CRISPR-Cas-системы адаптивного иммунитета бактерий

Большинство архей и многие бактерии обладают адаптивными (приобретенными) системами иммунитета, известными как CRISPR-Cas (Clastered Regularly Interspaced Palindromic Repeats —CRISPR-associated proteins), с памятью о прошлых столкновениях с чужеродной ДНК — плазмидной, вирусной, транспозонами [1—3]. Память обусловлена сохранением уникальных спейсер-последовательностей, полученных от мигрирующих генетических элементов, внедренных между идентичными, часто палиндромными, повторами нуклеотидных последовательностей (25—50 пн каждый) в составе CRISPR-рядов бактериальных геномов [4, 5].

Таких повторов в разных CRISPR-Cas-системах насчитывается от нескольких единиц до сотен. Их разделяют уникальные спейсеры из 30—40 пн каждый и, кроме того, в составе этих систем находятся прилегающие к CRISPR-ряду кластеры cas-генов, составляющие один или несколько оперонов. Системы CRISPR-Cas отличаются между собой составом генов cas, организацией геномных локусов и кодируемыми Cas белковыми последовательностями. На этих отличиях построена классификация этих систем, предложенная K.S. Makarova и соавт. в 2011 г. [6] (YI). Первоначально различали три основных типа CRISPR-Cas-систем: к типу I отнесены системы, включающие, помимо консервативных cas1 и cas2 и других cas-генов, специфический ген cas3; к типу II — системы с геном cas9; к типу III — системы с геном cas10. Большинство бактериальных штаммов содержат либо один, либо комбинации из двух CRISPR-Cas-типов, но некоторые виды стрептококков наследуют все три типа. Системы одного типа могут отличаться по составу других cas и иных генов и на этом основании они разделяются на подтипы. Для типов I и III CRISPR-Cas-систем характерна похожая организация [6], в то время как тип II в этом отношении уникален. Помимо набора генов из cas1, cas2, cas9, три разных подтипа отличаются содержанием в подтипе II-A дополнительного гена csn2, в подтипе II-B — содержанием гена cas4; подтип II-C не содержит дополнительных генов. В обычном типе II cas-оперон сцеплен с CRISPR-рядом вместе с trans-активирующей CRISPR РНК(trcrRNA).

Число и разнообразие известных на сегодня CRISPR-Cas-систем значительно увеличилось в последние годы. Новая классификация включает 2 класса, 6 типов и 33 подтипа систем [7, 8].

Иммунный ответ CRISPR-Cas включает три последовательные стадии — адаптацию, экспрессию и интерференцию. В стадии адаптации определенный комплекс белков Cas связывается с проникшей в клетку чужеродной молекулой ДНК, продвигается вдоль этой молекулы до встречи с коротким (2—4 пн), отличающимся от других, мотивом РАМ (Protospacer-Adjacent Motiv), и делает два двунитевых разреза в ДНК-мишени. Вырезанный сегмент, протоспейсер, затем вставляется между двумя повторами, чаще всего в проксимальную часть CRISPR-ряда генома хозяина, превращая его в спейсер [9, 10]. CRISPR-ряд затем репарируется с помощью клеточных систем репарации, при этом образуются дупликации прилегающих повторов [11, 12].

В стадии экспрессии локус CRISPR транскрибируется в один длинный транскрипт, pre-crRNA, который затем процессируется особым комплексом Cas-белков или одним большим белком Cas [13, 14] в зрелые crRNA (направляющие, или гидовые, РНК), каждая из которых содержит спейсер и часть прилегающего повтора.

В конечной стадии, интерференции, связанная с Cas-белками crRNA используется, как гид, для узнавания проникшей в клетку близкородственной последовательности чужеродного генома вируса или плазмиды. Геном разрезается и инактивируется Cas-нуклеазой, которая может быть компонентом того же комплекса, либо отдельным Cas-белком [15, 16].

