Экспериментальное обоснование применения нового биоинженерного трансплантата для пластики грыжевых дефектов передней брюшной стенки
Журнал: Оперативная хирургия и клиническая анатомия (Пироговский научный журнал). 2024;8(4‑2): 39‑44
Прочитано: 775 раз
Как цитировать:
В настоящее время грыжи передней брюшной стенки (ПБС) являются одним из наиболее распространенных хирургических заболеваний. Частота этого заболевания среди всего населения земного шара, по данным разных авторов, составляет около 3% [1—3]. Каждый год в мире выполняется более 20 млн грыжесечений.
В современной хирургической практике известно более 300 видов пластики грыжевых ворот ПБС [4, 5]. Ряд из них имеет только историческое значение, а активно используемые в настоящее время методы условно делятся на натяжные и ненатяжные [6]. Выбор способа пластики остается на усмотрение оперирующего хирурга и зачастую зависит от размера грыжевого дефекта и состояния мягких тканей.
«Золотым стандартом» лечения пациентов с наружными грыжами живота является пластика грыжевых ворот при помощи полипропиленовой сетки [7, 8]. Однако этот способ пластики имеет ряд недостатков. Так, по данным литературы, частота развития осложнений, возникающих при использовании сетчатых имплантатов, колеблется от 1 до 24% [5]. Среди них чаще всего встречаются серома, инфильтрат и нагноение раны. Все это может спровоцировать отторжение имплантата [9].
Для сокращения частоты развития осложнений активно совершенствуются техники пластики мягких тканей ПБС и виды применяемых имплантатов. На текущий момент одним из наиболее прогрессивных направлений по созданию новых имплантатов является тканевая инженерия [10, 11]. Данная отрасль, в частности, занимается модификацией биоинженерных трансплантатов, полученных с помощью децеллюляризации.
Децеллюляризация представляет собой процесс, направленный на удаление клеток и их элементов из биологических тканей с сохранением внеклеточного матрикса и трехмерной структуры органа [12]. В абдоминальной хирургии широкой популярностью данный вид трансплантатов пока не пользуется. Это объясняется тем, что трансплантаты, полученные из чужеродного биологического материала, нередко подвергаются отторжению. По мнению большинства авторов, причиной активной иммунной реакции служит некачественный процесс децеллюляризации, обеспечивший неполное удаление клеточного материала, который и является антигенным материалом в теле реципиента [13—15].
Цель исследования: изучить возможность применения нового оригинального биоинженерного трансплантата при пластике грыжевых дефектов передней брюшной стенки.
Исследование проводилось на базе кафедры оперативной хирургии с топографической анатомией и лаборатории экспериментальной хирургии НИИ ЭБМ Воронежского государственного медицинского университета им. Н.Н. Бурденко в период с 2022 по 2023 г. Гистологическая оценка микропрепаратов и исследования крови были выполнены на базе лабораторий клинической больницы «РЖД-Медицина» Воронежа.
В эксперименте были использованы 5 кроликов (самцы породы Белый Великан), массой 6—7 кг, достигших возраста 8—9 мес, и 40 крыс линии Вистар обоих полов, массой 250—300 г и в возрасте 5—6 мес.
Животные содержались в условиях вивария в соответствии с «Правилами по обращению, содержанию, обезболиванию и умерщвлению экспериментальных животных», утвержденными МЗ СССР (1977) и МЗ РСФСР (1977), принципами Европейской конвенции (Страсбург, 1986), требованиями приказов «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию вивариев» от 06.04.1973 №1045-73, а также от 10.10.1983 №1179 МЗ СССР, от 19.06.2003 №267 Минздрава России. Экспериментальных животных выводили из эксперимента при помощи передозировки наркозными препаратами.
Исследование одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО «ВГМУ им. Н.Н. Бурденко» Минздрава России (протокол №7 от 08.11.2021).
В качестве объектов исследования были рассмотрены биотрансплантат, полипропиленовая сетка, микропрепараты, общий анализ крови, температура тела и локальный статус.
Достижение цели исследования выполнялось в 2 этапа:
1. Получение биоинженерного трансплантата по разработанному протоколу децеллюляризации с гистологической оценкой качества децеллюляризации.
2. Выполнение хирургической имплантации полученного трансплантата или простой средней полипропиленовой сетки в сформированный дефект передней брюшной стенки крысы с последующей сравнительной оценкой состояния послеоперационной раны и показателей общего анализа крови (ОАК) на протяжении 180 дней после операции.
