связывают со строением «острова патогенности». У вирулентных для животных и человека подвидов F. tularensis subsp. tularensis, holarctica и mediasiatica была показана дупликация региона FPI размером 30 т.п.н. с 16—19 открытыми рамками считывания (ORFs, open reading frames). У подвида F. tularensis subsp. novicida в геноме присутствует одна копия «острова патогенности» и вставка, кодирующая синтез 50 аминокислотных остатков в области pmcA/anmK гена, которая присутствует также в клетках F. tularensis subsp. mediasiatica, но отсутствует у F. tularensis subsp. tularensis и holarctica. Строение острова патогенности у менее вирулентного подвида F. tularensis subsp. holarctica отличается от F. tularensis subsp. tularensis отсутствием псевдогена pmcA/anmK и значительным сокращением области pdpD гена (рис. 2) [3, 5, 20].
Рис. 2. Сравнение строения «острова патогенности» у вирулентных для человека подвидов F. tularensis [3].
У других видов рода Francisella в геноме присутствует одна копия «острова патогенности», или «FPI подобная» последовательность со строением, близким к одному из 4 вариантов, представленных в статье [3].
Полногеномное секвенирование штаммов F. tularensis началось в 2005 г. Сравнение 13 секвенированных геномов штаммов F. tularensis привело к обнаружению 29 933 однонуклеотидных замен (SNP, single-nucleotide polymorphism) внутри вида, 29 774 из которых были использованы для построения филогенетической модели внутривидового дифференцирования штаммов [22], которая дополняется и совершенствуется до сегодняшнего дня. Методом полиморфизма однонуклеотидных замен были выявлены замены отдельных нуклеотидов (canSNPs), а также делеции и вставки (canINDELs) (INDEL, insertion/deletion) в последовательности ДНК, закрепившихся в той или иной популяции клеток, и была предложена филогенетическая структура деления штаммов на ветви (branch), обозначенные номерами ограничивающих (фланкирующих) 23 canSNPs и 11 canINDELs маркеров (например, B.Br.010/011) или названные по номеру референсного штамма группы (например, B.Br.FTNF002-00) [22—23]. Последующее значительное увеличение количества исследованных штаммов, секвенированных геномов, новые маркерные участки, вносили и вносят постоянные изменения в структуру, терминологию и приводят к трудностям при сравнении результатов различных исследований. В результате вместо использования двух фланкирующих canSNP, в настоящее время используют только номер маркера, который определяет подгруппу. Уже опубликовано свыше 320 canSNP маркеров для дифференцирования генотипов F. tularensis subsp. holarctica [24].
Текущая схема типирования F. tularensis subsp. holarctica определяет 4 основные филогенетические группы штаммов в пределах этого подвида (B.4, B.6, B.12 и B.16) вместо пяти, определенных методом MLVA (рис. 3) [22, 25, 26].
Праймеры, используемые для обнаружения основных филогенетических групп и подгрупп подвида F. tularensis subsp. holarctica, приведены в табл. 2, 3 и описаны в статьях [27—30]. Для каждого INDEL-маркера были разработаны один общий праймер (CP) и два прямых праймера: один внутри (IN) и один вне делеции (OUT). Пара праймеров CP-OUT была использована в качестве положительного контроля [23].
