Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) — наиболее распространенная первичная опухоль печени. Заболеваемость ГЦК имеет тенденцию к ежегодному росту в результате увеличения числа больных с хроническими заболеваниями печени, в том числе вирусной этиологии, и прежде всего с гепатитом B и C. За последние 3 года в России ежегодно регистрируется более 6 тыс. новых случаев с высокой степенью запущенности, превышающей 80%, и одногодичной летальностью более 65%. Среди всех злокачественных новообразований по частоте встречаемости ГЦК у мужчин занимает 13-е место, у женщин — 18-е [1].

Наличие диспластических очагов в печени у пациентов группы высокого риска может стать одной из причин трансформации их в ГЦК [2, 3]. Предраковые изменения характеризуются высокой пролиферативной активностью гепатоцитов и морфологическим сходством с ГЦК [3, 4]. Лучевая диагностика позволяет получить изображения с высоким разрешением, особенно при использовании методик внутривенного контрастирования. Точность, чувствительность и специфичность лучевой диагностики ГЦК составили 97,1, 100 и 91,7% соответственно [5]. Несмотря на это, для определения лечебной тактики узловые образования печени требуют морфологической верификации.

В настоящее время существует несколько способов получения клеточного материала из очаговых образований печени. Тонкоигольная аспирационная биопсия (ТИАБ) под визуальным контролем получила признание в качестве малоинвазивной диагностической процедуры при очаговых поражениях печени с минимальным риском осложнений. Это подтверждается работой F. Fornari [6], проведенной еще в 1989 г. в Италии, где отмечена низкая частота летальных осложнений 10 766 ТИАБ, которая составила 0,018% случаев.

Первые сообщения об успешной цитоморфологической диагностике ГЦК появились примерно 40 лет назад, во многих последующих исследованиях сообщается о чувствительности и специфичности — 67—95 и 80—95% соответственно [7, 8]. По данным литературы [9—11], в некоторых случаях образцы ТИАБ более репрезентативны, чем биопсия с использованием стержневой иглы. Кроме того, в цитологическом материале мазков-отпечатков с core-биоптатов меньше стромальных элементов, чем в гистологическом, полученном при core-биопсии, и больше диагностического клеточного материала.

Учитывая ряд преимуществ ТИАБ: дешевизну, возможность проведения экспресс-диагностики с повторным забором клеточного материала с небольшим риском для пациента, получение обильного диагностического материала, необходимо более широко применять этот метод в диагностике очаговых поражений печени. Необходимо отметить перспективные современные методики обработки пункционного материала для цитологического исследования, такие как жидкостная цитология, техника клеточных блоков (КБ). Приготовление КБ из аспиратов является весомым дополнением к традиционным цитологическим препаратам при выполнении ТИАБ, так как позволяет обеспечить сохранность клеточных структур, архивировать клеточный материал неограниченное время, получить серийные срезы, качественно проводить иммуноцитологические исследования по установленным иммуногистохимическим протоколам [12, 13].

Диагностические критерии ГЦК в цитологии описаны в 1984 г. и подтверждены в ряде работ, но тем не менее дифференциальная цитологическая диагностика высокодифференцированной ГЦК и нодулярной гиперплазии печени остается серьезной проблемой [14—17].

В настоящем исследовании проведено сравнение морфологических картин при ГЦК и нодулярной гиперплазии печени в традиционных цитологических препаратах и в КБ с учетом клеточной атипии и клеточных структур. Учитывая, что оба метода необходимо применять для цитологической диагностики ГЦК, показана возможность получения достаточного количества опухолевых клеток при ТИАБ для приготовления КБ, которые могут помочь как в уточняющей диагностике ГЦР, так и в случае необходимости проведения молекулярно-генетических исследований [18—22].

