Введение

Инвазивный листериоз (ИЛ) — заболевание, вызываемое Listeria monocytogenes, вследствие употребления контаминированных продуктов питания. Наиболее восприимчивыми к инфекции являются следующие категории населения: иммунокомпрометированные, в том числе пожилые, а также беременные и новорожденные. Они формируют 2 когорты: менингит-септицемия (МС) и перинатальный листериоз. Остановимся на более многочисленной когорте МС. В этой когорте основными проявлениями ИЛ являются нейролистериоз (менингит, менингоэнцефалит) и бактериемия (септицемия). Ведущей причиной роста восприимчивости к инфекции предполагается иммуносупрессия. Иммуносупрессия может быть следствием операции по трансплантации, лечения онкозаболевания, возрастных изменений [1], а также перенесенной вирусной инфекции [2, 3]. Термин «иммунная амнезия», введенный в 2012 г. для объяснения последствий коревой инфекции, может быть применен и в отношении вирусов гриппа [2], и SARS-CoV-2 [4]. Следствием такого состояния иммунной системы является сопутствующая бактериальная инфекция. Кишечной бактериальной инфекции способствуют также последствия воздействия вирусов на микробиоту кишечника. Например, COVID-19 приводил к снижению в микробиоме кишечника доли комменсалов-иммуномодуляторов Faecalibacterium prausnitzii, Eubacterium rectale, Bifidobacterium, что коррелировало с увеличением концентрации провоспалительных цитокинов [5]. В воспаленном кишечнике возрастает доступность эпителиоцитов для инвазии бактерий. Видимо, поэтому в период пандемии COVID-19 сформировалась дополнительная группа людей, восприимчивых к листериозу, а именно перенесших COVID-19 [6].

По данным многоцентрового мониторинга, проводимого в Московском регионе с 2018 г., пополнение когорты МС пациентами, перенесшими COVID-19, привело в 2020—2021 гг. к снижению минимального возраста госпитализированных больных ИЛ по сравнению с пациентами 2018—2019 гг., формированию группы пациентов младше 59 лет, составившей 41% выборки, и росту летальности с 43,8 до 81,2% [7]. В период пандемии во время эпидемических волн, вызванных SARS-CoV-2 дикого типа и последующими вариантами, вызывающими опасения (variants of concern, VOC): Alpha — Delta, менялся спектр генотипов клинических изолятов L. monocytogenes. Появились изоляты генотипов, ранее не встречавшихся на территории РФ, расширился перечень генотипов менее вирулентной филогенетической линии II (phylogenetic lineage, PL). Впервые были отмечены клинические изоляты, содержащие в составе генома плазмиды, несущие детерминанты резистентности к дезинфектантам. Для изолятов генотипов ST4, ST21, ST425 была доказана эпидемическая связь между изолятами одного генотипа, выделенными от разных пациентов [6]. Мы продолжили мониторинг ИЛ в период циркуляции VOC Omicron и его субвариантов, а также после завершения пандемии COVID-19.

Целью исследования было сравнение выборок пациентов с ИЛ и клинических изолятов L. monocytogenes, выделенных в 2022 г. при высоком уровне заболеваемости COVID-19 и в 2023 г. — начале 2024 г. при снижении заболеваемости этой инфекцией.

Материал и методы

Материал. Изоляты L. monocytogenes выделены от госпитализированных пациентов с ИЛ в микробиологических лабораториях 13 клиник г. Москвы, и один изолят выделен при листериозном гастроэнтерите в лаборатории инфекционной клиники СамГМУ. Исследование проводили при добровольном информированном согласии пациентов. Протоколы исследования одобрены Комитетом по биомедицинской этике НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (протоколы № 14 от 04.07.2018 и № 52 от 03.07.2023). В период с 2022 до начала 2024 г. на молекулярно-генетический анализ поступило 36 изолятов. Для сравнительных исследований мы привлекали данные клинических изолятов, полученные ранее в ходе мониторинга, проводимого с ноября 2018 г.