Таким способом CRISPR-Cas-системы специфически узнают и деградируют проникающие в клетки чужеродные ДНК и/или РНК вирусного или плазмидного происхождения.

На молекулярном уровне CRISPR-Cas-системы обладают модульной организацией. Две основные их части представлены адаптационным и эффекторным модулями, которые, соответственно, включают набор генов, кодирующих белки, участвующие в приобретении спейсера (адаптация), и генов, кодирующих Cas-белки, участвующие в процессинге предшественника crRNA с последующим узнаванием мишени и ее разрезании (интерференция). Модули адаптации включают гены белков Cas1 и Cas2, образующих комплекс, в котором эндонуклеаза Cas1 (интеграза) разрезает как протоспейсер-содержащую ДНК, так и CRISPR-ряд, тогда как Cas2-белок является его структурной частью. В некоторых случаях в стадии адаптации участвуют другие Cas-белки, например, Cas3 или Cas4. Белки Cas1 и Cas2, играющие центральную роль в стадии адаптации, являются почти универсально консервативными у всех CRISPR-Cas-типов систем [9, 17, 18]. Эффекторные модули разных CRISPR-Cas-систем чрезвычайно разнообразны в отношении белковых компонентов, ответственных за процессинг транскрибируемой CRISPR-РНК (стадия экспрессии) и деградацию мишени (стадия интерференции). К классу 1 относятся системы с полисубъединичными эффекторными комплексами из нескольких Cas-белков, а классу 2 — те, у которых эффектором является один большой белок со многими доменами. Кроме того, классы 1 и 2 отличаются механизмами процессинга предшественника crRNA. В случае систем 1 класса crRNA образуются при участии комплекса из ряда Cas-белков, в системах же 2 класса процессинг может осуществляться либо внешним бактериальным ферментом, РНКазой III, с помощью других РНК, либо тем же эффекторным белком, который разрезает мишени. Стадия интерференции также отличается в системах разных классов участием разных белков [18].

Модули CRISPR-Cas-систем являются частично автономными, о чем свидетельствуют данные об их участии в рекомбинационных процессах и данные о существовании изолированных адаптационных и эффекторных модулей во многих бактериальных и архейных геномах [18]. Было высказано предположение, что модуль адаптации, по-видимому, предшествовал эволюции компонентов, участвующих в стадиях экспрессии и интерференции CRISPR-Cas-ответа, которые, по всей видимости, присоединились к механизму адаптации в процессе последующих независимых событий при участии отдельных классов мобильных генетических элементов [18—20].

Детали действия Cas1 и Cas2 были интенсивно изучены как in vivo, так и in vitro, с помощью комбинации структурных, биохимических и генетических подходов, давших детальную картину CRISR-Cas-процесса адаптации. Однако вопрос о происхождении механизма адаптации оставался нерешенным.

Открытие нового суперсемейства Cas1-кодирующих самосинтезирующихся транспозонов, названных каспозонами [18, 21—23], позволило предложить правдоподобный сценарий эволюции CRISPR-Cas-механизма адаптации [24] (см. ниже).

Далее также будут рассмотрены данные о разнообразии каспозонов и проведены параллели между реакциями, катализируемыми Cas1-подобными эндонуклеазами и CRISPR-Cas-системами, а также данные об открытии анти-CRISPR-систем и роли Acr-белков в подавлении адаптивного иммунитета.

Каспозоны — самосинтезирующиеся транспозоны архей и бактерий и их роль в происхождении модуля адаптации и адаптивного иммунитета прокариот

Транспозоны являются широко распространенным и важным видом МГЭ, способным к перемещениям из одного местоположения в другое как внутри генома хозяина, так и между разными геномами. Перемещения осуществляются с помощью транспозазы, единственного фермента, кодируемого ДНК-транспозонами, и обычно необходимым условием действия фермента является присутствие терминальных инвертированных повторов, фланкирующих транспозон. Чаще всего миграция происходит при участии механизма «вырезания и вставки» (cut-and-paste).

