Среди факторов, осложняющих беременность, важное место занимает плацентарная недостаточность (ПН), частота которой до настоящего времени остается достаточно высокой [1, 2]. Это обосновывает актуальность дальнейшего исследования клеточно-молекулярных механизмов формирования данной акушерской патологии. Развитие П.Н. может быть связано с изменением физико-химических свойств плазматических мембран плаценты.

Мембранные структуры являются той универсальной формой организации клетки, которая обусловливает все ее разнообразные свойства. В плазматических мембранах локализован ряд важнейших механизмов, обеспечивающих жизнедеятельность клетки: активный транспорт, контактные взаимодействия, рецепция различных биоактивных соединений и сигнальных молекул, ответственных за обеспечение внутри- и межклеточной регуляции, и многие другие. Значительное число процессов, контролируемых мембранами, убедительно свидетельствует о возможности нарушения клеточного метаболизма и чувствительности клетки к внешним воздействиям в результате изменения структуры и свойств мембран [3, 4]. Нарушение функциональной активности плазматических мембран плаценты может ухудшать не только метаболизм в самом органе, но и в целом фетоплацентарный обмен, снабжение плода необходимыми для его роста и развития пластическими веществами [5, 6].

В настоящее время данные о биохимическом составе плазматических мембран микроворсин синцитиотрофобласта, обеспечивающего основной обмен между организмами матери и плода, немногочисленны и касаются лишь отдельных компонентов [7—10]. Ранее неизвестные сведения о составе и свойствах мембран плаценты позволяют углубить современные представления о механизмах развития ПН.

Цель работы — изучение белкового и липидного спектров мембран микроворсин синцитиотрофобласта, а также характера мембранотранспортных процессов в плаценте при физиологической беременности и осложненной ПН.

В проспективное исследование включены 46 женщин в возрасте 24—33 лет: у 21 — беременность протекала без осложнений и закончилась своевременными родами (контрольная группа), у 25 — доношенная беременность осложнилась ПН (основная группа), верифицированной после родов. Диагноз П.Н. поставлен на основании комплексного клинико-лабораторного обследования, включающего оценку биофизического профиля плода, результатов кардиотокографии, определения интенсивности фето- и маточно-плацентарного кровотока, сывороточной активности специфических плацентарных изоферментов [11]. В исследование не были включены пациентки с декомпенсированными формами соматических заболеваний, аутоиммунной патологией, многоплодной беременностью, инфекционными заболеваниями, а также не давшие информированное согласие на расширенный алгоритм исследования.

В контрольной группе было 9 первобеременных и первородящих женщин. У 10 повторнобеременных и повторнородящих имели место два и более прерывания беременности по желанию женщины. У 4 пациенток в анамнезе наблюдались воспалительные заболевания органов малого таза. В основной группе было 11 первобеременных и первородящих женщин. У 12 повторнобеременных и повторнородящих имели место два и более прерывания беременности по желанию женщины. У 6 пациенток основной группы в анамнезе отмечались воспалительные заболевания органов малого таза. Женщины контрольной и основной групп были сопоставимы по возрасту, паритету беременности и родов, соматическому и акушерско-гинекологическому анамнезу.

Материалом исследования служила плацента, взятая сразу после родов в сроке 39—40 нед при соблюдении холодового режима (4 °С). Микроскопические исследования выявили в плаценте женщин основной группы наличие небольших участков кальциноза, фиброза, мелкие межворсинчатые кровоизлияния. В плацентах пациенток контрольной группы видимых изменений материнской и плодной поверхностей не обнаружено, но в ряде случаев отмечались небольшие участки фибриноидных масс, умеренная гиповаскуляризация децидуальной ткани.

Для исследования брали участки из центральной части плодной стороны плаценты диаметром 5×5 см. Из гомогенатов этих участков плаценты методом дифференциального ультрацентрифугирования, разработанным для плацентарной ткани, выделяли мембраны микроворсин синцитиотрофобласта [12]. Чистота выделенной фракции подтверждалась определением маркерных ферментов биомембран: 5’-нуклеотидазы (КФ3.1.3.5) и Na⁺, К⁺-АТФазы (КФ3.6.1.3), активность которых в среднем в 10 раз превышала таковую в гомогенатах плаценты. Активность ферментов оценивали с помощью коммерческих наборов фирмы «Randox» (Германия).

Содержание общих фосфолипидов, составляющих основной липидный компонент мембран микроворсин, и холестерина определяли с помощью наборов вышеуказанной фирмы на анализаторе Sapphire 400 (Япония). Фракционирование фосфолипидов осуществляли хроматографией в системе хлороформ—метанол—вода на пластинах с закрепленным слоем силикагеля [13]. Фосфолипиды идентифицировали с помощью стандартных свидетелей («Sigma», США) и оценивали их количество во фракциях денситометрически (Camag TLC Scanner, Швейцария).

