Рак шейки матки (РШМ) — одна из ведущих причин смертности среди женщин во всем мире, несмотря на высокую информативность скрининга предшествующих цервикальных интраэпителиальных изменений [1]. Его основным этиологическим фактором считают вирус папилломы человека (ВПЧ), около 30 генотипов которого определяют при злокачественном поражении цервикального эпителия [2], что позволило выделить их в группу высокого канцерогенного риска (ВПЧ ВКР). Длительная персистенция этих ДНК-вирусов может послужить причиной развития РШМ, который занимает в мире второе [3], а в России — третье место в структуре онкологической заболеваемости женского населения [4].

Согласно современной теории вирусного канцерогенеза его пусковым механизмом считают интеграцию ДНК ВПЧ в ДНК клетки [5, 6], хотя выявление в ряде наблюдений цервикального рака [7, 8], в том числе в собственных исследованиях [9], вирусной ДНК в эписомной форме не исключает иного пути малигнизации эпителия с более сложным биомолекулярным механизмом [10, 11]. Данная модель вирусного канцерогенеза не объясняет и причин альтернативного развития интраэпителиальных изменений [12, 13], предшествующих формированию инвазивной опухоли. Не понятна и избирательность злокачественной трансформации небольшого пула клеток, окруженных неизмененным эпителием шейки матки, необходимым для жизненного цикла папилломавируса [14].

В процессе репродукции ВПЧ использует продукты генов инфицированной базальной и/или резервной клеток на протяжении всего цикла их развития. Это позволяет в S фазе одновременно с репликацией клеточной ДНК осуществить репликацию вирусной ДНК [15], в профазе начать процесс транскрипции генов капсидных белков [16], в метафазе передать эписомную вирусную ДНК дочерним клеткам [15].

Максимальную продукцию реплицированных копий ДНК ВПЧ определяет экспрессия вирусных белков Е6 и Е7 [15], воздействие которых на семейства клеточных белков р53 [17], pRb [10, 17, 18], р16 [19, 20] и р21 [21] исключает возможность остановки цикла клетки для репарации ее ДНК или запуска апоптоза при возникающих при репликации ДНК мутаций ее генов [22]. В М фазе клеточного цикла связь Е7 ВПЧ с ядерным белком митотического аппарата — nuclear mitotic apparatus protein (NuMA 1), нарушает механизм асимметричного митоза базальных клеток [23], необходимого для их последующей дифференцировки [24]. Кроме того, ассоциация этих белков вызывает отсоединение динеина от митотических шпинделей [25] и индуцирует дефекты в выравнивании хромосом в течение метафазы, дезорганизация которой при инактивации р53, pRb и разрушении сети NuMA1/динеин приводит к митотическим ошибкам [23].

Нарушения репликации ДНК папилломавируса могут привести к мутациям генов, которые влияют на экспрессию капсидных белков L1 и L2, регулирующих формирование и выход вирионов из клетки при завершении процесса клеточной дифференцировки [26], которую замедляют или приостанавливают мутации генов вирусных белков Е4 и Е5 [27, 28].

Целью настоящего исследования являлось изучение изменений ядерного митотического аппарата на разных стадиях ВПЧ-ассоциированной цервикальной неоплазии и определение возможности их использования в качестве критериев прогноза прогрессии эпителиальных изменений.

Проведен анализ результатов цитологического, иммуноцитохимического, гистологического, иммуногистохимического и молекулярно-генетического методов исследования биоптатов шейки матки у 264 женщин в возрасте от 22 до 74 лет, находившихся на лечении в Санкт-Петербургском городском клиническом онкологическом диспансере с января 2010 г. по декабрь 2011 г.

Цитологические препараты экто- и эндоцервикса готовили методом жидкостной цитологии и окрашивали по методу Папаниколау.

Для гистологического исследования материал электроэксцизии шейки матки фиксировали в 10% растворе формалина, обезвоживали в этиловом спирте восходящей концентрации, заливали в парафиновые блоки, с помощью микротома готовили срезы толщиной 5—6 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином.

В 29 случаях проводили иммуноцитохимическое, в 166 — иммуногистохимическое исследования с использованием системы детекции Ultra Vision LP Detection System HRP Polymer & Dab Plus Chromogen, «Thermo Scientific» (США) и моноклональных антител к Ki-67 (SP6, RM-9106-SO, 9106S 10038), к p53 (SP5, RM-9105-SO, 9105S 1005A), «Thermo Scientific» (США) и моноклональных антител к NuMA 1 (LS-B7380, 44529), «LifeSpan BioSciences Inc.» (США).