Таблица 2. SNP замены в штаммах F. tularensis subsp. holarctica и праймеры, используемые для их выявления* [28]
| SNP | SCHU S4 SNP положение† | SNP состояние (D/A)‡ | Последовательность праймера, 5` → 3` | Температура отжига, °C§ |
| F.3 | 910179 | G/A | F: GCTGTATCATCATTTAATAAACTGCTG | 55 |
| R: TTGGGAAGCTTGTATCATGGCACT | ||||
| B.2 | 5162 | A/C | F: TTAGTCTATGAGCAGCCAG | 50 |
| R: TAATATCACCAAGGTAGCC | ||||
| B.3 | 470841 | A.G | F: ACGCTAGGTGTCTTGGT | 50 |
| R: CTATATCCGCTCAACAT | ||||
| B.4. | 823672 | T/A | F: TAGACGCACTGGATTTAGGT | 53,5 |
| R: AACCATCACGCCACCATAAG | ||||
| B.5 | 1853655 | T/C | F: TGGATCAAACAACCGT | 50 |
| R: TCTCAAGAGCTGGTGC | ||||
| B.6 | 713647 | A/G | F: AGTAGTGGTAGCGAGGC | 53,5 |
| R: TACCGTTAGCCCAACAG | ||||
| B.12 | 109781 | T/A | F: TACTGCCCAACATAGAG | 55 |
| R: ATCGTGATAAGGCTGGA | ||||
| B.16 | 608245 | T/G | F: ATGCTAGCAAATTACCATCAAAAG | 57 |
| R: AACTCTTCTCGCCATCAACTTCTAT | ||||
| B.17 | 1743207 | A/C | F: CCAAGAGCTAAATTAGCTTCAA | 53,5 |
| R: TGACCAAGAAGGTAGAGGTATTGGTT | ||||
| B.19 | 1373999 | A/C | F: TTGCTACTGATGGTTTAACT | 57 |
| R: CAATACGTCACTTATGCAGTGAT | ||||
| B.20 | 1396082, 1789417 | C/T | F: ATGGGTCGGACTATCACATC | 56 |
| R: ATTATTGTTAAACGGCATCG | ||||
| B.23 | 253120 | A/C | F: GGCAACAGCAGATTCGTGAG | 56 |
| R: TGAAAGCAGGTTTAGAAGGACAG |
Примечание. *SNP, однонуклеотидный полиморфизм; D, полученный; A, исходный; F, прямой; R, обратный. †SNP — положение замены, по последовательности референс штамма Schu S4 (NC_006570); ‡ — ориентация по верхней цепи последовательности Schu S4; § — условия секвенирования.
Таблица 3. INDELs (Ftind) маркеры типирования штаммов F. tularensis subsp. holarctica и праймеры, использованные для их выявления [23]
| INDEL | SCHU S4 INDEL положение | SCHU S4 локус ID | SCHU S4 ген | Праймер | Последовательности праймеров |
| Ftind47 | 271674..271683 | FTT0255 | IN | AGTAATACGCAAGATTTTCTACA | |
| OUT | TCTTAACTGTATGCTAGTCTATGA | ||||
| CP | TAATAGAGCGGCTCTTCGAAT | ||||
| Ftind48 | 960987..961011 | FTT0948 | IN | ATCCTACTAATATCAATTCCAGT | |
| OUT | CCTTCAGCTTGAGTATTTTGACGT | ||||
| CP | ACTGTTATATTCAGTTATTTGCT | ||||
| Ftind38b | 95661..95674 | FTT0092 | appC | IN | ACCCAAAAGCTCACCATCA |
| (псевдоген) | OUT | ATCTTTCTCAGGTACAGACTTTA | |||
| CP | AGTACTATTTGCTTATCCAAGTGAA | ||||
| Ftind49 | 834341..834349 | FTT0816 | IN | AAGATTAAGTGGCAATTTAC | |
| OUT | TTCAACCTGGACAACCACTA | ||||
| CP | AGGATCCCAGTTAGGTTTAGTA | ||||
| Ftind33b | 512045..512063 | FTT0492 | lysR | IN | TCTAAATTTAAGCAATGTTTCTAACT |
| OUT | ATCATCGTATAAGAAATCAACTT | ||||
| CP | TCAACCTTACAGAATAAGAATGT |
Внутри группы B.12 геном штамма LVS отличается от генома штамма FSC200 на 0,08% [12, 31—32]. Между группами, у штаммов FTNF002-00 (группа B.6), LVS (группа В.12) и OSU18 (группа B.4) более 99,9% гомологии [33].