Методы. Для культивирования листерий, молекулярно-генетического анализа ДНК с помощью MLST (MultiLocus Sequence Typing), MvLST (Multivirulent-locus sequence typing) и полногеномного секвенирования с последующей сборкой и аннотацией геномов использовали ранее описанные методики [8]. Ресурсы Bacterial Isolate Genome Sequence Database for L. monocytogenes (BIGSdb-Lm, URL: https://bigsdb.pasteur.fr/listeria/) применяли для определения аллелей и аллельных профилей MLST. Проанализированные изоляты депонировали в базе данных сайта, ID: 98281, 98282, 98284, 98285, 98288, 98290, 98292 — 98295, 100872 — 100874, 102088 — 102092, 104102, 104109, 109007 — 109014, 109017 — 109020, 110382, 110383, 110386, 110387. Секвенированные геномы депонировали в GenBank в биопроект PRJNA605697. Анализ корового генома проводили согласно схеме MLST для 1748 локусов (cgMLST) [9] с помощью ресурсов BIGSdb-Lm. Факторы вирулентности определяли, используя Virulence Factors Database (URL: https://www.mgc.ac.cn/VFs/) и VF analyzer (URL: https://www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/v5/main.cgi?func=VFanalyzer/) [10], а также BIGSdb-Lm database. Для анализа резистома использовали схему «Antibiotic Resistance» BIGSdb-Lm database, а также данные Comprehensive Antibiotic Resistance Database (URL: https://card.mcmaster.ca/) [11]. Поиск мобильных элементов осуществляли с помощью программы MobileElementFinder (URL: https://cge.food.dtu.dk/services/).

Для анализа эпидемической ситуации по гриппу и SARS-CoV-2 использовали данные сайтов Роспотребнадзора (https://www.rospotrebnadzor.ru/region/korono_virus/epid.php; https://rospotrebnadzor.ru/upload/iblock/b50/t4kqksh4b12a2iwjnha29922vu7naki5/GD-SEB.pdf) и ВОЗ (https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports), источниками информации о циркулировавших генотипах вирусов служили Еженедельный национальный бюллетень по гриппу и ОРВИ НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева (https://www.influenza.spb.ru/system/epidemic_situation/laboratory_diagnostics/) и сайты Pango Nomenclature (https://cov-lineages.org/lineage_list.html) [12], Outbreak.info (https://outbreak.info/location-reports?loc=RUS), Statista (https://www.statista.com/statistics/1244716/covid-19-variants-russia/).

В сравнительном анализе подгрупп выборки изолятов L. monocytogenes использовали статистические функции MS Excel. Индекс разнообразия Шеннона (H) рассчитывали по формуле

H=–Σp_i·log₂p_i,

где p_i=n_i/N, n_i — численность изолятов данного генотипа; N — численность всех изолятов выборки

Результаты и обсуждение

Эпидемическая ситуация по вирусам, вызвавшим наибольшее количество случаев заболевания. В период наблюдения с 2022 по апрель 2024 г. таких вирусов было 2: SARS-CoV-2 и Influenza. В январе 2022 г. заболеваемость COVID-19 достигла пика на 6-й неделе и составила 1323391 чел./неделя (рис. 1, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_03_032_add.zip).

Основным циркулировавшим вариантом с частотой встречаемости 90,1% (https://www.youtube.com/watch?v=u-_NDK4DCLU/) уже 14.01.2022 г. стал Omicron (B.1.1.529), появившийся в Москве 03.12.2021 г. [13]. Для волны Omicron были характерны высокий индекс репродукции вируса и быстрая эволюция с появлением разнообразных субвариантов и их рекомбинантов [14]. Осенний пик заболеваемости пришелся на 37-ю неделю и был ниже зимнего в 3,6 раза, следующий подъем с пиком на 50-й неделе уже в 25 раз уступал по интенсивности. Пики заболеваемости в 2023—2024 гг. пришлись на характерное для ОРВИ зимне-весеннее время и по интенсивности уступали в 12—14 раз основному пику волны Omicron. Максимум на 49-й неделе 2023 г. составил 107 174 заболевших в неделю.