Материал и методы

Проанализирован материал цитологического исследования 90 больных с объемными новообразованиями печени: у 30 с доброкачественными изменениями печени и у 60 больных с ГЦК. Получение клеточного материала выполняли под ультразвуковым наведением двумя способами: с помощью ТИАБ у 55 (61,1%) больных, путем core-биопсии и взятия мазков-отпечатков со столбика у 35 (38,9%). У всех пациентов проведены цито-гистологические сопоставления. Оптимальные результаты достигались с помощью привлечения опытной команды, состоящей из врача УЗИ-диагностики и цитолога. Использовали методику быстрой оценки адекватности образца (ROSE-Rapid On Site Evaluation), извлеченного из очагового образования печени с окрашиванием препаратов экспресс-красителем Diff-Quik (MGG) или LEUKODIF 200 (LDF200).

Пункционный материал при ТИАБ распределяли тонким слоем на 1—2 обезжиренных предметных стеклах. Остаток материала помещали в эппендорф-пробирку с транспортной средой, для этого многократно промывали в ней шприц и иглу. Оценку концентрации диагностического материала в эппендорф-пробирке осуществляли на одном препарате после нанесения его по методике жидкостной цитологии на цитоцентрифуге Cellspin II. При высокой клеточности из остатка пункционного материала после получения осадка изготавливали КБ. Жидкостную технологию BD SurePath использовали только в случаях, если в пункционном материале преобладали элементы некроза, что позволяло повысить пропорцию диагностически значимого клеточного материала за счет клеточного обогащения и удаления элементов крови, воспаления и некротических масс. При core-биопсии материал распределяли на 2—3 предметных стекла в виде мазков-отпечатков, а оставшуюся порцию столбика ткани отправляли на гистологическое исследование. Фиксацию цитологических препаратов осуществляли при его высушивании на воздухе. Для окраски применяли экспресс-краситель MGG (Bio-Optica, Италия).

Необходимо отметить, что применение жидкостной цитологии в варианте Citospin позволяет использовать весь остаточный материал при ТИАБ, лучше контролировать все этапы пробоподготовки и тем самым расширяет возможности цитологического метода исследования.

Результаты исследования

При цитологической диагностике ГЦК одной из диагностических проблем являются трудности дифференциальной диагностики доброкачественных поражений, а именно очаговой гиперплазии и высокодифференцированной ГЦК, кроме того, требуется проведение дифференциальной диагностики ГЦК и метастатических поражений печени.

Аспираты из участка нормальной ткани печени состояли в основном из гепатоцитов с примесью эпителиальных клеток желчных протоков, клеток Купфера и эндотелиальных клеток. Клетки желчных протоков в норме редко встречались в аспиратах из печени. Они были представлены однослойными скоплениями клеток в виде «пчелиных сот». Гепатоциты присутствовали как отдельные клетки или небольшие монослойные группы клеток, имели округлую, иногда полигональную форму с четко выраженными клеточными границами и плотной цитоплазмой с включениями пигмента (липофусцина, гемосидерина, желчного). Ядро гепатоцитов чаще округлое, с гладким ядерным контуром, тонким, равномерно распределенным хроматином и иногда заметным ядрышком. Жировая дистрофия в клетках наблюдалась при любом узловом поражении печени и отмечалась в 40% случаев.

При доброкачественных процессах в печени, как правило, отсутствовал ядерный и клеточный полиморфизм. Однако в некоторых случаях при нодулярной гиперплазии в печени наблюдался выраженный клеточный и ядерный полиморфизм с наличием гипертрофированных нуклеол, что может объективно приводить к ложноположительному диагнозу даже опытного цитолога. Эпителий желчных протоков присутствовал обычно в небольших скоплениях из мономорфных клеток с четкими ядрами, ядрышки не просматривались. Значительное количество эпителия желчных протоков свидетельствовало о репаративных процессах паренхиматозно-стромального компонента. При наличии в препаратах нагромождающихся друг на друга клеток паренхимы печени цитологическая картина могла имитировать аденокарциному. Иногда присутствовал воспалительный фон из лимфоцитов, гистиоцитов и нейтрофилов.

