Введение
В современный период 7-й пандемии холеры (с 1961 г. по настоящее время), возбудителем которой является Vibrio cholerae O1 биовара Эль Тор, продолжаются многочисленные вспышки этой инфекции в эндемичных регионах Юго-Восточной Азии и Африки [1]. Такая ситуация создает высокий риск дальнейшего распространения холеры на территориях неэндемичных стран, включая Российскую Федерацию.
Относительно редкие эпидемические вспышки или спорадические случаи холеры в России всегда имели заносной характер и были вызваны токсигенными штаммами V. cholerae Эль Тор, входящими в две основные группы: типичные изоляты и их природные генетические варианты или атипичные штаммы, имеющие ряд изменений в геноме, представленном двумя хромосомами [2, 3]. При этом заносы холеры в Россию, происходящие на протяжении более 50 лет (1970—2023 гг.), совпадали с временным периодом трех волн глобального распространения возбудителя из первичного очага, сформированного в районе Бенгальского залива [4]. Первая волна 7-й пандемии (1961—1987 гг.) была обусловлена токсигенными штаммами V. cholerae Эль Тор с типичными для этого биовара генетическими свойствами: наличие в составе ключевых генов патогенности ctxAB и tcpA-F, кодирующих холерный токсин (CT от cholera toxin) и токсин-корегулируемые пили (TCP от toxin-coregulated pilus), аллелей ctxB3 и tcpAEltor соответственно и присутствие острова пандемичности VSP-II [5]. Возникновение вначале 90-х годов прошлого столетия в Юго-Восточной Азии атипичных штаммов возбудителя холеры Эль Тор с измененными генами CT, несущими в составе оперона ctxAB аллель ctxB1 холерных классических вибрионов, вызывавших первые шесть пандемий холеры (1817—1923 гг.), привело к постепенному вытеснению ими типичных штаммов в период 2-й волны пандемии в 1990—2002 гг.[6]. Кроме того, у этих геновариантов была изменена резистентность к антибиотикам за счет приобретения типичными штаммами дополнительного участка ДНК размером 93,7 тпн — интегративного конъюгативного элемента ICE (от integrative conjugating elements) SXT с генами устойчивости к лекарственным препаратам [7]. Вместе с тем в ходе дальнейшей эволюции в геноме впервые возникших атипичных штаммов появились новые однонуклеотидные замены в ключевых и дополнительных генах патогенности ctxB, tcpA и rtxA, кодирующих B-субъединицу CT, основной белок TCP и многофункциональный цитотоксин MARTX (multifunctional autoprocessing repeats-in toxin) соответственно, а также возникла протяженная делеции в геноме острова пандемичности VSP-II. Следствием таких изменений стало появление штаммов с ранее неизвестными аллелями этих генов (ctxB7, tcpACIRS101, rtxA4) и делетированного VSP-IIΔ (Δvc0495-vc0512) [8—10]. Более того, у этих геновариантов возникли точечные мутации в коровых генах gyrA (G248T) и parC (C254A), кодирующих топоизомеразы, а также в регуляторном гене carR (G265A), обусловившие резистентность патогена к налидиксовой кислоте и утрату устойчивости к полимиксину B — одному из диагностических признаков вибрионов Эль Тор [11, 12]. Эти изменения генома привели к усилению вирулентности возбудителя холеры [13, 14]. Именно такие варианты геноварианты, повсеместно выявляемые в эндемичных регионах, обусловили единичные случаи холеры в России в 2010—2014 гг. [15]. Тем не менее, несмотря на глобальное распространение новых вариантов возбудителя холеры с высоким патогенным и эпидемическим потенциалом, эпидемиологическая обстановка по холере на территории России оставалась благополучной в течение 8 последующих лет. И лишь в 2023 г. был зарегистрирован занос токсигенных штаммов V. cholerae Эль Тор, изолированных как от больных, так и из воды поверхностного водоема. Такая ситуация послужила основанием для изучения их генетической организации, поскольку в последние десятилетия на территории эндемичных по холере стран циркулируют популяции холерных вибрионов с разной комбинацией измененных генов, различающихся патогенным и эпидемическим потенциалом.