Все штаммы F. tularensis subsp. holarctica отличаются от штаммов других подвидов наличием делеции в позиции 271674..271683 (нумерация по последовательности штамма SCHUS4), определяемой маркером Ftind 47 (см. табл. 3, рис. 3).
Рис. 3. Схематическое филогенетическое древо на основе canSNP (B.) и INDELs (Ftind) F. tularensis subsp. holarctica.
Длина ветвей на схеме не отражает эволюционное расстояние. При наличии указываются альтернативные номера маркеров [25].
Штаммы группы B.4 (или B.OSU18, по референсному штамму, выделенному в США) соответствующие группе B.II, определенной методом MLVA, длительное время выделяли только на территории Северной Америки и в редких случаях в Швеции, а позднее были обнаружены на территориях Норвегии, Германии и Китая [28, 34—36]. Маркер Ftind 38 обнаруживает делецию в позиции 95661..95674 псевдогена appC, а SNP маркер B.17 показывает нуклеотидную замену G на T в позиции 1743207 у штаммов этой группы (нумерация по последовательности штамма SCHUS4) (см. табл. 2 и 3, рис. 3).
Другая филогенетическая группа B.6 соответствует группе B.IV, определенной методом MLVA, и включает в себя подгруппы B.7 и B.10. Маркер Ftind49 обнаруживает делецию в позиции 834341…834349 у штаммов группы B.6 (нумерация по последовательности штамм SCHUS4) (см. табл. 2 и 3, рис. 3).
Подгруппа B.7, или B.OR96-0246 по референсному штамму, выделенному в США, также обозначаемая как генотип B.40 [27], в основном распространена в США и в Скандинавии [34, 36—38].
Подгруппа B.10/11, или B.FTNF002-00, или FTA, по референсному штамму, выделенному во Франции, также обозначаемая как B.41 [27], включает штаммы, распространенные в Западной Европе. SNP маркер B.18 показывает нуклеотидную замену С на Т в позиции 1756146 у штаммов этой группы (нумерация по последовательности штамма SCHUS4) (см. табл. 2 и 3, рис. 3).
Основная филогенетическая группа B.12 соответствует группе B.I, определенной методом MLVA. Маркер Ftind33 обнаруживает делецию в позиции 512045...512063 lysR гена, а SNP маркер B.19 показывает нуклеотидную замену C на A в позиции 1373999 у штаммов этой группы (нумерация по последовательности штамма SCHUS4) (см. табл. 2 и 3, рис. 3). Как выяснилось к настоящему времени, штаммы, принадлежащие к основным филогенетическим группам B.4, B.6 и B.16, чувствительны к эритромицину, а штаммы, принадлежащие к группе B.12 — устойчивы. Штаммы группы B.12 имеют точечную (SNP) мутацию A на C в позиции 2059 во всех 3 копиях rrl гена [39]. В данном случае установление генетической основы устойчивости делает биоварную, фенотипическую дифференциацию истинной, таксономической.
Группа B.12 далее разделена на 6 подгрупп: подгруппу B.71, подгруппу B.39 и подгруппу B.13, описанную ранее как B.Br.013/014 [29], которая далее разделена на 3 подгруппы: B.27, B.20 и B.23. Подгруппа B.20/22 также известна как B.42 или B.FSC200 по референсному штамму, выделенному в Швеции. Подгруппа B.39 известна также как B.FSC162 по референсному штамму, выделенному в Швеции. Подгруппа B.27/32 известна как B.43 или B.F0673 по референсному штамму, выделенному в Грузии. Подгруппа B.23/14, также известна как B.LVS по референсному штамму, выделенному в России. Новая малочисленная подгруппа B.71 определена по единичным штаммам, выделенным в Германии (от енотовидной собаки — в 2012 г., от кабана — в 2015 г. и A-1341, выделенного от человека в 2018 г.) [35].