Отличающаяся группа ДНК-содержащих транспозонов архей и бактерий — самосинтезирующиеся (самореплицирующиеся) транспозоны — были обнаружены в ходе анализов геномного окружения cas1-генов, которые не были локализованы внутри типичных CRISPR-Cas локусов. Одна из таких cas1 групп была связана с генами, кодирующими семейство ДНК полимераз B (ДНКП, ген polB) и несколько других консервативных белков. Было установлено, что локусы, включающие гены cas1 и polB, окружены инвертированными повторами и фланкированы короткими прямыми повторами, которые, соответственно, напоминают терминальные инвертированные повторы (TIR) и дупликации сайтов мишеней (TSD), характерные для различных ДНК- транспозонов. Однако ни один из этих предполагаемых новых транспозонов не кодировал типичной транспозазы или интегразы, которые, как известно, осуществляют интеграцию МГЭ в хромосому хозяина. Единственный белок с активностями, сходными с реакцией интеграции, был гомолог Cas1 эндонуклеазы, консервативной в CRISPR-Cas системах (отсюда название «каспозоны» для этих новых МГЭ). Это предположение было полностью подтверждено последующими экспериментами in vitro. Для того, чтобы отличать истинный белок Cas1 систем CRISPR-Cas от гомологов Cas1 каспозонов, последние получили название « каспозаз» (casposases) [25—27].

Каспозоны варьируют в размерах примерно от 8 тпн до 20 тпн и были идентифицированы в геномах многих архей и некоторых бактерий. На основании данных сравнительной геномики, филогенетических анализов каспозаз и таксономического распределения каспозоны классифицируются в 4 семейства [21, 23, 28]. Семейство 1 элементов кодирует ДНКП, близко родственные праймерным белкам вирусов архей. Каспозоны трех других семейств кодируют дивергентные ДНКП белки, не сходные ни с ДНК-праймерными, ни с РНК-праймерными полимеразами [29]. Благодаря тому, что каспозоны кодируют главный белок, необходимый для их репликации (ДНК-полимеразу), они включены в класс самосинтезирующихся (самореплицирующихся) МГЭ, который включает также эукариотические вирус-подобные транспозоны суперсемейства Polinton/Maverick [23, 30].

Последние кодируют ДНКП, семейство интеграз RVE (ретровирус-подобных) и набор белков, требуемых для образования вирионов. Соответственно было высказано предположение, что полинтоны действительно образуют вирусные частицы и, возможно, должны рассматриваться как полинтовирусы.

Первоначально не были идентифицированы каспозоны, кодирующие вирусные структурные белки, вовлекаемые в процесс морфогенеза вирионов, и поэтому их считали типичными транспозонами [21, 23]. Однако позднее была обнаружена небольшая группа каспозонов, кодирующих вирусный капсидный белок, что указывало на то, что некоторые из этих элементов являются действительно «касповирусами», аналогичными полинтонам [31].

Транспозиции каспозонов еще не были доказаны зкспериментально, но сравнительные геномные анализы многих штаммов архейной бактерии Methanosarcina mazei привели к обнаружению явных следов недавней мобильности, указывающих на то, что, по крайней мере, некоторые каспозоны являются активными транспозонами [32].

Кроме каспозазы и ДНКП, каспозоны семейств 2, 3 и 4 имеют различные наборы генов, кодирующих, главным образом, нуклеазы и ДНК-связывающие HTH-содержащие (helix-turn-helix) домены белков, Некоторые каспозоны несут гены Cas4-подобных нуклеаз, другого белка, присутствующего во многих CRISPR-Cas-системах, хотя не так широко распространенного, как Cas1, которые вовлекаются в процесс адаптации.

Показано близкое сходство между механизмами реакций, катализируемых Cas1 во время интеграции спейсеров в ряды CRISPR, и реакций с участием интеграз во время интеграции транспозонов, что дало возможность заключить, что Cas1 функционирует как интеграза [21, 23].

