Введение

Число пациентов с ранами, полученными в результате травм различной этиологии, продолжает оставаться высоким, в связи с чем лечение данной патологии является одной из актуальных проблем хирургии [1, 2]. В свою очередь устойчивость микроорганизмов к противомикробным препаратам, иммунодепрессивные состояния и другие причины, замедляющие процессы регенерации, приводят к нагноению ран, развитию сепсиса и значительно снижают эффективность лечения, а также увеличивают его длительность и стоимость [2].

Процесс заживления ран включает несколько фаз: воспаление, пролиферацию и ремоделирование тканей [3]. На первом этапе в результате экссудативно-деструктивных изменений, включающих распад белков, анаэробный гликолиз с накоплением токсичных продуктов распада, высвобождение внутриклеточного калия, происходит вазодилатация, гиперемия, отек тканей и развитие болевого синдрома [4, 5]. Все это приводит к миграции лейкоцитарных клеток в зону повреждения для предотвращения инфекции [3]. На втором этапе развиваются пролиферативные процессы, ведущие к образованию грануляционной ткани. Появляющиеся фибробласты начинают синтезировать широкий спектр молекул внеклеточного матрикса, восстанавливая структуру и функцию кожи в области раневого дефекта, при этом образуются новые кровеносные сосуды для восстановления кровообращения [5].

Восстановление поврежденных тканей в ране приводит к формированию рубца. Если затягивание раны происходит первичным натяжением, то формируются, как правило, косметически тонкие и невидимые рубцы, однако другие могут трансформироваться в грубые растянутые, вдавленные, гипертрофические и келоидные, что связано с чрезмерной экспрессией молекул внеклеточного матрикса во время пролиферативной и ремоделирующей фаз заживления ран [6—8]. В отличие от гипертрофических рубцов, келоидные рубцы прогрессируют за пределы исходной раны и со временем не регрессируют [9].

Одним из путей решения проблем инфицирования и длительной регенерации раневых дефектов является применение органических кислот, к числу которых относятся ацетиламиногексановая кислота (ацексамовая кислота), а также ее производные, широко использующиеся в качестве действующих веществ лекарственных препаратов.

Известно, что у крыс под влиянием ацексамовой кислоты обнаруживаются признаки высокой синтетической активности клеток фибробластического ряда. Заживление ран кожи в условиях применения ацексамовой кислоты было более благоприятным по сравнению с контролем [9—11].

Представляется перспективным синтез новых производных ацексамовой кислоты с целью создания эффективных лекарственных средств, поскольку ацексамовая кислота и ее производные обладают широким спектром биохимической активности в организме человека [12]. Таким образом, анализ отечественной и зарубежной научной литературы свидетельствует о высоком потенциале солей ацексамовой кислоты как стимуляторов регенерации, что обусловливает актуальность разработки на их основе перспективных лекарственных средств.

Материал и методы

Экспериментальные исследования, одобренные локальным этическим комитетом Медицинского института Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева (протокол № 8, октябрь 2018 г.), выполнены на беспородных 30 белых крысах обоего пола (питомник «Андреевка» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России) весом 180—220 г, разделенных на 3 группы по 10 особей в каждой: контроль, группа сравнения, опытная группа.

В качестве изучаемого соединения использовалась мягкая лекарственная форма (линимент) серебряной соли N-ацетил-6-аминогексановой кислоты с лабораторным шифром ЛХТ 7-17, разработанная в отделе химии, технологии синтетических лекарственных средств и аналитического контроля АО «ВНЦ БАВ» (г. Старая Купавна, Россия). Перед началом эксперимента животных наркотизировали внутривенным введением золетила в дозе 50 мг/кг. Плоскую неинфицированную рану формировали одноразовым скальпелем по трафарету, представляющему собой вырезанный в стерильной одноразовой пеленке квадрат (S=400 мм²). Иссекали кожу с подкожной жировой клетчаткой до фасции спины, рану оставляли открытой до полного рубцевания (рис. 1).

Крысам опытной группы наносили исследуемую мазь на 2-е, 6-е и 12-е сутки после формирования патологии. Животным группы контроля наносили 0,9% раствор хлорида натрия, крысы группы сравнения получали препарат «Пантенол» (флакон 130 мл, ООО «АЛТЕЯ»). Ежедневно измеряли площадь раны электронным штангенциркулем и вычисляли процент сокращения раневого дефекта. В каждой группе на 3-и, 7-е, 14-е и 21-е сутки эксперимента животных выводили из эксперимента, вырезали раневой дефект в радиусе 1,0—1,5 см от краев раны на всю ее глубину с последующей фиксацией в нейтральном забуференном 10% растворе формалина в течение 48 ч. Из полученного биоматериала готовили парафиновые блоки в автоматическом режиме.