При проведении 1-го этапа исследования на аутопсии кролика был выполнен забор с ПБС участка тканей размером 5×5 см, состоящий из фрагментов апоневроза, прямой и косой мышц живота. Каждый из выделенных участков ПБС был разделен на отдельные части со сторонами 2×2 см. Далее выделенный тканевый материал был обработан методом погружной децеллюляризации (патент на изобретение RU 2792542) [15], для чего он в стерильной емкости помещался в орбитальный шейкер и при постоянном перемешивании со скоростью 140 об/мин обрабатывался 2% водным раствором додецилсульфата натрия (SDS) на протяжении 3 ч. Для инактивации внутриклеточных ферментов, выделяющихся при разрушении клеток, к раствору была добавлена этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA).
Контроль качества децеллюляризации проводили с помощью обычного гистологического исследования. Все образцы исследуемой ткани были фиксированы в 10% растворе формалина. Изготовленные срезы были окрашены гематоксилином и эозином, после чего в микропрепаратах при помощи световой микроскопии под большим (×400) увеличением определяли количество клеток и целостность соединительнотканных волокон в поле зрения.
После этого выполняли имплантацию полученных биотрансплантатов или полипропиленовой сетки в ПБС крыс. Лабораторные животные случайным образом были разделены на 3 группы. В 1-й и 2-й экспериментальных группах было по 15 крыс, в 3-й (контрольной) — 10 крыс. Крысам 1-й и 2-й экспериментальных групп в стерильных условиях под общей анестезией при помощи изофлурана сначала по способу M. Suzuhigashi и соавт. [16] было выполнено моделирование грыжевого дефекта размером 10×12 мм, затем сразу же выполнялась пластика дефекта ПБС по способу onlay с использованием в 1-й группе полученного ранее биоинженерного трансплантата, а во 2-й группе — простой средней полипропиленовой сетки размером 10×12 мм. Крысам контрольной группы хирургические вмешательства не выполнялись, они были использованы для сравнения лабораторных показателей ОАК с животными из первых двух экспериментальных групп и оказались в пределах нормы для этой категории лабораторных животных [17].
На протяжении 1-й недели после операции у животных первых двух групп измеряли температуру тела, оценивали состояние раны и ее обработку антисептическим раствором — 5% водным раствором хлоргексидина. С целью оценки показателей ОАК у всех животных брали образцы периферической крови на 3, 7, 14, 30 и 180-е сутки после начала эксперимента.
С целью выбора статистических методов обработки полученного цифрового материала каждую из сравниваемых совокупностей оценивали на ее соответствие закону нормального распределения. В результате все полученные данные были подвергнуты статистической обработке с использованием методов непараметрического анализа. Накопление, корректировку, систематизацию исходной информации и визуализацию полученных результатов проводили в электронных таблицах Microsoft Excel. Статистический анализ осуществляли с использованием IBM SPSS Statistics. Полученные данные, исходя из принадлежности к определенной группе животных, объединяли в вариационные ряды, в которых проводили расчет медианы и межквартильных интервалов по стандартным формулам. Сравнения между группами проводили с использованием критерия Краскела—Уоллиса. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.
При микроскопии фрагментов ПБС до (Me= =156 штук в п/з) и после (Me=10 штук в п/з) децеллюляризации замечено, что после децеллюляризации, как показано на снимках гистологических препаратов, количество клеточных элементов стало на 94% меньше при сохранности целостности волокнистых структур (см. рисунок).
Гистологическое исследование фрагмента апоневроза (окраска гематоксилином и эозином, ув. ×400).
а — до децеллюляризации; б — после обработки 2% раствором додецилсульфата натрия.
При изучении местной реакции организма на имплантацию трансплантата в ПБС отмечено, что послеоперационный период у экспериментальных животных протекал практически одинаково. Умеренные гиперемия и отек сохранялись в течение первых 2—3 дней после операции. Признаков отторжения трансплантатов и других послеоперационных осложнений не наблюдалось. Температура тела крыс на протяжении эксперимента колебалась от 38,9 до 39,2 °C, т.е. была в пределах нормы для этих лабораторных животных.