Каспозоны интегрируются в различные сайты генома [32]. В отличие от типичных транспозонов каспозоны присутствуют только в нескольких (часто в одной) копиях на геном хозяина.

Каспозоны конкурируют с другими МГЭ за сайты интеграции и иногда внедряются в МГЭ, которые в этих случаях выполняют роль векторов в горизонтальном распространении каспозонов [32].

Филогенетическое дерево семейства Cas1-белков разделяется на две основные ветви, одна из которых включает каспозазы, а другая — CRISPR-ассоциированные белки Cas1 [21, 24]. Топология этого дерева вполне совместима с основополагающей ролью каспозазы в эволюции CRISPR-Cas-систем. Весь модуль адаптации этих систем произошел, по-видимому, от каспозонов, привнесших cas1 и, возможно, другие гены, кодирующие, например, cas4, компонент модуля адаптации в нескольких подтипах CRISPR-Cas-систем, а также дополнительные нуклеазы [21, 23]. Белок Cas2 также мог быть кодирован этим предковым каспозоном, хотя до настоящего времени в каспозонах не были идентифицированы гены cas2. Первоначально предполагалось, что последовательности TIR каспозонов могли давать начало повторам систем CRISPR. Однако дальнейшее биохимическое и структурное изучение CRISPR-Cas1 и каспозаз позволило предположить, что повторы CRISPR эволюционировали непосредственно от дуплицированного сайта мишени интегрированного предкового каспозона [25]. Этот сценарий похож на предполагаемый путь происхождения адаптивных иммунных систем позвоночных с участием транспозонов [24, 33].

Роль каспозонов в происхождении CRISPR-Cas-систем убедительно подтверждается данными о близком сходстве реакций, катализируемых каспозазой во время интеграции, и Cas1 во время включения спейсера в CRISPR-ряд [27].

Каспозоны являются первым семейством самореплицирующихся транспозонов, идентифицированным у прокариот. В некоторых отношениях их геномная организация напоминает таковую полинтонов эукариот. В обеих группах мобильных элементов только два универсальных гена — интеграза (транспозаза) и ДНКП, но интегразы являются неродственными, а ДНКП — отдаленно родственны и явно не одинакового происхождения. Иными словами, генный состав в каждом семействе сильно отличается.

Эндонуклеазы семейства Cas1

Эндонуклеазы, Cas1-каспозазы и CRISPR-Cas1-белки, до начала интенсивных исследований CRISPR-Cas-систем оставались малоизученными, но после проведения сравнительного анализа составили новое семейство нуклеаз [34, 35]. Относительно высокое сходство в последовательностях Cas1 и каспозаз и консервативность активного сайта позволили заключить, что общая структура ферментов одинакова.

Несмотря на строгие доказательства мобильности каспозонов, полученных путем сравнительной геномики [28] и экспериментального изучения реакции интеграции, механизм вырезания каспозона из хромосомы хозяина и участие каспозазы в этом процессе остаются недоказанными. Попытки определить разрезание субстратов ДНК в соответствующей прилегающей TIR-TSD-области не были успешными [26]. Не исключено, что каспозаза действует исключительно как интеграза, а новые линейные копии каспозона синтезируются de novo с использованием интегрированного каспозона и кодируемого им фермента ДНКП.

Интегразные активности каспозазы и Cas1. Эффективная интеграция протоспейсера, осуществляемая Cas1 эндонуклеазой, требует присутствия Cas2-белка. Два димера Cas1 соединены с димером Cas2 в гетерогексамерный комплекс. Cas1 — энзиматически активный компонент этого комплекса, тогда как нуклеазная активность Cas2 не является необходимой. Показано, что мутантный Cas2 в комплексе Cas1—Cas2 не влияет на активность интеграции in vivo и in vitro [36, 37]. Интеграция протоспейсера может происходить даже в отсутствие Cas2, хотя и с меньшей эффективностью. Спейсеры интегрируются в 5’-конец CRISPR-ряда, приводя к дупликации соответствующего повтора [5, 9].

