На фоне борьбы за увеличение рождаемости и здоровье поколения остается актуальным вопрос о безопасности применения различных лекарственных препаратов во время беременности. На сегодняшний момент широко разрабатываются лекарственные средства на основе липосом [1—3]. Липосомы представляют собой фосфолипидную наноразмерную транспортную систему (ФЛТС). Вместе с тем, являясь источником фосфатидилхолина, они могут быть задействованы во многих процессах жизнедеятельности организма: строительстве и восстановлении клеточной стенки, гемостазе, передаче гормональных сигналов [4, 5].

По современным представлениям, наносомальная форма такой транспортной системы позволяет преодолевать тканевые барьеры и осуществлять доставку интегрированного в нее лекарственного препарата внутрь клетки, увеличивая эффективность, что позволяет рассматривать ФЛТС как систему направленного транспорта, в том числе при генотерапии [3—8]. Известно, что ФЛТС обладает низкой токсичностью, характеризуется отсутствием аллергенности, тератогенности, эмбриотоксичности и канцерогенности в терапевтических дозировках [6]. Поступая из организма матери к развивающемуся зародышу, частицы ФЛТС «захватываются» и метаболизируются преимущественно клетками висцеральной энтодермы, а после завершения плацентации — клетками плаценты, при этом более эффективно, чем гепатоцитами [8, 9]. Таким образом, широкое использование ФЛТС во время беременности может привести к непреднамеренному увеличению дозы поступления липосом совместно с целевыми лекарственными средствами к плоду и сказаться на эмбриональном развитии.

Цель работы — оценка влияния высоких доз ФЛТС на показатели эмбрионального развития in vivo.

Эксперименты проводились на беременных мышах-самках линии СВА (ГУ НЦБМТ РАМН филиал «Столбовая») начальной массой 20—22 г. Животные содержались в стандартных лабораторных условиях [10], при режиме освещения день/ночь — 14 ч/10 ч, на стандартном гранулированном рационе, со свободным доступом к корму и воде.

Для проведения экспериментов получали животных с датированным сроком беременности. Самок мышей линии СВА ссаживали на ночь с самцами мышей той же линии в соотношении 3:1. На следующее утро у самок определяли беременность по наличию влагалищной пробки. День обнаружения влагалищной пробки считали первым днем беременности [11].

Беременные самки были разделены на четыре группы по 15 особей. Животным 1-й и 2-й групп вводили раствор ФЛТС (производства ГУ НИИ биомедицинской химии РАМН им. Ореховича) в дозах 5,2 и 10,25 г на 1 кг массы животных, что соответствовало дозам, в 10 и 20 раз превышающим терапевтическую с учетом межвидовых коэффициентов пересчета доз [6, 12]. При этом высшая доза соответствовала максимально возможной дозе, при которой сохраняется наноструктура препарата в максимально допустимом для внутрибрюшинного введения объеме [10, 12]. Животным 3-й группы в качестве контроля вводили эквивалентное количество растворителя — изотонический физиологический раствор («Биосинтез», Россия). Животные 4-й группы — интактный контроль для учета спонтанно возникающих мутаций. Введение препаратов осуществляли внутрибрюшинно в объеме 0,3 мл с 1-го по 17-й день беременности, ежедневно в одно и то же время.

Раствор ФЛТС необходимой концентрации готовили непосредственно перед тестированием, при этом в полученном растворе образовывались частицы размером до 40 нм. Размер частиц определяли методом фотонной корреляционной спектроскопии на аппарате Beckman N5.

В 1-й, на 7, 14 и 17-й дни беременности самок взвешивали.

На 17-й день беременности осуществляли эвтаназию животных с соблюдением принципов гуманного обращения с животными и извлекали эмбриоматериал. Определяли коэффициент пре- и постимплантационной смертности [11, 12]. Каждый плод подвергали внешнему осмотру, взвешивали, измеряли краниокаудальный размер. Из каждого помета ²/₃ плодов фиксировались в 96% спирте для изучения состояния скелета по методу Даусона, ¹/₃ плодов из каждого помета фиксировали в жидкости Буэна для дальнейшего исследования патологии внутренних органов по методу Вильсона в модификации ОЭ НИИЭМ РАМН [11, 12].

Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась с использованием t-критерия Стьюдента и точного критерия Фишера при помощи пакета прикладных программ Statistika 8.0.