Аспираты ГЦК в полноценных пунктатах имели высокую клеточность. Опухолевые клетки лежали разрозненно, в том числе в виде атипичных «голых» ядер, которые имели округлую и неправильную полигональную форму, превышающую размеры типичного гепатоцита в 1,5—2 раза. Иногда присутствовали двуядерные клетки и внутриядерные включения. Цитоплазма неопластических гепатоцитов в большинстве случаев содержала гранулы желчных пигментов. Анализ цитограмм показал, что к патогномоничным признакам ГЦК можно отнести наличие комбинации морфологических признаков, таких как митозы, атипичные «голые» ядра, внутриядерные включения. При наличии в препаратах нагромождающихся друг на друга скоплений опухолевых гепатоцитов цитологическая картина могла напоминать метастаз аденокарциномы. В случае высокодифференцированной ГЦК обращали на себя внимание мономорфность опухолевых гепатоцитов, отсутствие комплексов, минимального полиморфизма в клетках и нуклеол в ядрах, что затрудняло традиционную цитологическую диагностику.

При получении материала в виде мазков-отпечатков при core-биопсии ложноотрицательные и ложноположительные результаты неизбежны по причине ограничения возможностей традиционной цитологии. При цитологическом исследовании мазков-отпечатков с core-биоптатов наличие выраженного полиморфизма реактивно измененных гепатоцитов из очага нодулярной гиперплазии привело к ложноположительному цитологическому заключению о наличии ГЦК (рис. 1, а, на цв. вклейке). В сложных диагностических случаях при нодулярной гиперплазии гепатоциты имели выраженный полиморфизм, демонстрируя вариации в размере, форме клеток и ядре. В препаратах просматривалась тенденция клеток комплексоваться.

Рис. 1. Дифференциальная цитологическая дигностика нодулярной гиперплазии печени и ГЦК.

а — реактивно измененные гепатоциты, об. ×100; б — высокодифференцированная, об. ×10; а, б — препарат Cellspin, окраска MGG.

Частота ложноотрицательных цитологических результатов в диагностике ГЦК высока при отсутствии в мазках клеточного полиморфизма в высокодифференцированных ГЦК (рис. 1, б, на цв. вклейке). В нашем исследовании отмечен случай расхождения с гистологическим результатом по материалу мазка-отпечатка core-биопсии. В данном наблюдении гепатоциты имели полигональную форму с четкими границами, обильную гранулярную цитоплазму, центрально расположенное круглое ядро с четко выраженной ядерной мембраной и отчетливым ядрышком. Наиболее характерным являлось разрозненное расположение опухолевых гепатоцитов. Ядерно-цитоплазматическое соотношение в опухолевых клетках составляло примерно 1:3.

Таким образом, чувствительность традиционного цитологического метода в диагностике ГЦК печени составила 97%, специфичность — 98%, достоверность (точность) — 98%.

Учитывая ограничения цитологической диагностики в изучении архитектурных признаков по традиционным и жидкостным препаратам Cellspin, дополнительную информацию получали при анализе препаратов КБ. При реактивной гиперплазии отмечалась сохранность четких ацинарных структур в сочетании со слабовыраженным полиморфизмом клеток. При высокодифференцированной ГЦК наблюдались альвеолярно-солидные поля опухолевых клеток. Возможность оценки структурных (архитектурных) признаков явилась преимуществом КБ, что позволило не только избежать ложноотрицательных и ложноположительных результатов, но и выделить варианты гистологического строения ГЦК. В нашем исследовании в сложных диагностических случаях ГЦК при ТИАБ полученный КБ отличался тем, что клеточный и ядерный полиморфизм был менее выражен, чем архитектурные признаки.