Штаммы группы B16 (или B.FSC022, по референсному штамму F. tularensis subsp. holarctica bv. japonica, выделенному в Японии) соответствуют группе B.V, определенной методом MLVA [25]. Их длительное время выделяли только на территории Японии [22, 28], а позднее также на территориях Австралии, [25], Турции [40] и Китая [28]. Маркер Ftind 48 обнаруживает делецию в позиции 960987...961011, а SNP маркер B.16 показывает наличие нуклеотида G в позиции 608246 у штаммов этой группы, в отличие от нуклеотида T у всех других штаммов, принадлежащих подвиду F. tularensis subsp. holarctica (нумерация по последовательности штамма SCHUS4) (см. табл. 2 и 3, рис. 3).
Основное количество штаммов возбудителя туляремии, выделенных на территории Российской Федерации, относятся к подвиду F. tularensis subsp. holarctica. По результатам MLVA-типирования по 25 локусам среди 159 штаммов F. tularensis из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» было выявлено 4 подвида и 127 индивидуальных MLVA 25-генотипов. 140 штаммов подвида F. tularensis subsp. holarctica коллекции были разделены на 108 индивидуальных MLVA-генотипов. Два изолята, выделенные на территории Казахстана, показали близкое сходство со штаммами F. tularensis subsp. holarctica bv. japonica, выделенными в Японии, то есть были отнесены к филогенетической группе B.16 (по SNP) или B.V (по MLVA) [41].
На всей территории Российской Федерации циркулируют штаммы возбудителя туляремии подвида F. tularensis subsp. holarctica, которые исходно обнаруживали различную устойчивость к эритромицину и, соответственно, делились на 2 фенотипа: EryS (биовар I) — чувствительные и EryR (биовар II) — устойчивые [42]. На данный момент деление штаммов F. tularensis subsp. holarctica на 2 фенотипа, EryS и EryR, означает деление на основные филогенетические группы — B.4, B.6, B.16 (чувствительные к эритромицину) и B.12 (устойчивые к эритромицину). На территориях почти всех регионов Российской Федерации выделяются как устойчивые к эритромицину штаммы B.12, так и чувствительные. К какой группе, подгруппе принадлежат чувствительные штаммы еще предстоит устанавливать в каждом конкретном случае. Также еще предстоит выяснить, к какой из подгрупп — B.39, B.27, B.23, B.20 или B.71, принадлежат устойчивые к эритромицину штаммы, циркулирующие на территории Российской Федерации. Можно только отметить территории, где выделяются в последние годы в основном штаммы группы B.12, например, в Ханты-Мансийском автономном округе. А в Хабаровском крае и на о. Сахалин преимущественно циркулируют чувствительные к эритромицину штаммы.
В результате эволюции свободноживущие авирулентные более древние виды F. philomiragia и F. novicida превратились в патогенные, зависимые от хозяина штаммы подвидов F. tularensis, и этот процесс сопровождался значительной, независимой потерей функций генов и приобретением инсерционных элементов, обеспечивающих механизмы транслокации при геномных перестройках, которые обусловлены рекомбинационными событиями [7, 9, 11, 12, 31].
Общий механизм генетической изменчивости у бактерий связан с горизонтальным переносом генов. Это показано для многих видов бактерий. В отличие от них у подвидов F. tularensis генетическая вариабельность, в том числе устойчивость к антибиотикам, возникла в результате мутаций, а не от приобретения новых генов путем горизонтального переноса генетического материала [43—45]. Проведенный анализ in silico показал, что штаммы F. tularensis subsp. novicida обладают системой CRISPR/Cas для защиты от вторжения генетических элементов, а у трех вирулентных подвидов F. tularensis (tularensis, holarctica и mediasiatica) гены, ответственные за систему CRISPR/Cas, нефункциональны [31].