Полученные результаты оценивали в цитологических или гистологических препаратах полуколичественным способом среди всех парабазальных, атипичных или опухолевых клеток.

С помощью видеокамеры Progres C3 в режиме Measure × 100 измеряли периметр ядра (ПЯ) и цитоплазмы (ПЦ) всех клеток препарата, подсчитывали митотический индекс (МИ), количество клеток с разными фазами митоза и его патологическими изменениями.

Заключения результатов цитологических исследований формулировали в соответствии с классификацией «The Bethesda System for reporting cervical cytologic diagnoses» [29], гистологических исследований — в соответствии с последней редакцией гистологической классификации ВОЗ [3].

Во всех случаях выявление и генотипирование ДНК ВПЧ в соскобе цервикального канала проводили методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени на приборе Rotor Gene («Corbett Research», Австралия) с использованием комплектов реагентов ФГУН ЦНИИЭ в лаборатории молекулярной микробиологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера (Санкт-Петербург).

Достоверность различий полученных результатов оценивали на основании критерия Фишера.

В результате морфологического исследования у 86 женщин 32—50 лет верифицирована эктопия. У 37 пациенток 22—46 лет выявлена низкая степень интраэпителиального повреждения плоского эпителия — LSIL (слабая форма дисплазии), у 122 больных 22—64 лет — высокая степень интраэпителиального повреждения плоского эпителия — HSIL (34 случая умеренной, 62 — тяжелой формы дисплазии, 26 — Ca in situ). У 19 пациенток 27—74 лет диагностирован инвазивный плоскоклеточный РШМ (SCC).

ВПЧ генотип 16 обнаружен в 101 (38,3%) случае, его сочетания с папилломавирусами ВКР филогенетических групп (ФГГ) α9, α7, α6, α5 — в 82 (31,1%) случаях. Другие генотипы ВПЧ ВКР ФГГ α9 выявлены у 36 (13,6%), ФГГ α7 — у 24 (9,1%), сочетания ФГГ α9, α7, α6, α5 — у 21 (7,9%) женщины.

Независимо от изменения цервикального эпителия в клетках на всех стадиях митоза обнаружена экспрессия Ki-67 (рис. 1, а,).

Количество клеток в М фазе клеточного цикла возрастало при утяжелении поражения эпителия шейки матки, достигая максимальных значений при SCC (рис. 2). Свой вклад в рост показателей МИ при тяжелой дисплазии, интраэпителиальной и инвазивной формах рака вносили патологические митозы (см. рис. 2).

NuMA 1 при эктопии и слабой дисплазии выявлен во всех клетках с митозом. При прогрессировании ВПЧ-ассоциированного поражения эпителия шейки матки отметили уменьшение относительных показателей экспрессии этого ядерного белка в типично протекающих митозах, наблюдаемой при умеренной дисплазии в 36,4% из них, при тяжелой дисплазии — в 23,5%, при Ca in situ  — в 5,2% (см. рис. 1, б,), при SCC — в 3,6% соответственно (см. рис. 2).

Среди всех патологических изменений митоза при тяжелой дисплазии 91,4% при Ca in situ и 80,6% при SCC представлены колхициновыми к-митозами по типу слипания или рассеивания хромосом, характеризующими блокаду деления клетки в метафазе в результате грубого повреждения митотического аппарата при полном отсутствии формирования веретена. Кроме них в препаратах наблюдали изменения митоза по типу «полой метафазы» и многополюсного митоза, возникающие в результате неправильного формирования митотического аппарата, относительные показатели которых от общей численности патологических митозов при Ca in situ составили 7,6 и 1%, при SCC — 7,7 и 11,7% соответственно.

Независимо от тяжести поражения эпителия шейки матки экспрессия NuMA1 в клетках с патологическими митозами отсутствовала (см. рис. 1, в,).

Вышеперечисленные повреждения ядерного митотического аппарата затрудняли вступление в анафазу, вызывая «митотическую задержку», что подтверждено в наших исследованиях выявлением наибольшего количества клеток в метафазе (рис. 3).

Еще одним критерием нарушения функции ядерного митотического аппарата, по-видимому, могут служить наблюдаемые в препаратах дисплазии и рака двух- или более ядерные клетки. Первые из них считают продуктом нарушения цитотомии вследствие прерывания митоза в анафазе, вторые — исходом завершенного трехполюсного митоза и более [30].