При исследовании показателей ОАК на 3-й день после операции было выявлено, что у прооперированных животных из 2-й группы количество лимфоцитов (p<0,001) и эозинофилов (p<0,001) было статистически значимо больше, чем в контрольной группе (табл. 1). Количество базофилов (p<0,001) в 1-й и 2-й экспериментальных группах было статистически значимо больше, чем в контрольной группе. Одновременно было установлено, что количество эозинофилов (p<0,001) в 1-й экспериментальной группе было статистически значимо меньше, чем во 2-й экспериментальной группе. Все остальные показатели ОАК (СОЭ, лейкоциты, нейтрофилы) у прооперированных животных были в пределах нормы.
Таблица 1. Значения измеряемых показателей в различных группах животных на 3-й день после операции (Me [Q1; Q3])
| Показатель | Группы наблюдений | p | ||
| контроль | 1-я | 2-я | ||
| Температура тела, °C | 39,0 | 38,9 | 38,8 | 0,448 |
| 38,6; 39,2 | 38,6; 39,4 | 38,3; 39,0 | ||
| СОЭ, мм/ч | 2,45 | 2,6 | 3,2 | 0,414 |
| 2,10; 4,20 | 1,9; 4,2 | 2,8; 4,2 | ||
| Лейкоциты, ·109/л | 15,0 | 15,5 | 15,7 | 0,853 |
| 14,5; 20,0 | 13,7; 16,2 | 14,4; 18,2 | ||
| Нейтрофилы, ·109/л | 3,4 | 3,9 | 4,1 | 0,467 |
| 3,2; 4,4 | 3,3; 4,6 | 3,6; 5,0 | ||
| Лимфоциты, ·109/л | 2,0 | 3,1 | 4,1 | <0,001 pк—1=0,067 pк—2<0,001 p1—2=0,083 |
| 1,6; 2,5 | 2,7; 3,7 | 3,4; 4,7 | ||
| Эозинофилы, ·109/л | 0,1 | 0,2 | 0,5 | <0,001 pк—1=0,684 pк—2<0,001 p1—2=0,003 |
| 0,1; 0,2 | 0,1; 0,4 | 0,4; 0,6 | ||
| Базофилы, ·109/л | 0 | 0,2 | 0,2 | <0,001 pк—1=0,002 pк—2<0,001 p1—2=0,525 |
| 0; 0,1 | 0,2; 0,2 | 0,2; 0,4 | ||
На 7-е сутки после операции количество эозинофилов (p=0,001) и базофилов (p<0,001) в контрольной и 1-й экспериментальной группах было статистически значимо меньше, чем во 2-й экспериментальной группе. Кроме того, количество базофилов (p<0,001) в контрольной группе статистически значимо меньше, чем в 1-й экспериментальной группе (табл. 2).
Таблица 2. Значения измеряемых показателей в различных группах животных на 7-й день после операции (Me [Q1; Q3])
| Показатель | Группы наблюдений | p | ||
| контроль | 1-я | 2-я | ||
| Температура тела, °C | 39,0 | 38,8 | 38,9 | 0,793 |
| 38,6; 39,2 | 38,7; 39,1 | 38,6; 39,2 | ||
| СОЭ, мм/ч | 2,45 | 2,6 | 2,6 | 0,848 |
| 2,10; 4,20 | 2,1; 4,1 | 1,6; 3,6 | ||
| Лейкоциты, ·109/л | 15,0 | 15,4 | 16,4 | 0,615 |
| 14,5; 20,0 | 12,1; 17,7 | 13,9; 19,4 | ||
| Нейтрофилы, ·109/л | 3,4 | 3,9 | 4,0 | 0,448 |
| 3,2; 4,4 | 3,8; 4,2 | 3,7; 5,2 | ||
| Лимфоциты, ·109/л | 2,0 | 2,3 | 2,6 | 0,116 |
| 1,6; 2,5 | 2,2; 3,0 | 2,3; 2,9 | ||
| Эозинофилы, ·109/л | 0,1 | 0,1 | 0,6 | 0,001 pк—1=1,000 pк—2=0,003 p1—2=0,003 |
| 0,1; 0,2 | 0,1; 0,25 | 0,3; 0,8 | ||
| Базофилы, ·109/л | 0 | 0,1 | 0,3 | <0,001 pк—1=0,045 pк—2<0,001 p1—2=0,004 |
| 0; 0,1 | 0,1; 0,2 | 0,2; 0,4 | ||
На 14-й день после операции было выявлено, что у животных 2-й экспериментальной группы количество эозинофилов (p=0,001) и базофилов (p<0,001) было статистически значимо больше, чем в 1-й экспериментальной и контрольной группах (табл. 3).