Вирус гриппа вернулся в конце 2022 г. и в пике, пришедшемся на 52-ю неделю (2537 заболевших), был представлен A(H1N1)pdm09, к которому в следующем подъеме с пиком на 7-й неделе 2023 г. присоединился вирус гриппа B (см. рис. 1). В подъем заболеваемости зимы 2023—2024 гг. уже циркулировал вирус гриппа A(H3N2). Таким образом, 2022 г. отличался существенно более высоким уровнем заболеваемости COVID-19 по сравнению с 2023—2024 гг. В то же время зимы 2022/2023 и 2023/2024 гг. характеризовались социркуляцией SARS-CoV-2 и Influenza. Учитывая особенности эпидемической ситуации по вирусам, вызвавшим наибольшее количество случаев заболевания, выявленных пациентов с ИЛ разделили на подгруппы: 1) госпитализированные в 2022 г. и 2) в 2023—04.2024 гг.

Характеристика выборки пациентов с инвазивным листериозом. Подгруппы пациентов с ИЛ сравнивали по параметрам, представленным в табл. 1. Подгруппу «2022» отличала более высокая доля пациентов-мужчин, пациентов, имеющих в анамнезе COVID-19, пневмонию/фиброз легких, а также более высокая частота смертельных исходов.

Таблица 1. Сравнение подгрупп пациентов с инвазивным листериозом

В подгруппе «2023—04.2024» была выше доля пациентов с онкозаболеваниями. Возрастные характеристики подгрупп схожи, в том числе и по показателю минимального возраста. Однако если в подгруппе «2022» ИЛ у пациента в возрасте 31 год протекал одновременно с COVID-19 и геморрагической лихорадкой с почечным синдромом (ГЛПС), то у пациента в возрасте 30 лет в подгруппе «2023—04.2024» фоновым диагнозом был лейкоз. Иммуносупрессия у остальных пациентов младше 59 лет в подгруппе «2022» была связана с COVID-19, а в подгруппе «2023—04.2024» — с терапией при гранулематозе с полиангиитом, хроническом гломерулонефрите, а также с Х-связанным моэзинассоциированным иммунодефицитом. Таким образом, в 2023—2024 гг. снизилось влияние COVID-19 на заболеваемость ИЛ, выросло разнообразие перенесенных или сопутствующих вирусных инфекций у пациентов с ИЛ. Из респираторных инфекций следует отметить грипп А и риновирус.

Сравнение характеристик изолятов L. monocytogenes между подгруппами. В период наблюдения в выборке поступивших клинических изолятов идентифицировали L. monocytogenes 19 различных генотипов, из которых 5 относились к более вирулентной PLI (рис. 2, а, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_03_032_add.zip). Сравнение спектров генотипов L. monocytogenes двух временных периодов показало, что совпадающими были 5 ST: ST4 (PLI), ST7, ST8, ST37, ST451 (PLII). Индексы разнообразия в подгруппах «2022» и «2023—04.2024» были практически одинаковыми (см. рис. 2, б, в), однако сопоставление разнообразия генотипов PLII показало, что в подгруппе «2023—04.2024» оно было выше в 1,4 раза (H=2,9 против H=2,1).

Новыми в подгруппе изолятов «2023—04.2024» были L. monocytogenes ST504, ST111, ST378, (PLII) и ST87 (PLI). Листерия ST504 распространена на территории Европы, изоляты от диких животных во Франции датируют 1967 г. L. monocytogenes ST504 выделяют из продуктов питания и на пищевых производствах, но гораздо реже, чем листерии ST9 или ST121 [15—17]. Клинические изоляты ST504 зарегистрированы только в двух случаях в Польше и в одном в Чехии (табл. 2). L. monocytogenes ST504, являясь вариантом ST121 по двум локусам аллельного профиля (DLV), в выборке российских изолятов отличалась следующими особенностями. Пищевой изолят 2018 г. имел новый профиль интерналинов (IP: inlA, inlB, inlC, inlE). IP47: 9, 17, 7, 12 — отличался локусом inlE от IP48: 9, 17, 7, 2 — изолятов ST121. Клинические изоляты L. monocytogenes ST504, выделенные в 2023—2024, как при перинатальном листериозе (ПЛ), так и от пациентов когорты МС, имели IP48, идентичный изолятам ST121.

