Одной из ведущих причин высокой пренатальной смертности и инвалидности детей в развитых странах являются хромосомные аномалии (ХА). Наиболее частые патологии — трисомия 21-й хромосомы, которая приводит к синдрому Дауна, трисомия 18-й хромосомы — к синдрому Эдвардса, трисомия 13-й хромосомы, при наличии которой развивается синдром Патау. Частота выявления таких хромосомных патологий в популяции составляет 1:300—1:250 [1]. ХА часто сопровождаются угрозой выкидыша, неоднократными кровотечениями при беременности и преждевременными родами [2]. До недавнего времени наиболее эффективным методом скрининга распространенных ХА плода (синдромов Дауна, Эдвардса и Патау) считали биохимический скрининг в комбинации с ультразвуковым исследованием в первом триместре беременности. Комбинированная оценка риска развития патологии, полученная на основе уровней биохимических маркеров беременности (свободного хорионического гонадотропина человека и плазменного протеина) и величины воротникового пространства в 11—13 недель и 6 дней беременности, а также возрастных характеристик матери позволяет выявить до 80—90% плодов с трисомией 21-й хромосомы с долей ложноположительных результатов около 5% [3].

С развитием молекулярных технологий и открытием присутствия в крови беременных женщин свободно циркулирующих фрагментов ДНК плода стало возможным проводить скрининг на частые анеуплоидии с более высокой точностью — с помощью неинвазивного пренатального тестирования (НИПТ). НИПТ основан на высокопроизводительном секвенировании, позволяет анализировать внеклеточную ДНК (вкДНК) плода и определяет риск наличия анеуплоидий плода с точностью до 99% для трисомии 21-й хромосомы и до 96 и 91% для трисомии 18-й и 13-й хромосом соответственно [4].

Помимо трисомий по 21-й, 18-й и 13-й хромосомам также встречаются аномалии по другим хромосомам и клинически значимые изменения числа копий гена (CNV — copy number variation) (микроделеции и микродупликации), которые вносят значимый вклад в статистику младенческой заболеваемости и смертности. Проведение НИПТ позволяет выявлять эти ХА.

Редкие аутосомные трисомии часто связаны с неблагоприятным акушерским исходом, который различается в зависимости от конкретной хромосомы. Наиболее часто встречающиеся хромосомные анеуплоидии показаны для 7-й, 16-й и 22-й хромосом [5]. Микроделеционные/микродупликационные синдромы являются довольно редким событием и вместе составляют 1—2% всех врожденных аномалий новорожденных. Рождение детей с такими синдромами накладывает тяжелое бремя на семьи этих детей и на общество.

Существует два основных подхода, используемых в технологии НИПТ: таргетное секвенирование — для анализа определенных участков интересующих хромосом и полногеномное секвенирование — для анализа всей исследуемой последовательности ДНК. Некоторые НИПТ, основанные на таргетном секвенировании, помимо трисомий по 21-й, 18-й и 13-й хромосомам позволяют дополнительно выявлять риск патологии по половым хромосомам и некоторым микроделеционным, микродупликационным синдромам. Полногеномный подход позволяет выявить риск в том числе и редких микроструктурных перестроек хромосом [6]. Также появились методы НИПТ, позволяющие оценить риск наличия моногенных синдромов у плода [7].

Частота микроделеционных/микродупликационных синдромов не зависит от возраста беременных женщин и довольно высока — 1:270, что значительно выше распространенности синдрома Дауна у молодых женщин [8]. В литературе показано, что при использовании НИПТ только на частые анеуплоидии в пренатальном скрининге беременных клинически значимые CNV (микроделеции/микродупликации) остаются недиагностированными, и эти нарушения вряд ли будут обнаружены при ультразвуковом исследовании в первом триместре беременности [6, 9].

Использование полногеномного, а не таргетного НИПТ позволяет определять вероятность наличия патологии по всем 22 аутосомам, половым хромосомам, включая клинически значимые CNV, однако в отношении обнаружения микрохромосомных перестроек точность НИПТ значительно ниже [10]. Полногеномный НИПТ позволяет выявлять микроструктурные перестройки размером <10 Мб [11].