В случае каспозонов единственным белком, требующимся для интеграции in vitro, является каспозаза [27]. Первоначально считали, что каспозаза катализирует внедрения каспозона в случайные сайты генома хозяина, но последующее изучение показало, что существует выраженное предпочтение в присутствии точного сайта мишени. Важно, что последовательности, соответствующие сайтам мишеней при интеграциях протоспейсера (лидерная последовательность, расположенная перед CRISPR-рядом с прилегающим сегментом из 18 п.н.) и каспозона, имеют большое сходство. Такое предпочтение подтверждено также обнаружением тандемных внедрений каспозонов, где каждый новый внедряющийся каспозон располагался перед предшествующим внедренным каспозоном [27]. Несмотря на различия интеграз, реакции интеграции протоспейсеров и каспозонов, катализируемые Cas1—Cas2 и каспозазами, соответственно, очень похожи [38, 39]. Этим еще больше подчеркивается очевидная прямая эволюционная связь двух систем.

Полифункциональность CRISPR-Cas-систем

CRISPR-Cas системы имеют сложную и разнообразную молекулярную организацию и, по всей видимости, участвуют в осуществлении разных функций, которые отличаются от адаптивного иммунитета. CRISPR-Cas-системы оказывают влияние на горизонтальный перенос генов, связаны с системами репарации ДНК, программированной гибелью клеток, влияют на регуляцию генов вирулентности и ответа на стресс, групповое поведение бактерий и другие клеточные функции [40—43]. В этом разделе статьи мы рассмотрим лишь некоторые примеры таких функций.

К настоящему времени накоплено множество доказательств, что CRISPR-Cas-системы, помимо защиты от МГЭ, включая вирусы, плазмиды и транспозоны, ингибируют горизонтальное распространение генов как при конъюгативном переносе плазмид и с их помощью хромосомных фрагментов донора, так и при трансформации. В случае же трансдукционного переноса генов бактериофагами часто имеется повышение частоты трансдукции из-за подавления фаговой репродукции системами CRISPR-Cas и увеличения частоты выживаемости трансдуктантов. Стимулирующий эффект CRISPR-Cas-иммунитета на трансдукцию объясняется низким содержанием трансдуцирующих частиц в фаговой популяции, из-за которого CRISPR-Cas-системы приобретают спейсеры против фаговых частиц значительно чаще, чем спейсеры против трансдуцируемой ДНК [44]. Наряду с этим было открыто явление CRISPR-толерантности, при котором бактерии сохраняют МГЭ, хотя их CRISPR-Cas-система содержит специфические спейсеры в отношении данных МГЭ [45]. Механизм такой толерантности пока непонятен, но предполагается, что в этих случаях эффект зависит от концентрации эффекторного белка (в случае систем типа II — cas9). При достижении высокой концентрации белка генетический материал МГЭ элиминируется.

CRISPR-Cas-системы связаны с системами репарации и их механизмами действия, эта связь существует на разных уровнях и может оказывать большое влияние на жизнедеятельность бактерий. Биохимические процессы, участвующие в репаративных процессах и в CRISPR-Cas опосредованном иммунитете практически перекрываются. В обоих случаях происходит разрезание ДНК, сопровождаемое заполнением бреши и лигированием. Cas-белки содержат домены, гомологичные доменам белков репарирующих систем [46]. Прямая функциональная связь CRISPR-Cas с репарацией существенна на стадии адаптации при восстановлении репарирующей системой целостности CRISPR-ряда после внедрения спейсера [47]. Кроме того, было показано, что белок Cas3a, транскрипционный регулятор, активирующий гены CRISPR-адаптации, дополнительно ко-активирует множество репарирующих генов, что свидетельствует о функциональной координации между механизмами систем CRISPR-Cas и репарации [48].