Мембранные белки после последовательной солюбилизации детергентами тритоном Х-100 и додецилсульфатом натрия разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле (приборы Protein I EF Cell и Protein II Xi Multi-Cell, «Bio-Rad», США). Количественную оценку электрофореграмм после окрашивания кумасси бриллиантовым голубым R-250 проводили на денситометре Camag TLC Scanner II (Швейцария) с интегратором фирмы «Hewlett Packard» (США).

Для суждения о состоянии мембранотранспортных процессов определяли интенсивность продукции белков, регулирующих эти процессы: (аннексины А₂ и А₄, виментин, Na⁺, К⁺-АТФаза). Идентификацию белков после электрофоретического разделения и процедуры трипсинолиза проводили методом времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS) на масс-спектрометре Autoflex II («Bruker», Германия) с использованием программы Mascot MS Search («Matrix Science», Великобритания) и баз данных NCBI и Swiss-Prot.

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием лицензионного пакета программ Statistica (версия 6.0. фирмы «StatSoft. Inc.»). Однородность дисперсий проверяли по критерию Фишера. Достоверность различий между сравниваемыми показателями определяли по t-критерию Стьюдента. Результаты оценивали как статистически значимые при p<0,05.

Полученные данные свидетельствуют о значительных изменениях в биохимическом составе мембран микроворсин плаценты при осложненной беременности по сравнению с физиологическими показателями. Прежде всего это относится к липидному компоненту (см. таблицу; рис. 1).

Уровень общих фосфолипидов в плацентарных мембранах при ПН снижен на 17% на фоне гиперхолистериноза, что сопровождается значительным повышением (на 46%) коэффициента холестерин/фосфолипиды относительно аналогичной величины при неосложненной беременности. Следствием повышения этого коэффициента является изменение таких свойств мембранного бислоя, как увеличение его вязкости, изменение поверхностного потенциала, характера проницаемости и модификация транспортных процессов в плаценте.

Среди отдельных фосфолипидных фракций наиболее сниженным было содержание легкоокисляемых фосфатидилэтаноламина (ФЭ) — в 1,4 раза и фосфатидилинозина (ФИ) — в 1,5 раза. Известно, что ФИ участвует в обеспечении активного транспорта и процессов рецепции [14]. Фосфоинозидная рецепторная система играет важную роль в регуляции действия половых стероидов, и снижение уровня этого фосфолипида будет нарушать реализацию гормональных эффектов. Что касается ФЭ, то, кроме общих функций поддержания структуры и свойств мембран, он влияет на скорость АТФазной реакции, участвуя тем самым в обеспечении энергетического баланса плаценты, который, несомненно, будет нарушаться при уменьшении содержания ФЭ [10].

Количество фосфатидилхолина (ФХ), сфингомиелина (СМ), достаточно насыщенных по жирно-кислотному составу, также снижается при ПН, хотя и в меньшей степени — в среднем на 20%. Важно отметить, что ФХ рассматривается как основной поставщик арахидоновой кислоты плоду [13, 16]. В связи с этим уменьшение его содержания может негативно влиять не только на плацентарный обмен, но и на развитие плода. Снижение количества ФЭ и ФХ в определенной мере связано с угнетением реацилирования лизофосфатидилхолина (ЛФХ), что подтверждается повышением уровня последнего (на 45%). Увеличение содержания ЛФХ усиливает его мембранолитическое действие [16] и приводит к повреждению нативной структуры мембран.

Аналогичная направленность изменения характерна для содержания фосфатидилсерина (ФС) и фосфатидилглицерина (ФГ). Поскольку Ф.С. является весьма кислым компонентом липидного спектра, то повышение его количества (на 21%), по-видимому, нарушает ионное состояние липидной фазы бислоя мембран.

Помимо повреждения фосфолипидного состава, при ПН имеет место значительное изменение белкового компонента мембран микроворсин синцитиотрофобласта. При физиологической беременности содержание мембранных белков плаценты составляет 57,5±3,1 мг на 1 г ткани, из них на долю белков, экстрагированных тритоном Х-100, приходится 35,1±1,71 мг на 1 г ткани, на долю белков, экстрагированных додецилсульфатом натрия, — 22,4±1,3 мг на 1 г ткани. При П.Н. общее количество мембранных белков снижается на 23% (p<0,01) и составляет 44,3±2,6 мг на 1 г ткани: содержание белков, полученных при экстракции тритоном Х-100, равно 29,1 мг на 1 г ткани, при экстракции додецилсульфатом натрия — 15,2 мг на 1 г ткани. Полученные данные свидетельствуют о том, что соотношение между уровнем белков, солюбилизированных разными детергентами, изменяется. Если при нормальной гестации коэффициент отношения между белками первого и второго экстрактов составляет 1,56, то при ПН — 1,91. Это происходит в результате относительного повышения количества белков, извлеченных тритоном Х-100, по сравнению с таковым при солюбилизации додецилсульфатом натрия.