В качестве маркеров клеточной пролиферации и регенерации, а также васкуляризации использовали Ki-67 и CD34. Анализ иммуногистохимической реакции производили в 6 полях зрения при увеличении 400. В целях оценки иммуногистохимической реакции на Ki-67 определяли индекс пролиферации, для чего подсчитывали количество позитивно окрашенных ядер фибробластов в полях зрения, определяли их отношение к общему числу ядер в исследуемых областях и полученное отношение выражали в процентах.

Статистическую обработку полученных данных проводили методами вариационной статистики, использовали параметрический критерий Ньюмена-Кейлса и непараметрический точный критерий Фишера. Нормальность распределения определяли с помощью одномерного дисперсионного анализа (ANOVA). Кривую выживаемости анализировали с помощью критерия Гехана с поправкойЙейтса. Использовали пакет программ по статистике SPSS (версия 16.0).

Результаты и обсуждение

При изучении динамики заживления плоской раны нами было установлено, что нанесение исследуемого вещества ЛХТ 7-17 приводит к сокращению сроков закрытия раневого дефекта, при этом сроки заживления сопоставимы со сроками заживления при использовании препарата сравнения «Пантенол» (рис. 2). Следует отметить, что размеры раны на 7-е сутки эксперимента в исследуемых группах сокращаются более чем в 2 раза, а площадь и форма рубца, образующегося первичным натяжением, к 15-м суткам имеет хороший косметический эффект.

В контрольной группе животных в 1-е сутки эксперимента морфологическая картина раневого дефекта характеризовалась наличием выраженного некротического процесса, полнокровия сосудов и стаза эритроцитов в капиллярах. На 3-и сутки отмечался выраженный отек с увеличением количества лейкоцитов и макрофагов. На 7-е сутки происходило формирование молодой грануляционной ткани, содержащей фибробласты и тучные клетки, однако у некоторых животных сохранялась лимфогистиоцитарная инфильтрация с небольшими участками некроза. К 14-м суткам рана полностью очищалась от некротических масс, замещалась молодой грануляционной тканью, содержащей фибробласты, продуцирующие коллагеновые волокна. К 21-м суткам у 70% животных кожный дефект замещался рубцовой тканью на фоне слабой краевой эпителизации. У 30% крыс сохранялись явления воспаления, в среднем к 28-м суткам происходило заживление раны вторичным натяжением.

Результаты нанесения мягкой лекарственной формы ЛХТ-7-17 и препарата сравнения на 3-и сутки эксперимента отличались от результатов, полученных в группе контроля, умеренным воспалительным процессом и меньшим объемом очагов некроза; отмечалась выраженная сосудистая реакция, в области дна раны появлялись очаги грануляционной ткани. К 7-м суткам рана полностью закрылась грануляционной тканью с явлениями эпителизации. Рана полностью очищена от некротических тканей и выполнена многослойным ороговевающим эпителием, что в совокупности свидетельствует о закрытии раны первичным натяжением за счет реституции.

В дерме наблюдается множество капилляров (до 50 в поле зрения), при этом хорошо заметно накопление действующего вещества линимента, содержащего ЛХТ-7-17, в перикапиллярной зоне в виде черных точек и гранул (рис. 3).

При изучении этапов закрытия раны использовали показатель Ki-67 — маркер клеточной пролиферации и регенерации. В экспериментах показано, что на 3-и сутки экспрессия Ki-67 была максимальной у животных, получавших ЛХТ-7-17, как в самом эпителии, так и строме и составляла 10 и 50% соответственно (р=0,01 при сравнении с контролем). Это свидетельствует об увеличении количества клеток, готовящихся к делению и запуску процессов пролиферации и регенерации уже на ранних стадиях заживления раны. У животных контрольной группы данный показатель увеличивается лишь к 7-м суткам до 20 и 65% соответственно (рис. 4), статистически значимо превосходя значения, полученные для крыс опытной серии (р=0,001 при сравнении с опытной серией).

Для оценки роста и плотности кровеносных сосудов был использован маркер CD34. На рис. 5 показано, что экспрессия CD34 возрастала на 3-и сутки у животных, получавших ЛХТ 7-17, в среднем до 35% позитивно окрашенных клеток по сравнению с группой контроля (в среднем 18%; р=0,001). Это доказывает более раннее образование в опытной группе микрососудистого русла, необходимого для формирования грануляционной ткани (см. рис. 4). Эффект местного применения ЛХТ-7-17 сопоставим с таковым препарата сравнения на всех этапах регистрации экспрессии маркера неоангиогенеза.

Заключение

Местное применение мягкой лекарственной формы серебряной соли N-ацетил-6-аминогексановой кислоты (ЛХТ-7-17) приводит к ускорению пролиферативно-регенерационных процессов в плоской ране, активации васкуляризации раны, снижению активности воспалительного процесса, формированию рубца первичным натяжением и является перспективным веществом с регенеративной активностью в отношении хирургических ран.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.