Наряду с токсигенными в этот же период времени были обнаружены и нетоксигенные штаммы V. cholerae Эль Тор, которые присутствуют в основном в поверхностных водоемах и лишь изредка выделяются от людей. Геном ранее изолированных в России нетоксигенных штаммов был весьма вариабелен, вследствие чего разные изоляты имели различный набор генов патогенности [16]. Так, ряд штаммов содержали гены tcpA-F, определяющие продукцию TCP, обеспечивающих колонизацию вибрионами тонкого кишечника. Более широко были распространены нетоксигенные вибрионы, не имеющие генов tcpA-F, но с различными генами, кодирующими дополнительные факторы патогенности: генами термолабильного гемолизина (hlyA), растворимой гемагглюютинин-протеазы (hapA), цитотоксина RTX (rtxA) [16]. При заражении ими в восприимчивом организме могут реализовываться эти факторы патогенности, вызывая острые кишечные инфекции (ОКИ). В этой связи особый интерес представляло изучение структуры генома и оценка уровня экспрессии дополнительных факторов патогенности у недавно (2023 г.) изолированного от человека с ОКИ нетоксигенного штамма V. cholerae Эль Тор.
Цель работы — сравнительный анализ генома нетоксигенного и токсигенных штаммов V. cholerae O1 Эль Тор, выявленных на территории России в 2023 г., и их филогенетический анализ.
Материал и методы
Штаммы бактерий, условия культивирования. Исследуемые токсигенные и нетоксигенные штаммы представлены в таблице. Штаммы, полученные из Государственной коллекции патогенных бактериий РосНИПЧИ «Микроб», культивировали в бульоне и на агаре Luria-Bertani (LB) при 37 °C. Для филогенетического анализа использовали нуклеотидные последовательности полных геномов 73 токсигенных (53 штамма) и нетоксигенных (20 штаммов), полученных нами или взятых из базы данных NCBI GenBank (см. таблицу).
Штаммы Vibrio cholerae O1, использованные в работе
|
Штамм |
Место и год выделения |
Биовар |
ctxAtcpA |
Аллель гена ctxB |
Аллель гена tcpA |
Аллель гена rtxA |
VSP-II |
Тип SXT |
|
569В |
Индия, человек, 1950 |
Классический |
ctxA+tcpA+ |
ctxB1 |
— |
— |
— |
— |
|
М3208 |
РФ, Тамбовская обл., человек, 2023 |
Эль Тор |
ctxA+tcpA+ |
ctxB7 |
CIRS101 |
rtxA4a |
∆VC0495-VC0512 |
ICEVchInd5 ΔVRIII |
|
М3210 |
РФ, Ростов н/Д, в/с, 2023 |
Эль Тор |
ctxA+tcpA+ |
ctxB1 |
Eltor |
rtxA1 |
интактный |
ICEVchBan9 ΔVRIII |
|
3265/80 |
РФ, Москва, человек, 2014 |
Эль Тор |
ctxA+tcpA+ |
ctxB7 |
CIRS101 |
rtxA4 |
∆VC0495-VC0512 |
ICEVchInd5 |
|
М3209 |
РФ, Мелитополь, человек, 2023 |
Эль Тор |
ctxA-tcpA- |
— |
— |
37/91 |
— |
— |
Примечание. в/с — внешняя среда; цифры через черту (/) указывают количество несинонимичных и синонимичных замен в гене rtxA.