Различия обнаружены и в содержании белков отдельных фракций, а также в электрофоретической (ЭФ) подвижности некоторых из них (рис. 2). Уровень высокомолекулярных белков тритонового экстракта (относительная молекулярная масса 250 кД и выше) с наименьшей ЭФ-подвижностью снижается на 25%, количество белков с наибольшей анодной подвижностью (относительная молекулярная масса 25—30 кД), напротив, в 1,5—2 раза увеличивается по сравнению с контрольными величинами. Кроме того, наблюдается отсутствие одной фракции в зоне белков с молекулярной массой 150—160 кД. Для спектра белков, экстрагированных додецилсульфатом натрия, также имеют место более чем двукратное повышение содержания низкомолекулярных фракций и уменьшение количества стартовых белков на 30%. ЭФ-подвижность одной из фракций увеличивается с 0,12±0,01 (в норме) до 0,15±0,07 (при ПН).

Изменение степени солюбилизации белков различными детергентами, в том числе относительное повышение солюбилизации более легким детергентом тритоном Х-100, свидетельствует о модификации гидрофобных взаимодействий в белок-липидных компонентах мембран. Уменьшение содержания белков в медленно мигрирующих высокомолекулярных фракциях и соответствующее возрастание в «быстрых» фракциях, очевидно, объясняются дезагрегацией белковых ассоциатов мембранных структур. Сдвиги в белковом составе мембран плаценты могут быть вызваны различными причинами, в том числе усилением атакуемости белков пептид-гидролазами, которое имеет место при осложненной беременности [17].

Обнаруженные изменения в содержании основных компонентов мембран, по-видимому, являются молекулярной основой нарушения транспортных функций плаценты при ее недостаточности, особенно активного транспорта, сопряженного с функционированием специфических белков, участвующих в обеспечении этого транспорта. Как показали наши исследования, при ПН уменьшается количество мембраносвязанного фермента Na⁺, К⁺-АТФазы. Na⁺, К⁺-зависимая транспортная система, функционирующая в плазматических мембранах синцитиотрофобласта, зависит от уровня и активности этого фермента. Данная система контролирует значительный объем внутри- и межклеточного перехода различных веществ, прежде всего аминокислот, необходимых плоду для обеспечения трофических процессов [18, 19].

К числу белков, способных влиять на трансмембранные процессы, относится локализованный на поверхности синцитиотрофобласта аннексин А₄ [20], продукция которого в мембранах значительно снижена, что сопровождается нарушением его функций. Для еще одного белка с аналогичным влиянием на клеточный обмен — аннексина А₂ [21], представленного на плазматической мембране, также установлено уменьшение экспрессии. Однонаправленные изменения содержания аннексинов А₂ и А₄ усиливают метаболические повреждения, связанные с проницаемостью плазматических мембран. Нарушение синтеза характерно и для виментина — белка, хотя и не локализованного на мембране, но влияющего на взаимосвязи и взаимодействия различных систем клетки и регулирующего мембранный транспорт [22].

Приведенные данные свидетельствуют о том, что наряду со структурными перестройками в мембранах плаценты изменяется и интенсивность продукции ряда белков, в том числе и ферментов, участвующих в обеспечении трансмембранных реакций. Кроме того, важно отметить, что нарушение состава и свойств мембран, очевидно, может сопровождаться изменением характера рецепции, в частности, чувствительности мембранных рецепторов на уровне узнавания и связывания различных биорегуляторов межклеточных процессов.

Резюмируя полученные результаты, можно заключить, что развитие ПН происходит на фоне глубоких нарушений в белковом и липидном составе мембран микроворсин синцитиотрофобласта, в том числе на фоне снижения продукции белков, регулирующих мембранотранспортные процессы. Выявленные изменения в мембранах плаценты, учитывая их многочисленные функции, могут быть важными звеньями в общей цепи молекулярно-биохимических повреждений при ПН.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Т.П.

Сбор и обработка материала — Г. В., Н.А.

Статистическая обработка данных — Г. В., Н.А.

Написание текста — П.Т., К.И., П.Н.

Редактирование — П.Т.