Современные представления о гипоксии как о важнейшем патологическом триггере, приводящем к необратимому повреждению клеток, сформировались только к 60-м годам ХХ века, несмотря на то что исследования по проблеме кислородного голодания были начаты еще в XIX столетии. Принято полагать, что ведущим патогенетическим звеном при гипоксии тканей любой этиологии является дефицит энергии в клетках [1]. В основе энергообеспечения клеток лежит тканевое дыхание, где донором водорода являются различные энергетические субстраты (глюкоза, жирные кислоты, аминокислоты, кетоновые тела, глицерин и др.), а в роли оксиданта выступает атмосферный кислород, транспортируемый в клетку с помощью гемоглобина.

Одной из часто встречающихся в природе и крупных мегаполисах форм кислородной недостаточности является гипоксическая (гипобарическая) гипоксия, вызванная снижением процентного содержания кислорода во вдыхаемом воздухе. В то же время интенсивное промышленное освоение горных и арктических регионов, проведение военных, спортивных, оздоровительных и других мероприятий ставят перед современной медициной вызовы, связанные с разработкой ранних диагностических критериев гипоксической полиорганной недостаточности, оптимизации процессов адаптации и сохранения высокой работоспособности человека, длительно или регулярно находящегося в экстремальных зонах, что невозможно без понимания современных механизмов адаптации организма к гипоксии [2].

В условиях высокогорья и Арктики разряженная атмосфера нередко сочетается с низкими температурами. Известно, что холодовое воздействие как мощный стрессорный фактор является пусковым моментом в развитии каскада изменений метаболических процессов организма. Нарушая передачу электронов в митохондриальной дыхательной цепи путем разобщения окислительного фосфорилирования, низкие температуры, несомненно, увеличивают энтропию, что способствует повышенной теплопродукции, при этом существенно угнетая синтез аденозинтрифосфата (АТФ) [3]. В свою очередь уменьшение концентрации АТФ в клетке вызывает ее ингибирующее влияние на ключевой фермент гликолиза — фосфофруктокиназу. Усиленный распад фосфолипидов за счет образования лизофракций и распад белков приводят к деструкции клеточных структур. В результате повышается концентрация ненасыщенных жирных кислот, усиливается перекисное окисление липидов, подавляется активность антиоксидантных систем организма, и в первую очередь супероксиддисмутазы, что способствует разрушению клеточных мембран [4, 5]. Таким образом, логично предположить, что при сочетании двух мощных стрессорных факторов — гипобарической гипоксии и пониженных температур — может наблюдаться их взаимопотенцирующий эффект. Вышеизложенное подчеркивает важность углубленного гистологического исследования миокарда при гипобарической холодовой гипоксии с целью уточнения закономерностей его специфического поражения.

Цель исследования — изучение патоморфологических изменений миокарда в экспериментах на крысах при воздействии на организм гипобарической холодовой гипоксии.

Исследование проведено на 21 половозрелом самце крыс линии Wistar массой 220—310 г. Животных разделили на две группы. 1-ю группу контроля составили 6 интактных крыс, во 2-ю группу вошли 15 особей, которым на протяжении 30 дней моделировали гипобарическую гипоксию без коррекции. На протяжении всего эксперимента животных 2-й группы ежедневно на 1 ч погружали в прозрачную барокамеру, снабженную манометром, предохранительным клапаном, щелочным поглотителем для устранения избытка углекислого газа. В барокамере создавалось давление ниже атмосферного, что соответствовало подъему на 6000 м над уровнем моря (354,2 мм рт.ст.), а это эквивалентно умеренно интенсивному гипоксическому воздействию [6]. Камера была помещена в холодильную установку при температуре 0 °C.

Животных содержали в виварии с соблюдением правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите животных (1997). Экспериментальные исследования проводили в соответствии с этическими требованиями к работе с экспериментальными животными, приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.87 «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», Федеральным законом «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.97, приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.03 «Об утверждении правил лабораторной практики». Исследование одобрено локальным этическим комитетом Медицинской академии им. С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского».