Таблица 3. Значения измеряемых показателей в различных группах животных на 14-й день после операции (Me [Q1; Q3])
| Показатель | Группы наблюдений | p | ||
| контроль | 1-я | 2-я | ||
| Температура тела, °C | 39,0 | 39,0 | 39,1 | 0,437 |
| 38,6; 39,0 | 38,7; 39,2 | 38,8; 39,4 | ||
| СОЭ, мм/ч | 2,4 | 2,5 | 2,5 | 0,568 |
| 2,0; 2,8 | 0,5; 3,3 | 1,8; 3,3 | ||
| Лейкоциты, ·109/л | 15,6 | 15,9 | 15,9 | 0,904 |
| 14,2; 20,8 | 12,2; 19,9 | 11,7; 18,4 | ||
| Нейтрофилы, ·109/л | 3,4 | 3,6 | 3,6 | 0,629 |
| 3,2; 4,4 | 3,1; 4,9 | 3,5; 4,9 | ||
| Лимфоциты, ·109/л | 2,0 | 2,1 | 2,1 | 0,531 |
| 1,6; 2,5 | 2,0; 2,6 | 2,0; 2,8 | ||
| Эозинофилы, ·109/л | 0,1 | 0,1 | 0,4 | 0,001 pк—1=1,000 pк—2=0,005 p1—2=0,004 |
| 0,1; 0,2 | 0,1; 0,3 | 0,3; 0,5 | ||
| Базофилы, ·109/л | 0 | 0 | 0,2 | <0,001 pк—1=1,000 pк—2<0,001 p1—2<0,001 |
| 0; 0,1 | 0; 0,1 | 0,1; 0,2 | ||
Позднее, начиная с 30-х суток после операции, показатели ОАК у животных двух экспериментальных групп пришли в норму и не имели статистически значимых различий между собой.
Разработанный способ децеллюляризации позволяет получить новый оригинальный биоинженерный трансплантат, который обладает всеми необходимыми свойствами для качественного восстановления дефектов тканей ПБС.
Местных признаков выраженного воспалительного процесса и отторжения биотрансплантата у всех прооперированных животных в выбранные сроки наблюдения (3, 7, 14, 30 и 180-е сутки после операции) не отмечено.
Количество эозинофилов и базофилов в периферической крови у животных, прооперированных с помощью сетки, превышало количество данных показателей у животных из группы прооперированных с помощью биотрансплантата. Результаты проведенного исследования периферической крови у прооперированных животных свидетельствуют, что общая реакция организма при использовании биоинженерного трансплантата выражена слабее, чем при использовании полипропиленовой сетки.
Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют, что биоинженерный трансплантат, полученный из фрагмента ПБС кроликов и децеллюляризированный 2% раствором додецилсульфата натрия, не вызывает заметной общей и местной реакции тканей при имплантации в ПБС крыс и даже по некоторым параметрам превосходит полипропиленовую сетку. Это позволяет рассмотреть возможность применения биоинженерного трансплантата для пластики дефектов ПБС при грыжесечении.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Черных А.В., Магомедрасулова А.А., Шевцов А.Н.
Сбор и обработка материала — Магомедрасулова А.А., Шевцов А.Н., Щербакова В.А., Абасов А.Р., Черкасов А.А.
Статистическая обработка — Шевцов А.Н.
Написание текста — Черных А.В., Шевцов А.Н., Магомедрасулова А.А., Щербакова В.А.
Редактирование — Черных А.В., Магомедрасулова А.А., Пульвер А.Ю.
Participation of authors:
Concept and design of the study — Chernykh A.V., Magomedrasulova A.A., Shevtsov A.N.
Data collection and processing — Magomedrasulova A.A., Shevtsov A.N., Shcherbakova V.A., Abasov A.R., Cherkasov A.A.
Statistical processing of the data — Shevtsov A.N.
Text writing — Chernykh A.V., Shevtsov A.N., Magomedrasulova A.A., Shcherbakova V.A.
Editing — Chernykh A.V., Magomedrasulova A.A., Pulver A.Yu.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов
Литература / References:
Подтверждение e-mail
На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.
Подтверждение e-mail
Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.