Определение подвижности, продукции термолабильного гемолизина и растворимой гемагглютинин/протеазы. Продукцию растворимой гемагглютинин/протеазы (HA/P) и термолабильного гемолизина определяли путем нанесения изолированных колоний штаммов V. cholerae методом реплик на пластинку 1% LB агара (pH 7,2), содержащего соответственно либо 10% обезжиренного молока, либо 3% взвесь эритроцитов барана. Оценку результатов проводили согласно общепринятым методам [17, 18]. Подвижность исследуемых штаммов определяли путем нанесения колоний методом реплик на 0,3% LB агар. Результаты учитывали после инкубирования в течение 18—24 ч при температуре 30 °C, измеряя в мм зону роения у подвижных штаммов или отсутствие таковой у неподвижных.
Оценка резистентности к антибиотикам. Оценку чувствительности бактериальных штаммов к антибиотикам осуществляли методом диско — диффузии с использованием следующих препаратов: полимиксина B (300 мкг) и налидиксовой кислоты (30 мкг) (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия). Также определение чувствительности штаммов к антибиотикам осуществляли методом реплик 18-часовых агаровых культур, путем нанесения изолированных колоний на плотную среду с хлорамфениколом (30 мкг), тетрациклином (10 мкг), стрептомицином (25 мкг), триметопримом (25 мкг), сульфаметоксазолом (200 мкг) и полимиксином B (50 мкг) фирм HiMedia Laboratories Pvt. Limited (Индия) и Oxoid (Великобритания).
Выделение и очистка геномной ДНК. Выделение и очистку геномной ДНК проводили из бактериальной суспензии с использованием коммерческого набора Axy Prep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit (Axygen Biosciences, США) в соответствии с протоколами производителей и МУ 1.3. 2569-09. Клетки предварительно обрабатывали мертиолятом натрия до конечной концентрации 1:10 000 (0,01%) и прогревали при температуре 56 °C в течение 30 мин.
Полногеномное секвенирование и SNP-типирование. Для полногеномного секвенирования 38 штаммов, выделенных ранее на территории России и сопредельных стран, было приготовлено по 0,5—1,0 мкг геномной ДНК в соответствии с рекомендациями производителя. Секвенирование проводили на генетическом анализаторе Ion PGM (Ion Torrent). Полученные единичные чтения были скорректированы с использованием программного обеспечения Ion Torrent Suite Software v. 5.4 и собраны de novo в контиги с помощью программы Newbler GS Assembler v. 2.6. Штаммы M3208, M3209 и M3210, изолированные в России в 2023 г., были секвенированы с использованием двух других технологий — Illumina NextSeq 550 и Oxford Nanopore Technologies (ONT) MinIon. Из полученных прочтений ONT (N50 = 3000 п.н.) с помощью программы Trycycler v. 0.5.4 были собраны полные последовательности двух хромосом. Далее на полученные сборки были последовательно картированы прочтения ONT и более точные прочтения Illumina для исправления ошибок сборки с помощью программ Medaka и Polypolish. Качество полученных в результате сборки последовательностей было оценено алгоритмом Busco (набор данных gammaproteobacteria_odb10), который показал, что целостность геномов штаммов M3208 и M3209 составила 100%, а штамма M3210 — 99.7%. Наличие и тип SXT определяли путем сравнительного анализа полногеномных последовательностей исследуемых штаммов относительно последовательностей рефернсных штаммов — 7452 (ICEVchInd5) и MJ-1236 (ICEVchBan9) [7]. Поиск единичных точечных мутаций (SNPs) и контроль достоверности результатов осуществляли картированием ридов и собранных в контиги фрагментов генома исследуемых штаммов на референсную последовательность штамма V. cholerae O1 биовара Эль Тор N16961 посредством программы Snippy v.4.6.0. (https://github.com/tseemann/snippy). Филогенетическое дерево строили с применением алгоритма Байесовского филогенетического анализа с помощью программы MrBayes v.3.2.7a. на основе SNP-матрицы полученной с помощью программы Snippy. Визуализацию полученных результатов осуществляли в программе FigTree v.1.4.4. Анализ нуклеотидных последовательностей выполняли с помощью программ UGENE v.45.1 и Bandage v.0.8.1.