В связи с ограниченной генетической вариабельностью геномов F. tularensis subsp. holarctica методы определения числа тандемных повторов (MLVA), выявления замен отдельных нуклеотидов (SNPs), а также делеций и вставок (INDELs) в последовательности ДНК, закрепившихся в той или иной популяции клеток (SNP, Ftind маркеры), и секвенирование остаются предпочтительными генетическими инструментами для молекулярного типирования штаммов внутри подвида.
Филогенетическая модель внутривидового дифференцирования штаммов F. tularensis дополняется и совершенствуется ежегодно. Еще год назад популяции штаммов, выделенных на территориях разных стран, представлялись гомогенными, однако спустя некоторое время это становилось уже не так очевидно. Приведенное в статье схематическое филогенетическое древо на основе canSNP (B.) и INDELs (Ftind) штаммов F. tularensis subsp. holarctica (см. рис. 3) ограничено 10 ветвями и маркером B.71. Однако, как мы уже упоминали, опубликовано свыше 320 SNP-маркеров для дифференцирования генотипов F. tularensis subsp. holarctica. Только в 2020 г. анализом полиморфизма однонуклеотидных замен всего генома штаммов, выделенных на территории Франции, было идентифицировано 82 новых SNP внутри подгруппы B.44 [24]. При этом номер маркера никак не отражает принадлежность к одной из основных филогенетических групп B.4, B.6, B.12 и B.16. Кроме того, один и тот же маркер имеет несколько альтернативных номеров и названий (рис. 3). По этим причинам возникает необходимость привести нумерацию маркеров в соответствие, чтобы по номеру можно было понять, к какой группе, подгруппе, популяции, субпопуляции относится штамм. Как возможный вариант, все маркеры штаммов группы B.4 начинаются с 41...401... и т.д.
Очень сложно понять по номеру родственные отношения штаммов, выделенных в разных странах или в их отдельных регионах. Требуется отдельное исследование, анализ литературы и представление таблиц данных по филогеографии штаммов — какие группы, подгруппы, популяции, экотипы F. tularensis subsp. holarctica циркулируют в той или иной стране или ее части. Это необходимо учитывать по эпидемическим соображениям, а также потому, что внутри голарктического подвида штаммы отличаются по патогенности, хотя и не так значительно, как среди неарктического подвида, по устойчивости к антибиотикам и, соответственно, по необходимым терапевтическим мероприятиям.
Заключение
Так как за последние 10 лет род Francisella значительно расширился и включает в себя уже свыше десятка видов, значение разработки методов диагностики, дифференцирования и типирования штаммов внутри и между видами только возрастает.
В большинстве стран Европы, а также Турции и Японии в последнее время проводится обязательная регистрация туляремии в связи с возможностью использования возбудителя в качестве агента биотерроризма. Только во Франции к настоящему времени секвенированы около 350 геномов микроорганизмов F. tularensis, выделенных от человека и животных [24], но доступны в базах данных очень ограниченное число нуклеотидных последовательностей. Необходимо сравнение российских штаммов со штаммами, циркулирующими на территории Европы, Турции, Казахстана, Китая из-за протяженности границ территории Российской Федерации, наличия многочисленных трансграничных природных очагов, обилия рек, пересекающих границы.
До сих пор дискутируются вопросы о существовании корреляции между генотипом возбудителя туляремии и хозяином, а также клинической формой туляремии.
Также интересен вопрос о том, можно ли использовать эпидемиологические данные, популяционную геномику и пространственное распределение штаммов не только для выявления общего источника инфекции при изоляции близких штаммов от разных хозяев, включая людей, млекопитающих, грызунов, членистоногих и объекты внешней среды, но и для выводов об общих закономерностях появления вспышек инфекции, для построения модели распространения возбудителя туляремии, а также о причинах эндемичности регионов.
Финансирование работы. Работа выполнена в рамках отраслевой программы Роспотребнадзора.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.