При слабой дисплазии нарушения М фазы клеточного цикла не затрагивали механизма асимметричного митоза, способствующего дифференцировке клеток, подтверждением чего могут служить размер периметра цитоплазмы двух (220,4±2,1 μ) ядерных клеток и более (213,8±2,6 μ), не имевших статистически значимых различий (p<0,01) с соответствующим параметром одноядерных клеток поверхностного слоя (224,6±2,2 μ) плоского эпителия. Также в препаратах присутствовали многоядерные клетки, размер цитоплазмы которых (160,8±5,6 μ) сопоставим (p<0,01) с ПЦ одноядерных клеток промежуточного слоя (152,8±5,4 μ). В отличие от сохранения размера цитоплазмы ВПЧ-инфицированной клетки [31] размер периметра конгломерата из двух (30,2±2,1 μ) ядер и более (89,4±2,9 μ) в 1,2—3,5 раз превышал размер ПЯ одноядерных клеток поверхностного (24,9±2,3 μ) и промежуточного (52,1±3,1 μ) слоев (p<0,01), что, по-видимому, связано с избыточным накоплением в них вирусной ДНК.

При умеренной дисплазии размер ПЦ (50,2±4,3 μ) атипичных клеток, составивших 17,4% всех многоядерных клеток участка поражения эпителия, а при тяжелой дисплазии (58,5±3,5 μ) полностью его представляющих (см. рис. 2), был сопоставим (p<0,01) с соответствующим параметром метаплазированных резервных (47,5±3,2 μ) или парабазальных клеток (60,6±2,6 μ), что служило косвенным критерием нарушения дифференцировки атипичных клеток. Размер периметра конгломерата их ядер (46,1±1,4 μ) в 1,3 раза превышал ПЯ метаплазированных резервных (33,7±1,6 μ) или парабазальных (32,7±1,8 μ) клеток, что служило критерием наличия в них большого количества ДНК.

В препаратах интраэпителиального и инвазивного рака обнаружены два типа многоядерных опухолевых клеток. В первом случае размер периметра цитоплазмы при Ca in situ (50,4±4,3 μ) и SCC (51,4±4,2 μ), сопоставимый (p<0,01) с соответствующим параметром метаплазированных резервных клеток (47,4±5 μ), подтверждали нарушение процесса их дифференцировки. Размер П.Ц. второго типа опухолевых клеток при Ca in situ (139,6±5,1 μ) и SCC (141,1±4,4 μ), сходный с размером ПЦ промежуточных клеток (148,2±5,1 μ) паратуморальной зоны, служили косвенным свидетельством их «созревания», по-видимому, вследствие сохранения механизма асимметричного митоза. Размер периметра конгломератов ядер в первом случае (37,8±1,1 μ) в 1,1 раза превышал размер периметра ядер метаплазированных клеток (34,8±1 μ), во втором (ПЯ =56,5±2,1 μ) — в 1,3 раза размер ПЯ промежуточных клеток (41,8±2,3 μ) и свидетельствовал об увеличении в них количества ДНК.

Все вышеперечисленные изменения ядерного митотического аппарата протекали на фоне угнетения апоптоза, критерием чего служила экспрессия р53, выявленная в 1,5% клеток слабой, в 1% — умеренной, в 0,7% — тяжелой дисплазии, в 0,4% — Ca in situ и в 1% — SCC. Высокие показатели экспрессии р53 в инвазивном плоскоклеточном раке подтверждали результаты наших предыдущих исследований [32] и соответствовали наблюдениям других авторов [33].

Повреждение митотического аппарата на фоне угнетения апоптоза является одним из критериев цервикальной неоплазии, ассоциированной с ВПЧ высокого канцерогенного риска. При низкой степени интраэпителиального повреждения плоского эпителия изменения ядерного митотического аппарата не затрагивали механизма асимметричного митоза, вызывая нарушение цитотомии или многополюсность митоза. При высокой степени интраэпителиального повреждения плоского эпителия и плоскоклеточном раке нарушение асимметричного митоза дополнялось грубыми повреждениями митотического аппарата в виде патологических митозов, в первую очередь, к-митозов. Независимо от формы плоскоклеточного рака ряд опухолевых клеток сохранил способность к дифференцировке, что свидетельствовало о неполном угнетении в них механизма асимметричного митоза. Отрицательная реакция NuMA 1 в клетках с патологическими митозами и экспрессия этого белка менее чем в 1/3 клеток с типичными митозами могут служить критериями прогрессии цервикальной неоплазии.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.А.Е.

Сбор и обработка материала: В.А.Е.

Статистическая обработка: В.А.Е.

Написание текста: В.А.Е.

Редактирование: В.А.Е., В.С.Ч., А.С.Л.

Конфликт интересов отсутствует.