Рак легкого занимает лидирующие позиции в структуре мировой онкологической заболеваемости и смертности [1], характеризуется устойчивостью к проводимым традиционным методам лечения (химио- и лучевой терапии), что связывают с наличием в опухоли ключевого пула клеток — раковых стволовых клеток (РСК) [2]. Химиорезистентность и радиорезистентность опухоли, устойчивость к апоптозу, опухолевая прогрессия, рецидивы после лечения и метастазирование обусловлены биологическими свойствами этой группы клеток [3]. Методы терапии, направленные на РСК и их ниши, являются предметом, требующим детального исследования. Новые данные о возможности фотодинамической терапии на РСК и их ниши с использованием фотосенсибилизаторов на основе поликатионных производных синтетического бактериохлорина, опубликованные в наших работах с соавторами, открывают новые горизонты в терапии рака легкого [4].

Особую актуальность приобретают вопросы, связанные с канцерогенезом рака легкого на фоне перенесенной новой коронавирусной инфекции и влиянием вируса на уже имевшиеся неопластические изменения. Воздействие вируса SARS-CoV2 на стволовые клетки ткани легкого и РСК, их нишу в настоящее время остается спорным. В литературе [5] есть утверждения, что коронавирус может стимулировать выход РСК из дормантного состояния и переход в активную фазу цикла с повышением пролиферативной активности, способствуя таким образом активации метастатических ниш и прогрессированию опухоли. Большинство авторов [6] полагают, что одним из путей проникновения вируса SARS-CoV2 в клетки-мишени является его взаимодействие с CD147-рецепторами на поверхности клеток с помощью Spike-протеина. CD147 представляет собой гликопротеин клеточной поверхности, относится к суперсемейству иммуноглобулинов, выявляется на поверхности большинства эпителиальных клеток, в том числе ткани легкого, Т-клеток, на клеточной мембране эндотелия сосудов, поверхности раковых клеток, включая клетки немелкоклеточного рака легкого [7]. При участии CD147 осуществляется сверхэкспрессия матриксных металлопротеиназ и фактора роста эндотелия сосудов в раковых клетках [8], что в дальнейшем приводит к увеличению миграции, пролиферации и ангиогенеза, увеличению устойчивости опухоли к химиотерапии и апоптозу [9, 10]. Многие авторы полагают, что именно через CD147 осуществляется взаимодействие вируса с нормальными стволовыми клетками. Более того, в статье китайских авторов 2024 г. [11] на основе изучения мРНК, РНК и иммуногистохимического анализа CD147, а также белков вируса показано, что CD147 является основным рецептором, посредством которого осуществляется проникновение вируса SARS-CoV2 в клетки легочной ткани. Установлено также, что количество рецепторов CD147 на поверхности клеток в ткани легкого значительно выше, чем количество рецепторов к ангиотензинпревращающему ферменту 2. Наибольшие значения экспрессии CD147 отмечаются в раке легкого по сравнению со злокачественными опухолями других локализаций, а также при COVID-19. Полученные данные являются косвенным подтверждением того, что через CD147 вирус может также взаимодействовать с РСК — триггерами онкогенеза и потенцировать прогрессию рака легкого. Прогрессирование неопластических изменений может быть обусловлено непосредственным воздействием вируса на гликопротеин CD147 и опосредованно за счет дефектов иммунного надзора, вызываемых вирусом SARS-CoV2 [12—14]. В наших работах показано, что у пациентов, перенесших новую коронавирусную инфекцию, персистенция вируса в ткани легкого обнаруживалась в макрофагах, пневмоцитах II типа и эндотелиоцитах с различной частотой и интенсивностью при всех формах поражения, включая тяжелые [15]. Персистенция вируса SARS-CoV-2 в тканях при негативном результате ПЦР-теста в мазках из зева и полости носа в отсутствие клинических симптомов острого инфекционного процесса выступает как фактор, способный создавать и поддерживать благоприятную для прогрессирования неопластических изменений среду хронического воспаления в течение неопределенно длительного времени.