Многие патогены млекопитающих содержат в составе своих геномов системы CRISPR-Cas II типа, включая такие важные патогенные бактерии, как Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Neisseria meningitides, Campilobacter jejuni, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori. Эти патогены способны вызывать как острые, так и хронические заболевания хозяина или связаны с появлением осложнений.

Общей характеристикой для перечисленных бактерий является их способность экспрессировать сиалированную структуру липоолигосахарида (LOS) клеточной оболочки,являющуюся важным фактором вирулентности этих бактерий (адгезия, вторжение, перемещение по клеткам эпителия и уклонение от ответа иммунной системы хозяина). На примере C. jejuni показано, что делеция cas9 гена ведет к утрате способности бактерий перемещаться по эпителиальным клеткам хозяина, к более эффективному связыванию с сывороткой человека, что указывает на роль cas9 и LOS в вирулентности [41, 43]. Дополнительные доказательства получены при введении гена cas9 в геном изолята патогена, не имеющего CRISPR-Cas-системы, результатом которого являлось значительное увеличение вирулентности.

Показано также, что экспрессия нескольких локусов CRISPR-Cas типа I индуцируется стрессом оболочки бактерий, который может быть вызван вирусной инфекцией, антибиотиками или другими факторами [49].

Хорошо изученным случаем влияния CRISPR-Cas на бактериальную оболочку является система подтипа II Francisella novicida, усиливающая целостность оболочки и придающая устойчивость к определенным антибиотикам [50]. У этой бактерии избыточная продукция специфического бактериального липопротеина (BLP) в бактериальной мембране значительно снижает выживаемость бактерий в макрофагах хозяина и регуляция его продукции оказывает влияние на их уклонение от врожденного иммунитета.

Опосредованная белком Cas9 деградация мРНК BLP активируется после фагоцитоза бактерий макрофагами. Эффект обусловлен подавлением выработки липопротеина белком Cas9 в комплексе с двумя видами малых РНК — кодируемыми в локусе CRISPR-Cas транс-активирующей CRISPR RNA (tracrRNA), а также scaRNA (small CRISPR-Cas-associated RNA) [41]. Подавление продукции липопротеина позволяет клеткам F.novicida избегать иммунного ответа хозяина и таким образом влиять на вирулентность бактерий [41, 43, 51].

Механизмы повышения вирулентности у других бактерий пока еще недостаточно изучены. Однако в случае Streptococcus agalacticae было показано, что Cas9 подавляет экспрессию регулятора транскрипции RegR, репрессора гена гиалуронидазы, фермента, существенного для вирулентности [43].

Регуляция состояния бактериальной оболочки особенно важна во время мембранного стресса, чтобы противостоять этому стрессу и бороться с ним, а также способствовать выживанию бактерий. Были получены данные, что экспрессия CRISPR-Cas-компонентов у некоторых видов бактерий может быть индуцирована оболочечным стрессом. Так, у E. coli при сверхэкспрессии белка GFP следующий за этим оболочечный стресс-ответ запускает повышенную экспрессию CRISPR-Cas-системы. У других видов бактерий и архей, включая Streptococcus thermophilus и Sulfolobus islandicus, эти системы индуцируются бактериофагами [52, 53]. Оболочечный стресс часто сигнализирует о повышении проницаемости оболочки для проникновения в клетки чужеродных нуклеиновых кислот и способствует индукции экспрессии защитных систем бактерий.

Идентифицированы также другие белки и другие механизмы CRISPR-Cas-систем бактерий, влияющие на вирулентность бактерий. Например, Cas2, присутствующий в системе типа II CRISPR-Cas, важен для обеспечения способности бактерий Legionella pneumophila выживать внутри амеб [54].