Результаты и обсуждение
Филогенетический анализ недавно выделенных в России штаммов V. cholerae Эль Тор. Для выяснения генетических связей трех штаммов V. cholerae Эль Тор из России (M3208, M3209, M3210), обнаруженных в 2023 г., с другими токсигенными и нетоксигенными штаммами холерных вибрионов Эль Тор, изолированными в разные годы и на различных территориях, включая эндемичные страны, мы провели их филогенетический анализ. На дендрограмме, построенной на основе анализа 85114 коровых SNPs полногеномных последовательностей 73 штаммов (41 штамма из России и сопредельных стран, 32 — из эндемичных регионов 9 стран Азии и Африки), было выявлено три основных кластера (рис. 1, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_01_038_add.zip). Нетоксигенные штаммы, различающиеся по структуре генома, входили в состав двух кластеров. Кластер I-й включал 13 изолятов, лишенных не только структурных генов CT, локализованных в геноме профага CTXφ, но и генов tcpA-F из острова патогенности VPI-1. Их отличия от референсного токсигенного штамма N16961 достигали в среднем 39187 SNPs, что указывает на значительную удаленность от токсигенных изолятов с генотипом ctxA+tcpA+. Филогенетически более близкими к токсигенным оказались нетоксигенные штаммы из кластера II (7 изолятов), имеющие в геноме VPI-1 с генами tcpA-F и отличающиеся от референсного по 9860 SNPs. Что касается выделенного в 2023 г. от человека нетоксигенного штамма V.cholerae М3209, то он входил в наиболее обособленный кластер I, в пределах которого имел тесные генетические связи с нетоксигенными изолятами из Элисты — V. cholerae 132 (2013 г.) и 3017 (2018 г.) (см. рис. 1 https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_01_038_add.zip. Полученные данные, подтвердив выраженную гетерогенность нетоксигенных штаммов, свидетельствуют о том, что популяции холерных вибрионов, лишенные мобильных элементов с ключевыми генами патогенности, широко распространены на территории России и имеют, видимо, независимое происхождение от токсигенных.
В отличие от нетоксигенных все изученные токсигенные штаммы (53 изолята), независимо от места и времени выделения (1961—2023 гг.), входили в состав кластера III, отличаясь от референсного в среднем по 123 SNPs (см. рис. 1, https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_01_038_add.zip). Дивергенция штаммов этого кластера от нетоксигенных была четко связана с приобретением ими ключевых генов патогенности и эпидемичности в составе профага CTXφ, а также островов патогенности VPI и пандемичности VSP. Тем не менее в пределах этого кластера штаммы четко разделились на 3 группы в зависимости от временного периода трех волн текущей пандемии холеры (см. рис. 1 https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_01_038_add.zip). Об этом свидетельствует присутствие в каждой из них контрольных штаммов из эндемичных очагов с известной принадлежностью к каждой волне пандемии: CRC711, N16961-1-я; MJ-1236-2-я; VN243P_07, CIRS101-3-я. В первую группу входили типичные штаммы возбудителя (7 изолятов), вызвавшие начало пандемии (1-я волна), основными генетическими маркерами которых стали аллели ключевых генов патогенности ctxB3, tcpAEltor и интактный остров пандемичности VSP-II (отличия от референсного штамма — 47 SNPs) (см. рис. 18, кластер III, волна 1-я, см.https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_01_038_add.zip). В последующей 2-ой волне пандемии произошло замещение типичных штаммов атипичными с измененными генами ctxAB, кодирующими CT: в гене ctxB вместо аллеля ctxB3 появился новый аллель ctxB1. Более того, эти штаммы отличались от типичных измененной резистентностью к антибиотикам, обусловленной приобретением возбудителем нового мобильного элемента SXT, относящего к интегративным конъюгативным элементам (или ICE от integrative conjugating element). Именно штаммы с генотипом ctxB1 tcpAEltor ICE SXT образовали 