Согласно данным литературы [15—18], в аденокарциноме легкого маркерами РСК могут выступать белки с разнообразными функциями, в частности внутриклеточные маркеры, такие как ALDH1, адгезивные белки (CD44, CD133, EpCAM), ABC-транспортеры, факторы транскрипции (NANOG, OCT4, SOX2).

По данным литературы, ALDH1, CD133 и CD34 экспрессируются в РСК легкого. Однако процессы, связанные с РСК, при онкологических заболеваниях легких после инфицирования SARS-CoV-2 недостаточно изучены.

В большинстве публикаций высокий уровень экспрессии изучаемых маркеров коррелировал с плохим прогнозом и выживаемостью пациентов: увеличение количества ALDH1+ позитивных клеток в немелкоклеточном раке легкого отмечалось при развитии резистентности опухоли к терапии [16]; экспрессия CD133 коррелировала с метастазированием опухоли, резистентностью к терапии и худшей выживаемостью [17]. Роль CD34 связывают с участием в механизмах эпителиально-мезенхимальной трансформации и адгезии — процессах, лежащих в основе метастазирования CD34+ позитивных РСК и прогрессировании опухоли [18, 19]. Влияние SARS-CoV2 на РСК не изучено.

Цель нашей работы — изучить РСК аденокарциномы легкого после перенесенного COVID-19.

Материал и методы

Изучен операционный материал аденокарциномы легкого от пациентов после перенесенной коронавирусной инфекции в анамнезе не менее чем за 3 мес до оперативного вмешательства (основная группа, 12 образцов). В качестве контроля использовался операционный материал аденокарциномы легкого пациентов, не болевших новой коронавирусной инфекцией (группа контроля, 12 наблюдений). Критериями включения в основную группу являлись перенесенная коронавирусная инфекция в анамнезе с положительным результатом ПЦР-тестирования и КТ-исследования за 2020—2023 гг. Критериями включения в контрольную группу являлись наличие аденокарциномы легкого и отсутствие SARS-CoV2 в анамнезе, отрицательные результаты ПЦР-тестирования и в качестве дополнительного критерия — негативные результаты по данным реакций иммуногистохимической идентификации белков вируса в исследуемом материале ткани легкого за 2018—2020 гг. Критериями исключения являлись гранулематозный процесс (туберкулез, саркоидоз) в легких, плоскоклеточный рак. Все пациенты перенесли оперативное вмешательство в объеме атипичной резекции легкого (n=8), сегментэктомии/лобэктомии (n=13) или пульмонэктомии (n=3); стадия процесса определялась согласно критериям Международной классификации стадий злокачественных новообразований TNM (8-е издание, 2017) [20] (табл.1).

Таблица 1. Распределение исследуемого материала в зависимости от стадии процесса

Операционный материал подвергали макроскопическому исследованию: вырезали от 2 до 7 кусочков ткани опухоли в зависимости от размера, расположения узла, характера оперативного вмешательства (атипичная резекция, сегмент-, лоб-, пневмонэктомия) и до 3 фрагментов окружающей ткани легкого. Образцы фиксировали в 10% забуференном формалине и заливали в парафин. По стандартной методике изготавливали парафиновые срезы, окрашивали гематоксилином и эозином [21]. Иммуногистохимическое исследование проводили иммунопероксидазным методом по стандартным методикам [22]. В качестве первичных антител, маркеров РСК, использовали: ALDH1 (Huabio, Polyclonal Rabbit Antibody, разведение 1:200), CD133 (Huabio, Polyclonal Rabbit Antibody, разведение 1:500), CD34 (Huabio, Polyclonal Rabbit Antibody, разведение 1:2000). Использовали вторичные антитела к антимышиным и антикроличьим иммуноглобулинам. Ставили положительные и отрицательные контроли. Оценку результатов реакций проводили путем подсчета соотношения количества клеток опухоли со специфическим окрашиванием ядра и/или цитоплазмы на 500 клеток опухоли, выраженного в процентах. Экспрессию белков вируса изучали в реакциях с антителами к Spike-белку (Gene Tex, SARS-CoV2 Spike Polyclonal Rabbit Antibody, разведение 1:500) и Nucleocapside (Gene Tex, SARS-CoV2 Nucleocapside Polyclonal Rabbit Antibody, разведение 1:500). Ставили положительные и отрицательные контрольные реакции. В качестве позитивного контроля использовали блоки из клеток 293Т со spike-белком и белком нуклеокапсида вируса SARS-CoV-2 (cell pellet block — GeneTex435640, GeneTex435641). Оценку результатов реакций проводили в баллах, соответствующих определенному процентному значению окрашенных клеток: 2 балла — до 20% клеток с позитивным окрашиванием, 4 балла — от 21 до 40%, 6 баллов — от 41% и более окрашенных клеток опухоли и/или сохранной легочной ткани.