Завершив эксперимент, сердца вышеуказанных самцов после проведения торако- и перикардиотомии извлекали и мгновенно помещали в кардиоплегический раствор (0,9% КСl при температуре 0 °С), что позволяло достичь остановки сердца в диастолу. Фрагменты миокарда для рутинного гистологического исследования фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин по стандартной методике. Депарафинированные срезы толщиной 6—8 мкм для обзорной микроскопии окрашивали гематоксилином и эозином, для выявления соединительнотканных волокон — азокрамином по Гейденгайну [7].

Для трансмиссионного электронно-микроскопического исследования кусочки миокарда фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида, приготовленном на какодилатном буфере (pH 7,2—7,4) или фосфатном буфере Миллонига (pH 7,2—7,4) с последующей дофиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия на том же буфере. Материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации по общепринятой методике и заливали в смесь аралдита Н и аралдита М [8]. Ультратонкие срезы толщиной 500—600 нм готовили на ультратоме LKB III (Швеция), контрастировали 2% раствором уранилацетата и цитратом свинца по Рейнольдсу и исследовали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа SELMI (Украина) при ускоряющем напряжении 120 кВ.

Для вычисления каждого показателя производили не менее 30 измерений с помощью компьютерной программы Image J (США) [9]. Данные представляли как M±m. Отличия между морфометрическими показателями разных групп оценивали по t-критерию Стьюдента, различия между величинами считали достоверными при p<0,05. Все исследования производили с использованием средств измерительной техники, прошедших метрологическую поверку, и вспомогательного оборудования, прошедшего аттестацию на базе отдела морфологии с электронной микроскопией Центральной научно-исследовательской лаборатории Медицинской академии им. С.И. Георгиевского.

Следствием гипоксического воздействия у большинства животных стали довольно выраженные гетерогенные морфологические признаки повреждения миокарда. Большинство сократительных кардиомиоцитов имело просветленную саркоплазму с признаками смешанной дистрофии, в которой находились гиперхромные истонченные ядра. На этом фоне небольшая часть кардиомиоцитов имела гипертрофированные ядра с отчетливыми ядрышками, что отражает усиление метаболизма в этих клетках и может свидетельствовать о протекании компенсаторно-адаптационных процессов в неповрежденных кардиомиоцитах. Наряду с поражением сократительных кардиомиоцитов обращают на себя внимание деструктивные проявления в сосудах гемомикроциркуляторного русла. Повсеместно отмечаются признаки деструкции ряда капилляров. В интактных капиллярах эритроциты всегда имеют нормальный вид. Эритроциты, находящиеся в просвете разрушенных капилляров, зачастую имеют признаки лизиса. Выявляются клеточная инфильтрация, локальные сужения и отек стенок артериол. В норме ядра гладких миоцитов располагаются радиально вокруг просвета сосуда, но за счет внутриклеточного отека при воздействии гипоксии они ориентированы беспорядочно под разными углами к просвету артерии. В интерстициальном пространстве местами отмечаются отечность и клеточная инфильтрация.

В составе мышечных волокон компактного слоя миокарда левого желудочка присутствуют кардиомиоциты со слабоокрашенной саркоплазмой и явлениями дистрофии; вставочные диски между ними расширены, разрыхлены и почти не прокрашены (рис. 1).

Выраженная гипохромия саркоплазмы, вероятно, обусловлена деструкцией миофибрилл, что проявляется в разрежении продольной и размытости поперечной исчерченности, демонстрируя литический характер повреждений. У некоторых гипохромных кардиомиоцитов продольная исчерченность и вовсе не определяется, при этом виден распад миофибрилл на мелкие точечные фрагменты, которые либо располагаются в виде пунктирных линий красного цвета, сохраняя направление целых миофибрилл, либо хаотично рассеяны. Подобный паттерн окрашивания, как правило, занимает у большинства кардиомиоцитов лишь центральную часть саркоплазмы, а не весь ее объем. Описанные патологические явления носят диффузный характер, что указывает на гетерогенность поражения мышечных волокон при гипоксии.

Сведения таблицы свидетельствуют о том, что при воздействии холодовой гипобарической гипоксии наблюдается достоверное увеличение площади ядер сократительных кардиомиоцитов по сравнению с контролем с 51,39±0,48 до 63,57±0,46 мкм² (р=0,05), т. е. на 19,15%, что говорит о начале процессов гипертрофии кардиомиоцитов. Однако из-за интерстициального отека, а также вследствие некротических изменений ряда кардиомиоцитов во 2-й группе наблюдается тенденция к уменьшению среднего количества ядер в исследованных полях зрения, но результат статистически недостоверен (см. таблицу).