Таблица 2. Представленность L. monocytogenes ST87, ST111, ST378 и ST504 среди клинических изолятов

L. monocytogenes ST111, генотипа, являющегося SLV аутохтонного ST7, выделили при тяжелом гастроэнтерите, но взяли в анализ, поскольку ранее листерии этого генотипа не вызывали заболевание человека в России, однако были выявлены в природном парке в зоне кормления животных [18]. В базе данных BIGSdb-Lm немногочисленные изоляты этого генотипа из других стран датированы 1953—1958 гг., только один из них клинический (см. табл. 2).

L. monocytogenes ST378 впервые выявлена в РФ, редко регистрируется в мире среди клинических, пищевых изолятов и в окружающей среде, за исключением стран Азии. Так, в Тайване в выборке клинических изолятов 2014—2019 гг. L. monocytogenes ST378 составила 14% [19]. Еще выше представленность в Тайване L. monocytogenes ST87 — 36% [19]. Клинические изоляты этого генотипа зарегистрированы в Японии и Австралии (см. табл. 2). В Европе L. monocytogenes ST87 вызвала заболевание исключительно в Испании: 2 эпидемические вспышки (2010—2012; 2012—2014 гг. с разными источниками заражения) [20] и спорадический случай 2016 г. В РФ L. monocytogenes ST87 изолировали однократно от носителя в Дальневосточном ФО (см. табл. 2). Отметим, что для ДФО характерен эндемичный спектр изолятов с высокой долей L. monocytogenes PLI по сравнению с изолятами, выделенными в европейской части страны [21]. Однако все клинические и пищевые изоляты PLI ДФО относятся к серотипу 4b, и только упомянутый изолят от носителя и выделенный в 1948 г. изолят из клеща (ST287, CC3) принадлежат серотипу 1/2b. Остальные изоляты серотипа 1/2b, зарегистрированные в РФ, были выделены в европейской части страны: 4 клинических (id42973, 45730, 109009, 110385), 8 пищевых (id76385, 76386, 37689, 78790, 78791, 78809, 37679, 42995) и 1 из окружающей среды (id5816).

Сравнение коровых геномов изолятов одного генотипа. Локусы cgMLST сравнивали в группах секвенированных геномов L. monocytogenes ST6, ST7, ST8, ST378, ST504. Минимальными (9 локусов) были отличия между геномами изолятов ST378, выделенных от пациентов разных клиник в августе 2023 г. Тем не менее, они превышали порог отнесения к одной эпидемической вспышке, составляющий 7 локусов [9]. В группах геномов ST504 и ST8 отличия составили 30—43 и 18—33 локусов соответственно. Особый интерес представляли изоляты ST6. Геномы этого генотипа отличались всего двумя локусами у изолятов от пациентов когорты ПЛ в начале 2022 г. (GIMC2111:LmcEH-5, GIMC2114:LmcUH31). Изолят пациента когорты МС (GIMC2121:LmcH51—2) во втором полугодии 2022 г. имел 36—37 отличий в cgMLST от пары изолятов ПЛ.

Внимание к изолятам ST7 связано с тем, что листерии этого аутохтонного генотипа преобладали в выборке клинических изолятов до пандемии COVID-19 [18]. Выделенные в 2019 г. клинические изоляты ST7 отличались от наиболее близкого пищевого изолята 23 локусами cgMLST, но имели общую с ним аллель локуса lmo2171 (MFS транспортера) с делецией 3 триплетов [22]. Такую же аллель lmo2171 (243) мы обнаружили у изолята от июня 2020 г., геном которого отличался 18 локусами от изолятов 2019 г. Следующий изолят ST7 выделили при ИЛ через 2 года, в августе 2022 г. Геном этого изолята отличался уже 66 локусами, а аллель lmo2171 (6) соответствовала аллели генома клинического изолята 1971 г. (GenBank Accession Number CP060429). В геноме изолята 2024 г. количество отличий cgMLST выросло до 88, но lmo2171 был представлен аллелью 6. Таким образом, возвращение L. monocytogenes аутохтонного генотипа привело к появлению геномных вариантов, отличных от циркулировавших ранее.