Результаты

Гистологическая характеристика исследованных образцов

Образцы изученных аденокарцином легкого как в основной, так и в контрольной группе были сопоставимы и представлены инвазивной аденокарциномой преимущественно немуцинозного строения (муцинозная аденокарцинома в каждой из групп отмечена в 3 случаях). Преобладали аденокарциномы со стелющимся типом роста в сочетании с ацинарным и папиллярным паттернами (8 образцов в основной и 6 в контрольной группах). Преимущественно папиллярное строение опухоли наблюдалось в 3 случаях в основной группе, в 2 — в контрольной. В 1 случае в основной группе и 4 в контрольной опухоль демонстрировала наличие солидного, ацинарного, папиллярного участков строения в различных соотношениях. В большинстве срезов имелись участки интактной перитуморозной ткани легкого. В 3 случаях в участках интактной ткани легкого в образцах от пациентов, перенесших коронавирусную инфекцию, выявлялась очаговая гиперплазия пневмоцитов II типа, в 1 случае — присутствие единичных гигантских клеток, напоминающих таковые при цитопатическом действии вируса. Фокусы плоскоклеточной метаплазии в эпителии мелких бронхов обнаруживались в 2 образцах. Отмечались скопление макрофагов в просветах альвеол, полнокровие мелких ветвей легочной артерии с явлениями сладжа и стаза эритроцитов в некоторых из них, микротромбы, мелкие очажки интерстициального фиброза. Вблизи очагов фиброза наблюдались фокусы аденоматозной гиперплазии. В 1 случае имелись признаки организующейся пневмонии.

Персистенция белков вируса

В образцах ткани пациентов основной группы белки вируса Spike-протеин и Nucleocapside обнаруживались как в клетках аденокарциномы, так и в интактной ткани легкого — в пневмоцитах II типа, макрофагах и эндотелиальных клетках (табл.2). Клетки опухоли демонстрировали позитивное окрашивание цитоплазмы, а в части образцов — и цитоплазмы, и ядра (рис.1, а, б). Отчетливой связи между стадией опухолевого процесса, гистологическим строением и уровнем экспрессии белков вируса в ткани опухоли — интактной ткани легкого не отмечено. Интенсивность и характер окрашивания, а также процент окрашенных клеток опухоли были различными. В 5 случаях обнаруживалось диффузное умеренно интенсивное окрашивание большинства клеток опухоли, в 4 окрашивание было слабым, местами гранулярным, в 3 наблюдениях окрашивались единичные клетки опухоли. При этом количество позитивно окрашенных клеток и интенсивность окрашивания в сохранной ткани легкого также были различными: от интенсивной окраски большинства пневмоцитов в интактной ткани легкого до окрашивания единичных пневмоцитов II типа, единичных эндотелиоцитов и макрофагов.

Таблица 2. Экспрессия (в баллах) Spike-протеина и Nucleocapside SARS-CoV2 в исследованных образцах

Рис. 1. Содержание белков вируса SARS-CoV2, ALDH1 и CD133 в раковых клетках и РСК аденокарциномы легкого.

а — позитивное окрашивание цитоплазмы и ядер раковых клеток, РСК в антителами к Nucleocapside вируса SARS-CoV2; б — позитивное окрашивание цитоплазмы раковых клеток и РСК антителами к Spike-белку вируса SARS-CoV2; в — позитивное окрашивание цитоплазмы РСК антителами к ALDH1; г — позитивное окрашивание цитоплазмы РСК в антителами к CD133.

Иммуногистохимическая реакция, ×1000.