2-ю группу и различались с референсным по 106 SNPs (см. рис.1, кластер III, волна 2-я, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_01_038_add.zip). В состав другой (3-й) группы атипичных штаммов входили 35 штаммов из 3-й волны пандемии, в геноме которых возникли новые мутации в генах патогенности, эпидемичности и лекарственной устойчивости. Изолированные в ранний период 3-й волны штаммы отличались от изолятов из 2-й волны новым аллелем гена tcpA — tcpACIRS101, а также точечными мутациями в генах gyrA и parC, кодирующих топоизомеразу II (ДНК-гиразу) и топоизомеразу IV соответственно, которые обусловили появление резистентности к налидиксовой кислоте. Наряду с сохранением указанных изменений у штаммов из позднего периода 3-й волны в результате дополнительных мутаций появились новые аллельные варианты генов ctxB (ctxB7), rtxA (rtxA4а), а также протяженная делеция в VSP-II и в ряде случаев в ICE SXT. Кроме того, мутация в регуляторном гене carR привела к появлению штаммов, утративших резистентность к полимиксину — фенотипического маркера холерных вибрионов Эль Тор. Следствием таких изменений генома стало усиление вирулентности новых вариантов возбудителя и повышение эпидемического потенциала, что привело к их глобальному распространению в эндемичных регионах [10, 13, 19]. Их отличия от референсного штамма достигали 128 SNPs (см. рис. 1, кластер III, волна 3-я, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_01_038_add.zip). Что касается недавно выявленных в России токсигенных штаммов V. cholerae M3208 и M3210, то анализ построенной дендрограммы показал, что они относились к атипичным штаммам из кластера III, однако входили в состав разных групп. Выделенный из воды штамм M3210 оказался генетически сходным со штаммами из 2-й волны с генотипом ctxB1tcpAEltorICE SXT, широко распространенными вначале 90-х годов прошлого века в эндемичных регионах Азии и Африки (см. рис. 1, кластер III, волна 2-я, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_01_038_add.zip)). В то же время клинический штамм M3208 входил в состав группы высоковирулентных новых вариантов атипичных штаммов с генотипом ctxB7tcpACIRS101rtxA4agyrA(G248T)parC(C254T)carR(G265A)VSP-IIΔ. При этом была обнаружена тесная филогенетическая связь со штаммами новых вариантов из Индии (см. рис. 1, кластер III, волна 3-я, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_01_038_add.zip). Таким образом, проведенный филогенетический анализ показал, что выявленные в 2023 г. токсигенные штаммы V. cholerae M3208 и M3210, относились к разным вариантам атипичных штаммов и входили в состав различных филогенетических групп, различающихся по генотипу. Эти данные свидетельствуют о том, что в современный период пандемии на территории эндемичных стран распространены не только новые варианты возбудителя из 3-й волны. В этих регионах сохранились и впервые возникшие атипичные штаммы. Такая ситуация указывает на возможность заноса на территорию России различных геновариантов возбудителя с разным составом измененных генов, определяющих патогенность.Выявление отличий в структуре генов патогенности, пандемичности, персистенции и лекарственной устойчивости между выявленными штаммами. При анализе геномов трех исследуемых изолятов было установлено, что клинический токсигенный штамм V. cholerae M3208 имел полный набор мобильных элементов с генами патогенности, эпидемичности и лекарственной устойчивости, локализованных на первой хромосоме: профаг CTXφ, острова патогенности VPI-1 и VPI-2, острова пандемичности VSP-I и VSP-II, ICE SXT (рис. 2, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_01_039_add.zip). При этом профаг CTXφ и остров патогенности VPI-1 содержали аллели ключевых генов патогенности ctxB (375 пн) и tcpA (597 пн), а именно ctxB7 и tcpACIRS101соответственно. Измененным оказался и остров пандемичности VSP-II, лишенный 21 гена из 30 известных (VSP-IIΔ). Одной