Адекватными для цитологической диагностики по традиционным и жидкостным препаратам являются следующие варианты ГЦК: светлоклеточный (рис. 2, а, на цв. вклейке), плеоморфный (рис. 2, б, на цв. вклейке), веретеноклеточный вариант с участками остеобластокластической дифференцировки (рис. 2, в, на цв. вклейке) и фиброламинарный (рис. 2, г, на цв. вклейке). В цитологических препаратах светлоклеточного варианта ГЦК опухолевые клетки мономорфны, полигональной формы, имеют пенистую, оптически светлую цитоплазму из-за исчезновения гранул гликогена и липидов, иногда напоминают клетки гистиоцитарного ряда (см. рис. 2, а, на цв. вклейке). Данный вид рака необходимо дифференцировать от метастазов рака почек и светлоклеточных карцином других локализаций. Для плеоморфного варианта ГЦР характерными признаками являлись выраженный полиморфизм опухолевых клеток с неровными контурами и вариабельными в размерах ядрами, иногда выраженные дистрофические изменения, которые сопровождались наличием значительного количества «голых» ядер (см. рис. 2, б, на цв. вклейке). Для веретеноклеточного варианта с участками остеобластокластической дифференцировки характерно наличие плеоморфных веретеновидных клеток и рассеянных гигантских клеток с 10—20 мономорфными ядрами (см. рис. 2, в, на цв. вклейке). Фиброламинарный вариант характеризовался наличием тяжей плотного оксифильного вещества типа фиброзного, внутри которого находились опухолевые разрозненно лежащие клетки со скудной цитоплазмой (см. рис. 2, г, на цв. вклейке).

Рис. 2. Варианты ГЦК в традиционных цитологических мазках.

а — светлоклеточный, об. ×10; б — плеоморфный, об. ×100; в — веретеноклеточный вариант с участками остеобластокластической дифференцировки, об. ×10; г — фиброламинарный, об. ×20.

а—г — препарат Cellspin, окраска MGG.