ALDH1+, CD133+ и CD34+ РСК

Образцы аденокарцином пациентов основной группы демонстрировали существенное увеличение количества клеток, экспрессирующих перечисленные выше маркеры стволовости (рис. 1, в, д, рис. 2), по сравнению с образцами аденокарцином от пациентов контрольной группы, не болевших инфекцией SARS-CoV2 (рис. 3, табл. 3).

Рис. 2. Белки вируса SARS-CoV2 Nucleocapside и Spike, и маркеры ALDH1, CD133, CD34 в РСК аденокарциномы легкого у пациента, перенесшего COVID19, стадия pT2 pN1.

а — инвазивная немуцинозная аденокарцинома легкого, участок стелющегося и папиллярного роста; б — позитивное окрашивание цитоплазмы и ядер клеток опухоли, в том числе РСК, клеток эндотелия сосудов антителами к Nucleocapside вируса SARS-CoV2; в — позитивное окрашивание цитоплазмы/ ядер клеток опухоли, в том числе РСК, клеток эндотелия сосудов антителами к Spike-белку вируса SARS-CoV2; г — позитивное окрашивание цитоплазмы РСК в антителами к ALDH1; д — позитивное окрашивание цитоплазмы РСК антителами к CD133; е — позитивное окрашивание цитоплазмы РСК и клеток эндотелия сосудов антителами к CD34.

а — окраска гематоксилином и эозином, б — е — иммуногистохимическая реакция. а, д, е — ×200; б, в — ×1000, г — ×400.

Рис. 3. Маркеры РСК — ALDH1, CD133, CD34 в аденокарциноме легкого стадии pT2 pN1 пациента, не болевшего COVID-19.

а — инвазивная немуцинозная аденокарцинома легкого с участками стелющегося и ацинарного роста; б — отсутствие реакции с антителами к Nucleocapside вируса SARS-CoV2; в — отсутствие реакции с антителами к Spike-белку вируса SARS-CoV2; г — позитивное окрашивание цитоплазмы РСК в реакции с антителами к ALDH1; д — позитивное окрашивание цитоплазмы РСК в реакции с антителами к CD133; е — позитивное окрашивание цитоплазмы РСК, клеток эндотелия сосудов в реакции с антителами к CD34.

а — окраска гематоксилином и эозином, б — е — иммуногистохимическая реакция; а, д, е — ×200; б — г — ×400.

Таблица 3. Экспрессия ALDH1, CD133 и CD34 в аденокарциномах легкого у пациентов основной и контрольной групп

В отдельных фокусах отмечалось позитивное окрашивание клеток опухоли, выстилающих щелевидные пространства, напоминающие стенки вновь образованных мелких сосудов; в просветах части таких структур обнаруживались эритроциты.

При изучении ступенчатых срезов аденокарцином легкого было обнаружено, что не только обычные раковые клетки, но и ALDH1+, CD133+, CD34+ РСК содержали Nucleocapside и Spike-белки вируса SARS-CoV2 (см. рис. 1). Следовательно, можно предположить, что вирус способен взаимодействовать с РСК и изменять их онкологический потенциал.

Особенности у пациентов с наличием метастазов

Установлено увеличение количества РСК у пациентов с метастазами аденокарциномы в лимфатических узлах как в основной, так и в контрольной группах. Так, в реакции с антителами к ALDH1 высокие значения РСК отмечаются у пациентов основной группы с наличием метастазов в лимфатических узлах и достигают максимально 80% позитивно окрашенных клеток по сравнению с пациентами группы контроля с аналогичной стадией опухолевого процесса — максимально 30% позитивно окрашенных клеток. Высокий уровень экспрессии CD133 выявляется в этих же группах пациентов и составляет в основной группе до 80% клеток по сравнению с 20% в группе контроля. Аденокарциномы пациентов со стадией pT4 отличались высоким уровнем экспрессии всех маркеров (около 80%). Очевидно, эти результаты могут отражать значительный метастатический потенциал исследуемых образцов. Опухоли пациентов, переболевших новой коронавирусной инфекцией, с поражением лимфатических узлов и пациентов со стадией, соответствующей pT4, независимо от групповой принадлежности отличались максимальной экспрессией ALDH1, CD133, достигавшей 80% позитивно окрашенных клеток. Образцы аденокарцином пациентов контрольной группы без поражения лимфатических узлов обнаруживали наименьший процент позитивно окрашенных РСК в реакциях с указанными антителами (единичные клетки, не более 5%) по сравнению с пациентами основной группы с аналогичной стадией процесса: до 40% позитивно окрашенных клеток в реакциях с антителами к ALDH1 и CD133.