Анализ вирулентности на модели мочевого тракта мышей двух изолятов Enterococcus faecalis, из которых один содержал тип II CRISPR-Cas-системы, а другой не имел ее, показал, что при заражении мышей CRISPR-Cas-содержащий штамм вызывал смертность мышей быстрее. Гистологические исследования показали, что этот штамм обладал повышенной способностью образовывать биопленки, что позволяло бактериям быстрее колонизировать органы мышей по сравнению со штаммом, утратившим CRISPR-Cas систему [55]. Установлено также, что тип 1 CRISPR-Cas-системы Pseudomonas aeruginosa играет роль в модулировании образования биопленок [56]. Точный механизм регуляции в данном случае неизвестен, но предполагается, что CRISPR-Cas-система взаимодействует со специфическим геном интегрированного в хромосому профага, ингибируя образование биопленки. Эти авторы обнаружили также, что инфицирование изолята РА14 бактериофагом DMS3 блокирует как образование биопленки, так и подвижность, и эти изменения зависят от присутствия типа I-F CRISPR-Cas-системы. Позже было показано, что в этом типе системы присутствует спейсер, транскрипция которого, по предположению, ведет к образованию антисмысловой РНК, участвующей в выключении гена, ответственного за образование биопленки [57].

Таким образом, системы CRISPR-Cas могут влиять на патогенность бактерий посредством двух, не исключающих друг друга процессов: с одной стороны, защиты от мобильных элементов, способных привносить потенциальные факторы вирулентности (гены антибиотикорезистентности, токсинов), приводящей к потенциальному снижению вирулентности, с другой — контроля экспрессии генов, способствующего повышению вирулентности, например, в результате стимулирования процесса колонизации хозяина бактериями.

Одной из особенностей организации локусов адаптивного иммунитета бактерий и архей является обычное присутствие в них генов, связанных с программируемой клеточной смертью (PCD), таких как модулей токсин-антитоксин и абортивной инфекции [58, 59]. Такая локализация генов иммунитета и PCD может свидетельствовать о функциональном объединении двух защитных систем с общим участием их белков в иммунном ответе [60]. Помимо указанного ряда функций, CRISPR-Cas-системам свойственно утрачивать свойства адаптации и интерференции, инициировать появление дефектных вариантов, выполняющих отличающиеся от адаптивного иммунитета роли [18, 61]. Также системы CRISPR-Cas или их отдельные составляющие обнаружены в вирусах, транспозонах и плазмидах [18]. Они являются либо полноценными вариантами систем, действующими в этих случаях против защитных систем хозяина [62, 63], либо мини-вариантами, утратившими ряд функций этих систем. До сих пор роль таких вариантов в большинстве случаев не исследована экспериментально и пока недостаточно данных для суждения об их вкладе в эволюцию микроорганизмов.

Анти-CRISPR-Cas-гены (acr) мобильных генетических элементов

CRISPR-Cas-локусы идентифицированы в секвенированных геномах примерно у 40% бактерий и 85% архей и часто распространяются с помощью МГЭ [64, 65]. Они способствуют сохранению памяти об определенных инфицирующих элементах, их узнаванию, и препятствуют инфекции.

В ответ на проявление иммунного ответа, обусловленного системами CRISPR-Cas, многие МГЭ выработали ингибиторы этих систем, анти-CRISPR-белки (Acr) [66]. Первые acr-гены были открыты у Mu-подобных фагов, благодаря их способности ингибировать тип I-F CRISPR-Cas-систем Pseudomonas aeruginosa [67]. Позднее появились сообщения о многих других негомологичных Acr-белках, подавляющих разные типы CRISPR-Cas-систем (II, III, V) [68], включая Acr, кодируемые не фаговыми МГЭ, такими как конъюгативные плазмиды и конъюгативные острова (ICEs), профаги, транспозоны, интегроны и другие неохарактеризованные элементы различных бактериальных видов [64, 69]. На сегодня известны 46 различных семейств Acr-белков, подавляющих различные подтипы CRISPR-Cas, из которых 11 являются ингибиторами системы типа II-A Cas9. Белки разделены на классы 1 и 2 ингибиторов, имеют небольшие размеры (обычно 50—330 аминокислот) и не имеют сходства по последовательностям или белковым доменам ни между собой, ни с каким-либо белком с известной функцией [70].