из важной особенностью этого штамма стало присутствие в геноме делетированного ICEVchInd5Δ, сохранившего лишь один ген dfrA1, кодирующий резистентность к триметоприму, но утративший гены устойчивости к хлорамфениколу (floR), стрептомицину (strAB) и сульфаниламиду (sul2), входящих в состав вариабельной области III (VARIII) этого мобильного элемента [19, 20]. Более того, в коровых генах rtxA1 из кластера генов, кодирующих цитотоксин MARTX, gyrA и parC, кодирующих топоизомеразы, а также в регуляторном гене carR были выявлены точечные мутации. Точечная мутация в rtxA1 привела к образованию стоп-кодона в этом гене и утрате биосинтеза цитотоксина, а также к делеции 60 нуклеотидов. Измененный ген получил обозначение rtxA4a [3]. Две точечные мутации в генах gyrA(G248T) и parC(C254T) обусловили формирование у патогена резистентности к налидиксовой кислоте. Кроме того, мутация в регуляторном гене carR(G265A) стала причиной утраты этим штаммом устойчивости к полимиксину B — одного из фенотипических маркеров вибрионов биовара Эль Тор. (см. рис. 2, см .https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_01_039_add.zip ). Таким образом, из анализа представленных данных следует, что клинический штамм M3208 по спектру выявленных мутаций в генах патогенности, эпидемичности и лекарственной устойчивости относится к геновариантам, возникшим в последние два десятилетия (3-я волна пандемии) и широко распространенным в эндемичных по холере регионах [15, 19].
При сравнении нуклеотидной последовательности другого токсигенного штамма M3210 с таковой референсного штамма N16961 в его геноме был также выявлен полный набор мобильных элементов с основными генами, обеспечивающими его патогенный (CTXφ, VPI-1, VPI-2) и эпидемический (VSP-I, VSP-II) потенциал, а также устойчивость к антибиотикам (ICE STX). Однако, в отличие от токсигенного изолята M3208, этот штамм содержал две копии профага CTXφ, расположенные в тандемном порядке на второй хромосоме (см. рис. 2, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_01_039_add.zip).
Второе значимое отличие от штамма M3208 — присутствие в опероне ctxAB, кодирующем CT, иного аллельного варианта гена ctxB — ctxB1, свойственного геновариантам из 2-й волны пандемии (1990—2002 гг.). Более того, и другие мобильные элементы (VPI-1, VPI-2, VSP-I, VSP-II), а также изученные коровые гены (rtxA1, gyrA и parC, carR) по структуре не отличались от таковых первых геновариантов, возникших в 90-е годы прошлого столетия. Вместе с тем, в ICEVchBan9 была обнаружена делеция генов floR, tetAR, strAB и sul2 при сохранении лишь гена dfrA1 из VRIII этого мобильного элемента. Представленные сведения позволяют говорить о том, что выделенный из водной среды в 2023 г. токсигенный штамм M3210, в отличие от клинического изолята M3208, относится к впервые возникшим атипичным штаммам, которые сохранились лишь на отдельных территориях в эндемичных по регионах [21].
Исследование генома нетоксигенного штамма M3209, изолированного от человека, показало отсутствие в его геноме мобильных элементов с ключевыми генами патогенности (CTXφ, VPI-1), пандемичности (VSP-I, VSP-II) и лекарственной устойчивости (ICE STX). Вместе с тем был обнаружен остров патогенности VPI-2Δ, лишенный протяженного участка ДНК размером 41 тпн. Интактный VPI-2 токсигенных штаммов содержал три основных генных блока, включая гены рестрикции — модификации (vc1788-vc1771), кластер генов nan-nag (vc1773-vc1783), кодирующий белки, участвующие в утилизации N-ацетилглюкозоамина и сиаловой кислоты, и ген nanH (vc1784), кодирующий нейраминидазу, усиливающую действие CT, а также гены, подобные фагу Mu (vc1793-vc1803) [22]. В то же время VPI-2 штамма M3209 утратил все гены рестрикции-модификации и Mu-подобные гены, сохранив лишь кластер генов в области nan-nag вместе с краевыми генами (см. рис. 2, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_01_039_add.zip).