Общеизвестно, что ответной реакцией на гипоксию и ацидоз является разрастание соединительнотканных (коллагеновых) волокон. При воздействии гипоксии, как и любого повреждающего фактора, при котором гибнут кардиомиоциты, происходит активация интерстициальных фибробластов. Они синтезируют сначала аморфное вещество соединительной ткани — гликозаминогликаны, из которых в свою очередь образуются незрелые и зрелые коллагеновые фибриллы (рис. 2).

Данные исследования показывают, что при моделировании холодовой гипобарической гипоксии существует и другая причина резкого снижения кислородного дефицита сократительных кардиомиоцитов, помимо разряженной атмосферы. Это происходит как в результате непосредственной деструкции сосудов микроциркуляторного русла, так и вследствие развития отека стенки сосудов, расширения периваскулярного пространства, усиления фибриллогенеза и соответственно затруднения диффузии газов. Это предположение подтверждается законом А. Фика, согласно которому скорость диффузии газов в ткани обратно пропорциональна толщине мембраны. Таким образом, логичным будет прогноз о неуклонном нарастании ацидоза, ишемии и гипоксии кардиомиоцитов, что замыкает порочный круг и приводит к дальнейшему усугублению интерстициального фиброза и нарушению трофики сохранных кардиомиоцитов. А это в свою очередь является предпосылкой для необратимого ремоделирования миокарда [10].

При ультраструктурном анализе на фоне влияния холодовой гипобарической гипоксии практически во всех элементах миокарда наблюдаются альтеративные процессы.

Ядра большинства кардиомиоцитов сохраняют целостность, но их контуры часто деформированы и волнисты за счет формирования остроконечных инвагинатов, хроматин преимущественно конденсирован у внутренней мембраны кариолеммы, тогда как в ядрах интактных клеток преобладает эухроматин.

У ряда кардиомиоцитов сарколемма интактна, вплотную прилежит к миофиламентам либо оставляет узкое пространство, в котором располагаются митохондрии и канальцы саркоплазматического ретикулума. Пространство между вставочными дисками расширяется, вследствие чего отмечается нарушение соединений кардиомиоцитов, что может влиять на проводящую способность.

По ходу некоторых миофибрилл наблюдается обеднение рисунка за счет гомогенизации пучков миофиламентов. У части сократительных миоцитов отмечаются разобщение миофибрилл, участки их разрежения и очагового разрушения. В ряде кардиомиоцитов выявлялись признаки выраженной деструкции миофибрилл в виде разрывов, преимущественно в области I-дисков, разъединения их пучков за счет формирования отека. Наблюдается много контрактур с образованием полос пересокращения, а также зоны гомогенизации и деструкции миофиламентов. Диски Z расширялись, образуя полосу с неровными краями, почти достигающую ширины диска I, а иногда и вовсе не определялись.

При исследовании органелл обращают на себя внимание набухание и деформация митохондрий, матрикс которых мелкозернистый, иногда просветлен. Характерны дезорганизация митохондриальных мембран и некоторое уменьшение количества крист, которые выглядят лизированными и размытыми. Даже в пределах одного кардиомиоцита одни мелкие темные митохондрии имеют довольно четкие контуры мембран, другие, более крупные, — смазанные, расплывчатые. В основном митохондрии набухшие, увеличены в размерах, число крист на единицу площади уменьшено, матрикс разрежен, выглядит оптически пустым. Количество крист может варьировать от десятков до единиц. У некоторых митохондрий наружные мембраны теряют двухконтурность и становятся расплывчатыми, что свидетельствует об их тотальном лизисе (рис. 3).

На некоторых участках миокарда, где имеет место незначительно выраженный или умеренный отек саркоплазмы кардиомиоцитов, встречаются полиморфные митохондрии, плотно прилежащие друг к другу, к сарколемме, ядру и образующие обширные скопления. В таких участках миофибриллы могут практически отсутствовать. Часто выявляются расширение канальцев саркоплазматического ретикулума, снижение числа гранул гликогена и других включений.