Гены этих белков образуют кластеры с генами, получившими название aca (anti-CRISPR-associated genes), кодирующими более консервативные Aca-белки (Aca). Их функции еще на совсем ясны, но тот факт, что часто эти гены кодируют белки, содержащие НТН-мотив (helix-turn-helix), свидетельствует о том, что они выполняют регуляторные функции, являясь репрессорами транскрипции acr-генов. Гены aca широко распространены и часто используются для открытия новых acr-локусов [64, 71—73].

Основываясь на общей характеристике известных Acr-белков и анализе доступных прокариотических последовательностей, гомологи acr-генов были обнаружены в составе хромосом и мигрирующих генетических элементов многих бактериальных семейств, таких как Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Burkholderiaceae, Halomonadaceae, Yersiniaceae, Vibrionaceae и др. [64].

Получение структурных и биохимических характеристик Acr-белков выявило отличающиеся по направленности ингибирующие активности, включающие вмешательство в образование crRNA, подавление узнавания ДНК-мишени и разрезания ДНК. Вновь открытые семейства Acr-белков проявляют существенные различия в биохимических свойствах — молекулярной массе, колеблющейся от 7,5 до примерно 20 кД, и прогнозируемых средних изоэлектрических точках от кислотного заряда (pH — 4) до основного (pH — 10). Эти данные вместе с наблюдаемым отсутствием у них гомологичных последовательностей указывали на наличие существенных отличий в их механизмах действия.

Проведенные генетические, биохимические и структурные анализы привели к пониманию механизмов действия некоторых Acr белков 1 и 2 классов [64, 74]. Acr-белки 1 класса, изученные к настоящему времени, вмешиваются в работу типа I CRISPR-Cas-систем. Описаны два способа нарушения стадии интерференции — наиболее общим является непосредственное взаимодействие с множественно субъединичным Cas-белковым комплексом, предотвращающее связывание с ДНК, в то время как менее часто имеется прямое взаимодействие с нуклеазой Cas3 с последующей блокировкой разрезания ДНК. Класс 2 Acr белков активен в отношении типов II, V и VI CRISPR-Cas-систем. Почти все они непосредственно взаимодействуют с эндонуклеазой Cas9, хотя механизмы их взаимодействия отличаются [66, 67]. В настоящее время продолжают разрабатываться многочисленные стратегии для идентификации Acr-белков с удивительно разнообразным спектром раскрываемых механизмов ингибирования CRISPR-Cas-систем [75].

Открытие Acr белков объясняет, как МГЭ могут существовать и распространяться, несмотря на частое их уничтожение системами адаптивного иммунитета. Acr являются мощным стимулом появления разнообразных CRISPR-Cas-систем в природе и накопления других защитных систем в геномах прокариот. Так как МГЭ способствуют образованию геномных перестроек и обеспечивают основу обширных возможностей обмена прокариотическими генами, изучение механизмов действия Acr-белков позволяет лучше понять взаимодействия МГЭ с хозяином и горизонтальное распространение генов, кодируемых МГЭ (например, резистентности к антибиотикам), среди микробиомов. Практическое значение Acr-белков определяется их способностью повышать эффективность фаготерапии или доставку генов в составе различных МГЭ-платформ, а также их активным использованием в арсенале биотехнологий, например, при редактировании геномов [76].

Открытие специализированных, разнообразных кодируемых МГЭ-белков, нарушающих CRISPR-Cas-иммунитет, объясняет способность МГЭ существовать, несмотря на высокую активность адаптивных иммунных систем. Они стимулируют появление разнообразных защитных систем и их накопление в геномах прокариот, а их изучение способствует лучшему пониманию взаимоотношений МГЭ с хозяином и механизмов горизонтального переноса признаков, кодируемых МГЭ у бактерий.

Финансирование работы отсутствует.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.