Тем не менее в сохранившемся гене nanH было обнаружено 63 нуклеотидных замен (23 несинонимичных и 41 синонимичная). Нуклеотидная последовательность генов коровой части хромосомы rtxA1, gyrA, parC и carR также отличалась от таковой референсного штамма многочисленными синонимичными и несинонимичным заменами. Наиболее высокий уровень замен был выявлен у гена rtxA1: 39 несинонимичных и 91 синонимичных (см. рис. 2, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_01_039_add.zip)). Эти данные полностью совпадают с полученными результатами анализа нуклеотидных последовательностей VPI-2 и различных коровых генов других нетоксигенных штаммов с генотипом ctxA-tcpA-, изолированных ранее в различных регионах России [16]. Таким образом, представленные данные свидетельствуют о значительных отличиях генома нетоксигенного штамма от токсигенных, что подтверждает его эпидемическую безопасность. Высокий уровень вариабельности генома нетоксигенного штамма может быть следствием воздействия различных стрессовых факторов в период его длительного пребывания в водной среде перед попаданием в организм человека.
Определение устойчивости к антибиотикам и продукции дополнительных факторов патогенности. Для подтверждения изменения лекарственной устойчивости выделенных штаммов, связанной с различными мутациями, на первом этапе оценили их резистентность к пяти антибиотикам (хлорамфениколу, тетрациклину, стрептомицину, сульфаметоксазолу и триметоприму), кодируемую генами, локализованными в участке VRIII двух типов мобильного элемента ICE SXT — ICEVchInd5 и ICEVchBan9. В результате оказалось, что токсигенные штаммы M3208 и M3210 были резистентными к триметоприму вследствие сохранения в ICEVchInd5Δ и ICEVchBan9Δ только гена dfrA1 (см. рис. 2, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_01_040_add.zip)). Вместе с тем у штамма M3210, несмотря на утрату генов floR, tetAR, strAB и sul2 из ICEVchBan9Δ, была выявлена устойчивость к стрептомицину и сульфаметоксазолу, которая была обусловлена другими генами, присутствующими в его хромосоме — aad1 и sul1 соответственно. Нетоксигенный штамм M3209, не имеющий ICE SXT, как и ожидалось, был чувствительным к взятым антибиотикам. Далее была определена резистентность штаммов к налидиксовой кислоте и полимиксину B, связанная со коровыми генами gyrA, parC и carR. Указанные выше мутации в этих генах у токсигенного штамма M3208 действительно обусловили его резистентность к налидиксовой кислоте и чувствительность к полимиксину, тогда как второй токсигенный штамм M3210 оказался NalS и PolR, не отличаясь по этим свойствам от типичных и генетически измененных штаммов из 2-й волны пандемии. Нетоксигенный штамм M3209, несмотря на другие нуклеотидные замены в этих генах, был также NalS и PolR (рис. 3, a, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_01_040_add.zip).
Таким образом, изученные штаммы холерного вибриона имели разный профиль резистентности к антибиотикам. Особый интерес представляло обнаружение токсигенного штамма PolS с измененным диагностически значимым свойством, что может указывать на возможность дальнейшего появления таких штаммов в России, впервые занесенных на территорию нашей страны в 2012 и 2014 г. [15].