Факторы вирулентности и резистом выборки изолятов. Рассмотрим особенности изолятов новых для клинической выборки генотипов. В группе изолятов PLII у представителей ST111 и ST378 отсутствовал фактор инвазии vip, что ранее отмечали в геномах изолятов ST7, ST8, ST21, ST29, ST37, ST204, ST1365 [6,8]. В геномах листерий ST504 ген vip есть, как и у изолятов ST121. Остальные факторы вирулентности были типичными для изолятов PLII.

Листерия нового в выборке генотипа PLI — ST87, относящегося к серотипу 1/2b, отличалась перечнем факторов вирулентности от других листерий генотипов PLI (ST1, ST4, ST6, ST194), которые принадлежат серотипу 4b. В геноме изолята ST87 присутствовали гены, характерные для О-антиген специфичных кластеров геномов листерий серотипа 1/2: aut (lmo1076), tagB (lmo1088) в кластере 1 (1093974 — 1125507 bp в референсном геноме L. monocytogenes str. 4b F2365, Accession Number NC_002973) и ami (lmo2558) в кластере 2 (2579404 — 2591258 bp), а также отсутствовали гены gltA (LMOf2365_2740) и gltB (LMOf2365_2741) еще в одном О-антиген специфичном участке генома (2786167 — 2792348 bp), что соответствует геномным характеристикам серотипа 1/2, описанным в работе den Bakker и соавт. [23]. В то же время в геноме изолята ST87 присутствовали ген aut_IVb (LMOF2365_RS00075) и остров патогенности LIPI-4 (система транспорта сахаров, PTS), характерные для геномов L. monocytogenes PLI. Таким образом, факторы вирулентности L. monocytogenes ST87 являются гибридными между факторами PLI и PLII.

При оценке резистома изолятов учитывали детерминанты плазмид и хромосомы. Плазмиды содержали только 2 изолята 2022 г.: GIMC2109:LmcH67_11 (ST121, мар. 2022; Accession Number OP752359) и GIMC2128:LmcEH-6 (ST8, окт. 2022; OP921773). Эти изоляты имели дополнительную устойчивость к дезинфектантам и стрессу. Устойчивость, детерминированная генами хромосомы, была одинакова у всех изолятов: fosX (lmo1702), lin (lmo0919), mprF (lmo1695), norB (lmo2818) и parC (lmo1287 с заменами в позициях 83 и 87) обеспечивали устойчивость к фосфомицину, линкозамиду, катионным пептидам и хинолонам, как и у ранее проанализированных изолятов [6].

Заключение

Снижение заболеваемости COVID-19, переход к сезонной социркуляции SARS-CoV-2 с вернувшимся вирусом гриппа сказались на значениях параметров выборки пациентов с ИЛ. Вернулись к доковидному уровню доля пациентов-мужчин, нозологии основного заболевания пациентов с ИЛ, спектр вирусных инфекций, предварявших и сопутствующих ИЛ. Однако минимальный возраст пациентов, подверженных ИЛ с проявлениями МС, снизившийся в период пандемии до 30 лет, остался прежним, и доля пациентов младше 59 лет составила около 30% в каждой временной группе, что косвенно свидетельствует о последствиях перенесенного COVID-19 и возможном инфицировании новыми вариантами SARS-CoV-2 с легким и недокументированным течением болезни.

