Материал и методы

Формирование выборки образцов РПЖ. Биоинформатический анализ для идентификации прогностических транскриптомных маркеров проводился в ЦКП «Геном» ИМБ РАН (http://www.eimb.ru/rus/ckp/ccu_genome_c.php) с использованием результатов высокопроизводительного секвенирования на платформе Illumina (прибор HiSeq 1500 System, США), депонированных в базу данных проекта «The Cancer Genome Atlas» (https://portal.gdc.cancer.gov). Общая выборка больных РПЖ в этом ресурсе составляет 500 человек. Из выборки удалены пациенты, не принадлежащие к европеоидной расе (в базе данных обозначены как «white»), и ее размер сократился до 330 человек. Затем была проведена фильтрация по распространенности опухолевого процесса, по наличию данных секвенирования мРНК в базе, а также по принадлежности к определенному молекулярному подтипу. В дальнейший анализ включены пациенты только с мрРПЖ. Для стратификации пациента в определенную группу по распространенности опухолевого процесса использовали патологическую классификацию (pTNM). Всем пациентам выполняли простатэктомию, которая в большинстве случаев сопровождалась расширенной тазовой лимфаденэктомией. В связи с невозможностью проведения корректной оценки категории N у больных, которым не производили лимфаденэктомию, они были исключены из последующего анализа. Использованы только результаты секвенирования транскриптома, полученные для тканей РПЖ из первичных опухолей от пациентов, не получавших неоадъювантную лекарственную терапию.

Были составлены группы больных мрРПЖ для сравнительного анализа на основании данных о прогнозе течения заболевания, а также о молекулярном подтипе. Прогноз течения заболевания разделили на условно благоприятный и неблагоприятный исходя из факта отсутствия или возникновения биохимического рецидива в течение всего срока наблюдения (не менее 3 лет). Группа пациентов с мрРПЖ без лимфогенной диссеминации (рT3a-bN0M0, рT4N0M0) составила 130 человек. Из них благоприятный прогноз имели 109 пациентов, а неблагоприятный — 21.

Для более детального анализа проведено последующее разделение выборок, согласно молекулярным подтипам образцов. Информация о принадлежности образца к определенному подтипу получена из его аннотации в базе данных консорциума TCGA. Только для молекулярного подтипа, характеризующегося образованием химерного транскрипта TMPRSS2-ERG в опухолевых клетках, выборка включала 51 пациента, что было достаточно для проведения сравнительного анализа и получения статистически достоверных результатов (благоприятный прогноз — 41 пациент, неблагоприятный — 10).

Методы биоинформатического и статистического анализа. Данные высокопроизводительного секвенирования транскриптома опухолей мрРПЖ из базы данных консорциума TCGA экспортировали в статистическую среду R (https://www.r-project.org/) в формате .txt. Эти файлы содержат информацию о ненормализованном количестве прочтений для каждого транскрипта. Для анализа дифференциальной экспрессии генов использовали программный пакет DESeq2 (Bioconductor, http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html) [17]. Статистически значимым считали изменение экспрессии генов в 2 раза и более, при значении уровня достоверности (р-значение с коррекцией средней доли ложных отклонений) менее 0,05. Величина дифференциальной экспрессии гена рассчитана как логарифм по основанию 2 от разности уровня экспрессии этого гена в группах неблагоприятного и благоприятного прогноза (в дальнейшем обозначается как logFC).

Проведен подробный анализ источников литературы, а также баз данных (в первую очередь Malacards, http://www.malacards.org/), включающих информацию о взаимосвязи нарушения экспрессии генов с заболеваниями, и составлен список потенциальных маркеров прогноза РПЖ. Таким образом, идентифицированные в процессе биоинформатического анализа потенциальные маркеры были сопоставлены со списком генов, для которых ранее научным сообществом указана вероятная ассоциация с прогнозом РПЖ. Такой подход должен существенно повысить точность идентификации потенциальных маркеров прогноза мрРПЖ.

Для образцов мрРПЖ без лимфогенной диссеминации проведено сопоставление групп с благоприятным (отсутствие биохимического рецидива за весь период наблюдения) и неблагоприятным (выявлен биохимический рецидив) прогнозом. Результаты сравнительного анализа представлены в табл. 1.

Выявленные различия в уровне экспрессии генов позволяют рассматривать их в качестве потенциальных прогностических маркеров. Следует отметить, что указанное повышенное или пониженное значение не отражает уровень экспрессии в опухолевой ткани РПЖ по сравнению с гистологически нормальной тканью. Например, в обеих выборках экспрессия гена может быть пониженной в опухоли, однако прогностическим маркером будет степень понижения. В данном исследовании при сравнении двух групп больных разница уровня экспрессии отражается в положительном или отрицательном знаке перед значением logFC (cм. табл. 1).