Самостоятельный интерес представлял вопрос об экспрессии ряда генов коровой части хромосомы hlyA, hapA и flaA у нетоксигенного штамма, изолированного от больного ОКЗ, для выяснения причин развития этой инфекции. Выбор указанных генов был обусловлен тем, что их продукты относятся к дополнительным факторам патогенности, которые могут вызывать энтеропатогенную реакцию у человека. Ген hlyA кодирует гемолизин/цитотоксин, hapA определяет биосинтез гемагглютинин/протеазы, flaA отвечает за подвижность вибрионов [23—25]. При проверке оказалось, что нетоксигенный штамм M3209, как и токсигенные, взятые для сравнения, продуцировал гемолизин, гемагглютинин/протеазу и был подвижен, несмотря на многочисленные однонуклеотидные замены в этих генах (см. рис. 3, б, в, г, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_01_040_add.zip).). Следовательно, эти второстепенные факторы патогенности действительно могли стать причиной развития у человека инфекционного процесса (ОКИ), отличающегося от холеры.
Заключение
Впервые проведенный сравнительный анализ секвенированных нами полных геномов штаммов V. cholerae Эль Тор, изолированных от больных и из водной среды в 2023 г. на территории России, показал их генетическое разнообразие. Установлено, что токсигенные штаммы относились к различным типам геновариантов возбудителя, возникших на разных этапах его эволюции и имеющих различный набор мутаций в геноме ряда мобильных элементов, а также в коровых генах, связанных с патогенностью, способностью к эпидемическому распространению и лекарственной устойчивостью. Клинический штамм M3208, изолированный от больного холерой, имел полный набор измененных генов патогенности (ctxB7, tcpACIRS101, rtxA4), эпидемичности (VSP-IIΔ) и резистентности к антибиотикам [gyrA(G248T)parC(C254T)carR(G265A)ICEVchInd5Δ], характерных для штаммов из позднего периода 3-й волны пандемии, которые в настоящее время широко распространены в эндемичных регионах Азии и Африки [20, 26]. Последовательное накопление мутаций различного типа (однонуклеотидные замены и делеции) в геноме таких штаммов привело не только к повышению патогенного и эпидемического потенциала возбудителя, но и утрате в ряде случаев одного из диагностически значимых свойств вибрионов Эль Тор — устойчивости к полимиксину. Вместе с тем, второй токсигенный штамм M3210, изолированный из речной воды, по составу мутантных генов патогенности, эпидемичности и резистентности к антибиотикам существенно отличался от штамма M3208, имея лишь один измененный ген — ctxB (аллель ctxB1). Генотип этого штамма (ctxB1tcpAEltorrtxA1VSP-IIgyrAparCcarR) полностью соответствовал таковому ранее сформированных геновариантов из 2-й волны пандемии с более низким уровнем вирулентности, которые сохранились лишь в ряде эндемичных регионов.
У нетоксигенного штамма M3109, выделенного от больного с ОКИ, были выявлены выраженные различия в структуре генома. Установлено, что этот штамм был лишен не только профага CTXφ с генами CT, но всех мобильных элементов с другими ключевыми генами патогенности и эпидемичности. Было установлено присутствие в его геноме лишь делетированного VPI-2, что характерно и для многих других нетоксигенных штаммов из России. Выявленная продукция клетками этого штамма дополнительных факторов патогенности (гемолизина, растворимой гемагглютинин/протеазы, а также подвижность) может действительно обусловить у зараженных развитие острой кишечной инфекции, характерной для эпидемически безопасных штаммов.
Установленное геномное разнообразие эпидемически опасных штаммов возбудителя холеры, занесенных в Россию, указывает на необходимость постоянного молекулярно-генетического мониторинга возбудителя для выявления измененных генов патогенности и лекарственной устойчивости с целью своевременной разработки адекватных средств диагностики и профилактики.
Благодарности. Авторы выражают благодарность сотрудникам лаборатории геномного и протеомного анализа РосНИПЧИ «Микроб» м.н.с. Катышеву Семену Дмитриевичу и м.н.с. Федорову Андрею Витальевичу за помощь в проведении полногеномного секвенирования исследуемых штаммов.
Финансирование. Работа не имела спонсорской поддержки.
Соблюдение этических стандартов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием животных или людей в качестве объектов исследований.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.