В период 2023—04.2024 гг. продолжали меняться генетические характеристики возбудителя ИЛ в Московском регионе. Выросло разнообразие изолятов PLII, снизилась доля PLI изолятов, которые, как и до пандемии, представлены L. monocytogenes двух серогрупп: 4b и 1/2b, однако перечень генотипов PLI стал теперь иным. До пандемии серогруппу 1/2b представляли листерии ST5 (CC5) и ST241 (CC59), а в период с 2023 по апрель 2024 г. выявлены изоляты ST87 (СС87) в когорте МС и ST59 (CC59) в когорте перинатального листериоза. Отмеченные изменения в спектре генотипов возбудителя ИЛ являются не только следствием влияния пандемии COVID-19 на состояние здоровья населения, но и тенденций в пищевой индустрии, связанных с развитием технологий полуфабрикатов, в том числе замороженных, системы предприятий фастфуда, службы доставки готовых блюд. Изменения в спектре генотипов листерий, вызывавших эпидемические вспышки, зарегистрированные CDC и ECDC, отмечали с 2000-х. Если вспышки листериоза в 1980—2000 гг. связаны с листериями серотипа 4b (PLI), то в XXI веке эпидемические вспышки чаще были вызваны L. monocytogenes серотипа 1/2а (PLII) как в Европе, так и в Северной Америке [24]. Об этой тенденции свидетельствует и нумерация зарегистрированных эпидемических клонов (EC), которые определяют как группу генетически родственных изолятов, вызвавших эпидемические вспышки в разных географических зонах в разные периоды времени [24]. Каждый EC связан с изолятами одного генотипа или СС. Первые три EC (EC1, EC1a (позже переименованный в ECIV), ECII) связаны с листериями CC1, CC2, CC6, соответственно, относящимися к PLI (4b), следующие 2 — ECIII и ECV — с листериями CC11 (ST451) и CC8, принадлежащими PLII (1/2a) [25]. Три позже зарегистрированных EC также связаны с листериями серотипа 1/2: ECVI — CC5 (1/2b), ECVII — CC7 (1/2a), ECVIII — CC3 (1/2b) [26,27]. Представители ECI-ECIII, ECV-ECVII, ECX (CC4) [28] вызвали ИЛ в период наблюдения. Преобладающими среди клинических изолятов были, однако, гиповирулентные представители PLII. Именно в этой группе изолятов выявили плазмиды, обеспечивающие устойчивость к дезинфектантам и стрессу. Пять изолятов с плазмидами изолировали в 2021 г. и 2 изолята — в 2022 г. Таким образом, частота встречаемости плазмид в 66 секвенированных клинических изолятах составила 10,6%. Приобретенные детерминанты резистентности в этой выборке отсутствовали. Такие данные согласуются с результатами исследования 2908 клинических изолятов из коллекции Французского национального референсного центра листерий, собранных в 2012—2019 гг. Устойчивость к дезинфектантам A. Moura и соавт. выявили у 7,20%, а приобретенную резистентность — у 0,98% клинических изолятов [29].

Следует отметить, что группа риска по ИЛ с проявлениями МС достаточно велика в РФ. Так, доля людей старше 64 лет составила 13% населения РФ (18 980 000 чел.) на начало 2024 г. (https://countrymeters.info/ru/Russian_Federation). По данным Росстата, в 2022 г. только впервые выявленных случаев заболеваний злокачественными новообразованиями было 624 000, и 539 600 случаев заболеваний болезнями крови, кроветворных органов и отдельных нарушений, вовлекающих иммунный механизм [30]. Статистические данные, собираемые ФНЦТИО им. академика В.И. Шумакова, свидетельствуют о 3002 трансплантациях органов в 2023 г. и 1307 в первые 5 месяцев 2024 г., проведенных в РФ (https://www.transpl.ru/about/statistics/). Сезонные респираторные вирусные инфекции, а также корь, краснуха, гепатиты, ВИЧ расширяют группу риска по ИЛ. Таким образом, продолжение мониторинга возбудителя листериоза остается актуальным.

Благодарности. Авторы выражают благодарность врачам бактериологам: Алехиной В.М., Бурмистровой Е.Н., Демкину И.В., Дудниковой С.В., Звонаревой О.В., Качаловой Ж.В., Маммадовой А.М., Михалевской В.И., Овчинниковой З.А., Покидышевой А.Ю., Прониной Т.В., Штейнберг Л.А., предоставившим культуры для исследования.

Финансирование работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Государственного задания НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.