Курсовое 17-дневное внутрибрюшинное введение ФЛТС в исследуемых дозах не сопровождалось гибелью беременных животных на протяжении всего эксперимента и не влияло на динамику набора массы тела по сравнению с контрольными группами (см. рисунок).

ФЛТС в исследуемых дозировках не влияла на оплодотворяемость, величину коэффициентов пре- и постимплантационной смертности, а также не вызвала тератогенных эффектов. Однако введение ФЛТС в наибольшей дозировке (10,25 г/кг) привело к гипертрофии плодов, что выразилось в достоверном увеличении массы плодов (0,77±0,15 г, в контроле 0,61±0,11 г) и краниокаудального размера (18,4±1,4 мм, в контроле 16,5±1,7 мм) на фоне сохранения численности плодов в помете (5,8±1,2 шт. против 6,0±1,2 шт. соответственно) (см. табл. 1).

При исследовании костной ткани ни в одной из групп не было обнаружено нарушений симметрии развития и проявлений тератогенных эффектов. В группе животных, получавших низкую дозу ФЛТС (5,2 г/кг), количество точек окостенения исследованных отделов скелета плодов не отличалось от такового в контрольной группе, что свидетельствует о сходных темпах развития плодов и, как следствие, об отсутствии общего токсического воздействия на эмбриогенез (табл. 2).

При исследовании мягких тканей в группе животных, получавших низкую дозу ФЛТС (5,2 г/кг), отмечалась сходная с группой контроля тенденция проявления неспецифических патологий внутренних органов. Однако при введении высокой дозы исследуемого препарата ФЛТС (10,25 г/кг) в течение беременности у потомства наблюдалось достоверное увеличение частоты случаев нарушения развития головного мозга и зрительных анализаторов (табл. 3).

Развитие мышиного эмбриона сопровождается схожим с эмбрионом человека морфогенезом, поэтому использование в работе именно данной модели внутриутробного развития позволяет оценить возможное влияние ФЛТС на все периоды эмбриогенеза человека, причем не только непосредственное влияние ксенобиотика на эмбрион, но и косвенное влияние, опосредованное через организм матери.

Полученные нами данные показывают отсутствие влияния ФЛТС в исследованных дозировках на имплантируемость зародыша и эмбриональную смертность, что можно рассматривать как отсутствие общего токсического эффекта от воздействия высоких доз ФЛТС на материнский организм. В том числе на уровень гормонального фона беременного организма.

Анализируя возможные пути проникновения ФЛТС в эмбрион, можно было предположить основные органы-мишени для воздействия ксенобиотика [8, 9]. Так, в процессе эмбрионального развития желточный мешок участвует в гемопоэзе, а клетки энтодермы дают начало клеткам эпителия желудочно-кишечного тракта, легких и воздухоносных путей, клеткам железистого аппарата поджелудочной железы, клеткам печени. Несмотря на это, нами не было обнаружено проявления тератогенных эффектов в этих органах при введении высоких доз ФЛТС. Видимо, отмеченное увеличение случаев возникновения патологий головы на фоне низкой общей токсичности исследуемого объекта связано с интенсификацией эмбриогенеза. Поступая к эмбриону через клетки висцеральной энтодермы и желточный мешок преимущественно в виде свободных молекул фосфатидилхолина [8, 9], частицы ФЛТС обеспечивают тем самым увеличение трофики тканей эмбриона. И как следствие, вызывают рассогласование процессов роста и дифференциации клеток на ранней стадии эмбриогенеза. Отмеченные эффекты согласуются с данными литературы, согласно которым ускорение развития плода на ранних этапах эмбриогенеза характеризуется развитием уродств головы (акрания, отсутствие или недоразвитие глаз, уродства лицевых костей и др.) [14].

Наблюдаемое увеличение числа плодов и интенсивности созревания костной системы при введении высокой дозы ФЛТС также свидетельствует об интенсификации темпов эмбрионального развития, но на более поздних этапах эмбриогенеза, что подтверждает наше предположение.

1. Внутрибрюшинное введение ФЛТС во время беременности (на фоне стандартного сбалансированного рациона) в дозах 5,2 и 10,25 г/кг не снижает частоту имплантации и выживаемость эмбрионов.

2. Внутрибрюшинное введение ФЛТС в дозе 10,25 г/кг вызывает эмбриотоксические эффекты, которые выражаются в развитии характерных патологий головы, гипертрофии плодов и ускорении процессов окостенения скелета.