Экспрессия CD34 была высокой как у пациентов основной группы, так и контрольной при наличии метастазов в лимфатических узлах и отмечалась в среднем в 80% позитивно окрашенных клеток. Увеличение экспрессии CD34 как фактора, участвующего в процессах ангиогенеза и эпителиально-мезенхимального перехода, а следовательно, метастазирования опухолей, по-видимому, отражает метастатический потенциал и способность опухоли к прогрессии. Обнаружение позитивной окраски клеток опухоли, которые выстилают щелевидные пространства, содержащие эритроциты, может служить подтверждением гипотезы о васкулогенезе в опухолевой ткани, когда сами клетки опухоли участвуют в процессах образования сосудов, однако сложность и многофакторность этого явления требуют пристального и целенаправленного изучения.

Обсуждение

Установлено увеличение количества РСК с экспрессией маркеров стволовости ALDH1, CD133 и CD34 в аденокарциноме легкого у пациентов основной группы, перенесших новую коронавирусную инфекцию, по сравнению с контрольной группой пациентов, не болевших COVID-19. При этом количество РСК в основной группе было достоверно выше в 2—4 раза по сравнению с контрольной группой.

Увеличение количества РСК в опухолях у пациентов основной группы может быть связано с проникновением вируса SARS-CoV2 в РСК с последующим увеличением их количества в опухоли за счет выхода РСК из дормантного состояния. Высокий уровень РСК в ткани опухоли у пациентов основной и контрольной групп при наличии метастатического поражения лимфатических узлов может отражать интенсивность процессов эпителиально-мезенхимальной трансформации, а следовательно, и способности опухоли к инвазии и метастазированию.

Обнаружение белков вируса в ткани опухоли и интактной перитуморозной ткани легкого у пациентов основной группы позволяет сделать вывод о возможности длительной персистенции белков SARS-CoV2 и, возможно, самого вируса после перенесенной острой SARS-CoV2-инфекции. Значение обнаруженных белков вируса в клетках рака легкого наиболее вероятно связано с персистенцией вируса в тканях, о чем пишут многие авторы [23, 24] и что было установлено также в наших исследованиях по постковидному миокардиту. Кроме того, установлено, что взаимодействие даже изолированного Spike-протеина с клеткой вызывает идентичные эффекты подобно взаимодействию вируса SARS-CoV2 с клеткой. Отсутствие элиминации вируса может быть обусловлено, с одной стороны, дефектами иммунного надзора, развивающимися при COVID-19, и, как следствие, иммунного дисбаланса при онкологическом заболевании — с другой.

При этом одновременно высокий уровень экспрессии маркеров стволовости в наших исследованиях сочетался с таковым белков вируса в препаратах, представляющих собой последовательные ступенчатые срезы одной и той же опухоли, что позволяет сделать вывод об экспрессии белков вируса как в клетках аденокарциномы, так и в ее РСК. Следовательно, можно предполагать, что белки вируса и, вероятно, сам вирус могут взаимодействовать с РСК и менять их онкологический потенциал. Длительная персистенция белков SARS-CoV2 и самого вируса в клетках, вероятно, способствует прогрессии рака легкого за счет стимуляции РСК и активации прогрессирования рака. Это предположение подтверждается данными литературы [14—16], в которых описано более агрессивное поведение злокачественных опухолей на фоне перенесенной коронавирусной инфекции.