Таким образом, нарушение упорядоченного митохондриального дыхания и окислительного фосфорилирования за счет лизиса митохондриальных мембран приводит к истощению запасенной в макроэргических соединениях энергии АТФ, необходимой для поддержания всего разнообразия биохимических реакций кардиомиоцитов. Такое повреждение митохондриального аппарата приводит к лавинообразному накоплению недоокисленных субстратов с появлением кислородных радикалов, что обусловливает дальнейший пробой клеточных мембран и усугубление энергетического дефицита в клетках [6].

В сосудах микроциркуляторного русла также выявляются значительные патоморфологические изменения. Просветы капилляров неравномерно расширены, в некоторых из них наблюдаются сладжи эритроцитов. Базальная мембрана эндотелиоцитов имеет неравномерную толщину, по ее ходу встречаются разрыхленные отечные участки. В цитоплазме эндотелиоцитов уменьшено содержание пиноцитозных пузырьков всех типов, что свидетельствует об угнетении транспортной функции эндотелия. В расширенных за счет отека периваскулярных пространствах закономерно наблюдается умеренная соединительнотканная и лейкоцитарная инфильтрация, что, как известно, вызывает нарушение трофики и гипоксию мышечных волокон.

Анализ электронограмм подтверждает вывод о первичном поражении сосудов микроциркуляторного русла при развитии гипобарической холодовой гипоксии миокарда, сделанный по результатам светооптического исследования: практически не обнаружено поврежденных кардиомиоцитов, прилежащих к интактным капиллярам, все они примыкают к разрушающимся сосудистым структурам. На ряде электронограмм выявлено начало синтеза хаотичных коллагеновых фибрилл как в местах некроза кардиомиоцитов, так и в интерстициальном пространстве (рис. 4).

Гипобарическая гипоксия в сочетании с холодовым стрессом приводит к развитию выраженных дизрегуляционных процессов, направленных на трансформацию сложившегося гомеостаза, создает благоприятные условия для радикалообразования и способствует развитию как обратимых ишемических, так и необратимых гипоксических изменений кардиомиоцитов, что подтверждается результатами морфологических исследований, полученных авторами.

Патоморфологические изменения при воздействии холодовой гипобарической гипоксии проявляются дистрофией в сочетании с компенсаторной гипертрофией ряда кардиомиоцитов, довольно выраженными дисциркуляторными нарушениями, пролиферацией фибробластов, резко усиливающих внеклеточную экспрессию белкового матрикса, что может привести к ремоделированию и необратимой дисфункции миокарда при пролонгированном гипоксическом воздействии.

В целом даже после 30-дневного гипоксического воздействия регистрируется довольно значительное количество зон необратимой деструкции капилляров и сократительных кардиомиоцитов. В препаратах миокарда всех животных отчетливо выявляется мозаичность деструкции сарколеммы и митохондриального аппарата.

Идентификация начальных механизмов ремоделирования миокарда при гипобарической холодовой гипоксии имеет важное практическое значение. Это дает возможность рассматривать основные звенья патологических процессов в качестве потенциальной терапевтической «мишени» при лечении гипоксических повреждений миокарда.

Сведения об авторах

Заднипряный И.В. — д.м.н., проф., зав. кафедрой топографической анатомии и оперативной хирургии, Медицинская академия им. С.И. Георгиевского, ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского»; https://orcid.org/0000-0002-8181-9709

Сатаева Т.П. — к.м.н., доцент кафедры биологии, Медицинская академия им. С.И. Георгиевского, ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского»; https://orcid.org/0000-0001-6451-7285

Третьякова О.С. — д.м.н., проф., зав. кафедрой общественного здоровья и здравоохранения, Медицинская академия им. С.И. Георгиевского, ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского; https://orcid.org/0000-0002-2476-0624

Автор, ответственный за переписку: Заднипряный Игорь Владимирович — https://orcid.org/0000-0002-8181-9709; e-mail: zadnipryany@gmail.com

Как цитировать:

Заднипряный И.В., Сатаева Т.П., Третьякова О.С. Патоморфологические изменения миокарда крыс при воздействии гипобарической холодовой гипоксии. Оперативная хирургия и клиническая анатомия (Пироговский научный журнал). 2019;3(2):13-18. https://doi.org/10.17116/operhirurg2019302113