Показано, что потенциальными маркерами неблагоприятного прогноза являются 3 гена — TWIST1, TUBB3 и CHAT, экспрессирующихся на более высоком уровне в группе мрРПЖ, где возник биохимический рецидив, чем в группе сравнения, а также гены CYP1B1, IGSF1, EDN3, MSMB и SERPINA3, демонстрирующие пониженную экспрессию. Биологические процессы, в которые вовлечены эти гены, включают развитие и клеточную дифференцировку (TWIST1, EDN3, TUBB3), нейрогенез (TWIST1, EDN3), регуляцию ангиогенеза (CYP1B1), двигательной активности (TWIST1, EDN3, CYP1B1, TUBB3), развития мезенхимы (TWIST1, EDN3), гормонального фона (CHAT, CYP1B1), различных метаболических путей (CYP1B1, IGSF1), формирование клеточного ответа на внешние стимулы (EDN3, TUBB3, CHAT).

Каждый из описанных выше процессов, как правило, оказывается нарушенным при возникновении злокачественных опухолей. Гены, регулирующие двигательную активность, ангиогенез и нейрогенез (CYP1B1, EDN3, TWIST1, TUBB3, CHAT), принимают участие в пролиферации и миграции опухолевых клеток, поэтому могут быть связаны с метастазированием. Нарушение регуляции сигнальных и метаболических путей (IGSF1, SERPINA3, MSMB) является одним из важнейших факторов при развитии онкологических заболеваний, в том числе РПЖ. Например, важную роль в регуляции процессов метастазирования, пролиферации и опухолевого роста при РПЖ играет взаимодействие клеток опухоли и ее микроокружения [25, 26].

Ген CYP1B1 (Cytochrome P450 Family 1 Subfamily B Member 1) кодирует белок из суперсемейства цитохромов P450. Этот фермент окисляет несколько структурно неродственных групп веществ, таких как стероиды, жирные кислоты, ретиноиды и ксенобиотики. Роль этого фермента заключается в поддержании ангиогенеза, удалении продуктов кислородного метаболизма, подавлении активности эндотелиальной NO-синтетазы. Помимо этого, ген CYP1B1 играет важную роль в процессах пролиферации, миграции и выживания периваскулярных клеток во время ангиогенеза. Мутации гена CYP1B1, приводящие к понижению уровня экспрессии или формированию белка с нарушенной функциональной активностью, связаны с более агрессивным течением РПЖ и неблагоприятным прогнозом [18]. Полученные результаты для группы мрРПЖ без лимфогенной диссеминации согласуются с данными литературы.

Пониженная экспрессия генов IGSF1 и EDN3 ассоциирована с более высоким индексом Глисона (8 и более) и, как следствие, является потенциальным маркером неблагоприятного прогноза РПЖ [4]. Ген IGSF1 (Immunoglobulin Superfamily Member 1) кодирует белок, являющийся корецептором в сигнальном пути ингибина. Он является также антагонистом сигнального пути активина А, участвует в регуляции в активинстимулированной транскрипции. Ген EDN3 (Endothelin 3) кодирует эндотелин 3, вазоконстрикторный пептид, который активирует миграцию нейтрофилов, а также участвует в регуляции выживания, дифференцировки, миграции и пролиферации нейронов, происходящих из нервного гребня.

Ген MSMB (Microseminoprotein Beta) кодирует белок — член семейства иммуноглобулинсвязывающих факторов. Имеет ингибиноподобную активность. Показано, что средний уровень понижения экспрессии гена в опухоли по сравнению с нормальной прилежащей тканью ассоциирован со стадией РПЖ: на ранних стадиях чаще выявляют незначительное понижение, в то время как на поздних стадиях РПЖ экспрессия подавлена намного сильнее. Таким образом, согласно полученным результатам транскриптомного анализа и данным литературы, снижение экспрессии гена MSMB является потенциальным маркером неблагоприятного прогноза РПЖ [19, 20].

Ген TWIST1 (Twist Family BHLH Transcription Factor 1) кодирует транскрипционный фактор, ингибирующий миогенез, а также экспрессию провоспалительных цитокинов TNFA и IL1B. Он вовлечен в процессы эпителиально-мезенхимального перехода опухолевых клеток. В результате проведенного анализа, а также в ряде работ показано, что повышение экспрессии гена TWIST1 связано с неблагоприятным прогнозом РПЖ, в том числе с метастазированием [22, 23].

Ген TUBB3 (Tubulin Beta 3 Class III) кодирует бета-3-цепь тубулина, играет важную роль в поддержании и направлении роста аксонов. Показано, что при локализованном процессе повышенный уровень экспрессии гена TUBB3 является независимым маркером биохимического рецидива после лечения. Помимо этого, уровень экспрессии бета-3-тубулина может быть предиктором выживаемости пациентов с кастрационно-резистентным РПЖ, получающих химиотерапию на основе доцетаксела [24]. Согласно результатам проведенного исследования, повышение экспрессии гена TUBB3 также коррелирует с неблагоприятным прогнозом РПЖ.