Суммируя полученные результаты и данные литературы, касающиеся инфекции, вызываемой вирусом SARS-CoV2, становится понятно, что результатом инфекционного процесса, запускаемого новой коронавирусной инфекцией, можно назвать появление многочисленных молекулярных факторов с проонкогенным потенциалом, которые оказываются одномоментно задействованными в случае поражения легких. Возникающие в итоге изменения в паренхиме легких также можно охарактеризовать как имеющие онкогенный потенциал: формирование очагов фиброза, возникновение аденоматозной гиперплазии и плоскоклеточной метаплазии, поддержание локальных условий хронического воспаления, — все это требует детального изучения и анализа с тем, чтобы выявить морфологические и молекулярно-биологические особенности возникающих и имевшихся ранее предраковых изменений и аденокарциномы легкого на фоне перенесенного COVID-19. Изучение вируса SARS-COV2 и установление его непосредственной роли как вируса, способного потенцировать возникновение злокачественных заболеваний, требуют длительного времени, наличия комплекса клинико-диагностических данных, позволяющих неопровержимо подтвердить или опровергнуть подобный факт.

Одновременное протекание и взаимное стимулирование двух тяжелейших патологических процессов — рака и SARS-CoV2-инфекции в легких пациентов — вызывают острую необходимость поиска терапевтических подходов, эффективных при лечении указанных состояний и адаптированных к легочной ткани. Одним из таких подходов может быть фотодинамическая терапия (ФДТ) [25], которая давно используется при лечении заболеваний легких [26, 27]. ФДТ (особенно с инновационными поликатионными фотосенсибилизаторами), как показали наши исследования, имеет высокую эффективность при раке легкого за счет гибели раковых клеток путем некроза и апоптоза, разрушения РСК и снижения их митотической и пролиферативной активности, нарушения васкуляризации и стимуляции десмопластической реакции как в самой ткани опухоли, так и в зоне ее инвазивного роста [5, 28].

В то же время ФДТ с использованием анионных и катионных фотосенсибилизаторов эффективна против коронавирусов [29]. В ряде работ [30] достоверно доказана инактивация вирусов SARS-CoV2 при использовании катионных фотосенсибилизаторов, в частности, метиленового синего. Обнаружен очень высокий уровень фотодинамической инактивации коронавирусов при использовании поликатионных фотосенсибилизаторов с большим числом (4—8) катионных заместителей [31, 32]. Эти экспериментальные результаты подтверждены успешными клиническими испытаниями по лечению пациентов с коронавирусным поражением легких [33].

Выводы

1. Установлено увеличение количества РСК с экспрессией маркеров стволовости ALDH1, CD133 и CD34 в аденокарциноме легкого у пациентов, перенесших новую коронавирусную инфекцию.

2. Белки вируса SARS-CoV2 обнаруживаются в ALDH1+, CD133+ CD34+ позитивных РСК, что может быть подтверждением взаимодействия белков вируса и, вероятно, самого вируса с РСК, приводящим к активизации их агрессивности.

3. Увеличение количества ALDH1+, CD133+ CD34+ РСК в опухолевой ткани повышает метастатический потенциал аденокарциномы легкого.

4. Нуклеокапсидный и спайк-белки вируса SARS-CoV2 обнаруживаются в ткани легкого у пациентов, перенесших новую коронавирусную инфекцию как в клетках аденокарциномы, РСК опухоли, так и в пневмоцитах II типа, макрофагах и эндотелиальных клетках, что говорит о длительной персистенции белков вируса и, вероятно, вируса.

Исследования Е.А. Коган, Г. А.Мееровича, И.В. Решетова выполнены при поддержке гранта РНФ № 24-45-00020 и в рамках билатерального Российско-Китайского проекта.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Коган Е.А., Щелокова Е.Е.

Сбор и обработка материала — Щелокова Е.Е., Коган Е.А., Демура Т.А., Ковязина Н.В., Жарков Н.В., Зеленченкова П.И., Мордовина А.И., Решетов И.В.

Статистическая обработка данных — Коган Е.А., Щелокова Е.Е., Ковязина Н.В., Зеленченкова П.И., Кичигина О.Н.

Написание текста — Щелокова Е.Е., Коган Е.А., Меерович Г.А., Ковязина Н.В., Зеленченкова П.И.

Редактирование — Коган Е.А., Щелокова Е.Е., Меерович Г.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.