При цитологическом исследовании ГЦК по традиционным и жидкостным препаратам выделить варианты гистологического строения (трабекулярный, солидный, ацинарный, тубулярный, скиррозный) оказалось невозможно. Однако анализ материала КБ и сопоставление его с гистологической картиной показали возможность определения следующих гистологических вариантов ГЦК: трабекулярный (рис. 3, а, на цв. вклейке), солидный (см. рис. 3, а, на цв. вклейке), ацинарный (рис. 3, б, на цв. вклейке), тубулярный (рис. 3, в, на цв. вклейке), светлоклеточный (рис. 3, г, на цв. вклейке). Скиррозный, саркоматозный варианты в нашей практике не встречались. При трабекулярном варианте в традиционных цитологических препаратах опухолевые клетки преимущественно округлой и неправильной полигональной формы, в 1,5—2 раза превышающие размеры типичного гепатоцита, с округлыми средних или крупных размеров гиперхромными ядрами с глыбчатым хроматином и мелкими ядрышками. При высокодифференцированном трабекулярном варианте ГЦР опухолевые клетки отличаются минимальной степенью ядерной и клеточной атипии. При снижении дифференцировки отмечалось нарастание численности атипичных клеток, в том числе и 2—7 ядерных клеток. Во всех наблюдениях низкодифференцированного трабекулярного рака их дополняли клетки с единичными митозами, в том числе патологическими. В материале КБ отмечается формирование опухолевыми клетками трабекул толщиной в 2—3 гепатоцита (см. рис. 3, а, на цв. вклейке). В материале КБ не просматриваются межтрабекулярные синусоидные сосуды, выстланные уплощенными эндотелиальными клетками и звездчатыми клетками Купфера, позволяющие более четко выявлять опухолевые трабекулы. Соответственно оценить степень фиброза тоже не представлялось возможным по той же причине, что и отсутствие стромального компонента при получении материала с помощью ТИАБ. ГЦК солидного строения является разновидностью его трабекулярного варианта. В традиционных цитологических препаратах опухолевые клетки округлой и неправильной полигональной формы, лежащие в виде пластов и/или разрозненно. Размеры опухолевых клеток в 2—2,5 раза превышают таковые типичного гепатоцита с округлыми крупных размеров гиперхромными ядрами и мелкими ядрышками. В части опухолевых гепатоцитов отмечалось наличие внутрицитоплазматических включений. В КБ при данном варианте ГЦК так же, как в гистологических препаратах, отмечается очень тесное сближение трабекул и наблюдается картина солидных структур (см. рис. 3, а, на цв. вклейке). При этом в некоторых участках можно заметить характерное расположение опухолевых клеток в виде колонн. В цитологических препаратах ГЦК ацинарного типа опухолевые клетки имели тенденцию группироваться в комплексы. Клетки неправильной округлой формы средних размеров со смещенными к периферии ядрами. Иногда встречались мелкие ядрышки. Цитоплазма гомогенная. Многоядерные клетки не встречались. По морфологии опухолевые клетки практически ничем не отличались от тубулярного варианта. В материале КБ четко прослеживалось ацинарное (псевдожелезистое) строение (см. рис. 3, б, на цв. вклейке). Опухолевые гепатоциты формировали железистоподобные структуры в виде канальцев и протоков, в просвете которых выявлялись желчный пигмент, коллоидоподобное содержимое или экссудат с макрофагами. Иногда наблюдались более крупные кистозные полости, выстланные опухолевыми клетками, или структуры, напоминающие фолликулы щитовидной железы. В цитологических препаратах при ГЦК тубулярного строения опухолевые клетки группируются в комплексы, имеют неправильную округлую форму средних размеров. Отмечается наличие гиперхромных, смещенных к периферии ядер с глыбчатым хроматином и мелкими ядрышками, гомогенной или вакуолизированной цитоплазмой. Иногда встречаются многоядерные клетки. В препаратах низкодифференцированного рака их дополняют клетки с единичными митозами, в том числе патологическими. В препаратах КБ тубулярное строение и формирование альвеолярных структур четко просматриваются в каждом препарате в объективе при увеличении в 4 и 10 раз, но стромальный компонент не определяется (см. рис. 3, в, на цв. вклейке). При светлоклеточном варианте ГЦК в препаратах КБ опухолевые мономорфные, полигональные клетки по морфологии идентичны таковым в традиционных цитологических препаратах, имеют пенистую, оптически светлую цитоплазму (см. рис. 3, г, на цв. вклейке).

Рис. 3. Варианты ГЦК в клеточных блоках.

а — трабекулярно-солидный, об. ×40; б — ацинарный, об. ×20; в — тубулярный, об. ×40; г — светлоклеточный, об. ×10.

а—г — препарат клеточного блока, окраска гематоксилином и эозином.

Заключение

ГЦК — гетерогенная группа опухолей. Существуют проблемы и ограничения традиционной цитологической диагностики ГЦК. Однако малоинвазивность ТИАБ позволяет проводить пункцию очаговых образований печени размером менее 1—2 см. Профессионализм врача УЗИ-диагностики и цитолога, надлежащая оснащенность цитологической лаборатории обеспечивают достоверность диагноза до 98%.

Основываясь на нашем опыте, можно сказать, что трудности в диагностике объемных образований печени связаны с дифференцировкой клеток. Подготовка КБ дает дополнительное преимущество, поскольку можно изучить дополнительно архитектонику клеточных скоплений в полученном образце. Таким образом, при ТИАБ мы рекомендуем в сочетании с традиционной цитологией использовать метод КБ. При этом роль цитологии логично вписывается в общую клиническую тактику при обследовании пациента, так как сроки выполнения цитологического исследования составляют от 20 мин до 3 дней.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — С.В. Сметанина

Сбор и обработка материала — Е.Ю. Ускова

Статистическая обработка — Г.С. Размахаев

Написание текста — Е.Н. Славнова

Редактирование — Н.Ю. Орлинская

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare that they have no conflicts of interest.