Ген CHAT (Choline O-Acetyltransferase) кодирует фермент, катализирующий реакцию образования ацетилхолина из ацетил-КоА и холина. Ацетилхолин является основным медиатором в парасимпатической нервной системе. В связи с тем, что процессы метастазирования, пролиферации и опухолевого роста при РПЖ контролируются, в том числе вегетативными нервными волокнами, взаимодействующими с микроокружением опухоли, повышенный уровень экспрессии гена CHAT в клетках РПЖ связан с более агрессивным течением заболевания и, как следствие, неблагоприятным прогнозом [25, 26].

Ген SERPINA3 кодирует белок из суперсемейства ингибиторов протеаз. При карциноме эндометрия показано, что повышенная экспрессия этого гена ассоциирована с неблагоприятным прогнозом [21]. Однако по результатам нашего исследования, в группе больных РПЖ с неблагоприятным прогнозом уровень экспрессии гена SERPINA3 понижен.

Далее была проведена идентификация потенциальных прогностических маркеров с учетом молекулярно-генетического подтипа образцов РПЖ, согласно данным TCGA-консорциума. Рассматривали наиболее представительную группу РПЖ, характеризующуюся хромосомной перестройкой, ведущей к образованию химерного транскрипта TMPRSS2-ERG. Результаты сравнительного анализа представлены в табл. 2.

При анализе молекулярного подтипа, характеризующегося образованием в опухоли химерного транскрипта TMPRSS2-ERG, показано, что потенциальными маркерами неблагоприятного прогноза являются 6 генов — MAPK8IP2, LRFN2, CHGA, MYT1, TUBB3 и CHAT, экспрессирующихся на более высоком уровне в группе мрРПЖ, где возник биохимический рецидив, чем в группе сравнения, а также гены MYBPC1, PAGE4, демонстрирующие пониженную экспрессию. Гены TUBB3 и CHAT также идентифицированы в качестве маркерных в общей группе пациентов с мрРПЖ без лимфогенной диссеминации (не разделенной на молекулярные подтипы).

Выявленные гены вовлечены в такие процессы, как межклеточные взаимодействия, регуляция сигнальных путей, формирование и дифференцировка нейронов, секреция и метаболизм.

Ген MYBPC1 (Myosin Binding Protein C, Slow Type) кодирует белок, ассоциированный с тонкими филаментами. Предположительно белок MYBPC1 модулирует активность мышечных сокращений, а также выполняет структурную функцию. Показано, что падение уровня экспрессии гена MYBPC1 значимо ассоциировано со снижением метастатической активности РПЖ и, следовательно, является потенциальным маркером благоприятного прогноза заболевания [27, 28].

Ген PAGE4 (PAGE FamilyMember 4) кодирует белок 4, принадлежащий к семейству PAGE. Известно, что гены этого семейства активны в клетках РПЖ и являются транскрипционными регуляторами канцерогенеза. Показано, что ген PAGE4 связан с ингибированием сигнального пути андрогенного рецептора и является прогностическим маркером, в том числе позволяет оценить длительность безрецидивного периода у пациентов с РПЖ, не получавших неоадьювантную гормональную терапию [4].

Ген MAPK8IP2 (Mitogen-Activated Protein Kinase 8 Interacting Protein 2) кодирует скаффолдный белок, соединяющий специфические компоненты MAPK-киназного сигнального пути. Нарушение функционирования этого гена ассоциировано с риском развития рака шейки матки, а также злокачественной амелобластомы.

Ген LRFN2 (Leucine Rich Repeat And Fibronectin Type III Domain Containing 2) кодирует белок, ускоряющий рост аксонов гиппокампа.

Ген MYT1 (Myelin Transcription Factor 1) кодирует транскрипционный фактор миелина 1. Предположительно белок MYT1 играет важную роль в развитии нейронов и олигодендроглии центральной нервной системы.

В ряде исследований [4] выявлено статистически значимое изменение уровня экспрессии генов PAGE4, MAPK8IP2, MYT1 и LRFN2 у группы пациентов с высоким индексом Глисона (8 и более) по сравнению с группой пациентов, у которых индекс Глисона составил 6 и менее.

Ген CHGA (Chromogranin A) кодирует белок-предшественник нескольких биологически активных пептидов: вазостатина-1, панкреастатина, парастатина и катестатина. Эти пептиды являются негативными модуляторами нейроэндокринной системы. Нарушение нормального функционирования этого гена связано с развитием нейроэндокринных опухолей и атрофического гастрита. Известно, что нейроэндокринный фенотип ассоциирован с возникновением метастатического кастрационно-резистентного РПЖ. Показано, что повышение уровня экспрессии гена CHGA является маркером метастазирования РПЖ [29, 30].