В Российской Федерации внедрение полногеномного НИПТ началось в г. Москве. В рамках пилотного проекта согласно приказу Департамента здравоохранения Москвы от 13.03.20 №199 «Об организации проведения неинвазивного пренатального теста в городе Москве» (№199 ДЗМ) всем беременным жительницам Москвы с риском хромосомной патологии 1:101—1:2500 по результатам пренатального скрининга первого триместра предлагается дополнительно пройти НИПТ. Этому обследованию также подлежат пациентки группы высокого риска (1:100 и выше), которые согласились на проведение инвазивной пренатальной диагностики (ИПД). НИПТ проводится также пациенткам по решению городского пренатального консилиума при наличии показаний независимо от показателей индивидуального риска по результатам скрининга первого триместра [12].

Первые результаты пилотного проекта с данными о частоте выявления распространенных анеуплоидий сформулированы в других работах авторов. В настоящей работе приводится информация о выявленных аномалиях редких хромосом, а также о микрохромосомных перестройках — так называемых «случайных находках» при проведении полногеномного НИПТ.

Цель исследования — проанализировать этические и клинические аспекты «случайных находок» при использовании полногеномного НИПТ.

Материал и методы

Пациенты

В период с 1 апреля по 30 сентября 2020 г. проанализирован 5181 образец крови беременных женщин. Проведение НИПТ предусмотрено для женщин, состоящих на учете по беременности в медицинских организациях ДЗМ и являющихся жителями Москвы, с индивидуальным риском развития ХА плода 1:101—1:2500, а также для беременных с высоким риском (1:100 и выше) в случае согласия пациентки на проведение инвазивной диагностики. Взятие крови на НИПТ обычно осуществляется в день проведения ИПД.

Подготовка образцов для секвенирования

Перед забором крови получено письменное информированное добровольное согласие от каждой пациентки, в котором женщина могла отметить, согласна ли она на определение рисков «случайных находок». Для проведения исследования забор крови осуществлялся в специализированные пробирки типа STRECK, обеспечивающие сохранность вкДНК, объемом 10 мл, с нанесенными на них идентификационными номерами пациенток. Транспортировку образцов и хранение пробирок до обработки проводили при температуре 6—37 °C. Отделение плазмы крови и выделение вкДНК (все манипуляции с пробирками, количество и скорость откручивания проводили в соответствии с протоколом производителя пробирок). После центрифугирования бесклеточную плазму крови хранили при температуре –80 °C.

Создание библиотек и секвенирование

Создание библиотек для секвенирования, секвенирование библиотек ДНК и анализ полученных данных проводили в соответствии с протоколом производителя. Оценку распределения по размерам библиотек выполняли с помощью Qiagen QIAxcel. Все экспериментальные этапы подготовки к секвенированию осуществляли в соответствии с оригинальным протоколом BGI NIFTY, одноконцевое секвенирование (SE50) проводили с использованием валидированной для выполнения исследований платформы BGISEQ-500 (производство BGI Group, Китай). Для обсчета результатов секвенирования использовали оригинальное программное обеспечение BGI HALOS NIFTY 2.3.2.1011 (BGI). В отчет включены риски по наиболее частым трисомиям (хромосом 21-й, 18-й и 13-й), и также риски по аномалиям половых хромосом и «случайные находки» по другим хромосомам, включая структурные или микроструктурные перестройки.

Инвазивная пренатальная диагностика и последующий генетический анализ ДНК плода

Для подтверждения положительных результатов НИПТ (с высоким риском хромосомных аномалий плода) женщинам рекомендовано медико-генетическое консультирование для направления на ИПД (преимущественно амниоцентез). Последующий генетический анализ материала плода проводили с помощью цитогенетического исследования, в некоторых случаях дополнительно проводилось молекулярно-генетическое исследование на чипах.

Статистический анализ

Описательные данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха для непрерывных переменных и в процентах для категориальных переменных. Сравнение между группами проводилось с использованием U-критерия Манна—Уитни для непрерывных переменных, а для категориальных переменных — с использованием критерия хи-квадрат (χ²) или точного критерия Фишера. Значения p≤0,05 считались статистически значимыми. Расчеты проводились с использованием пакета для статистической обработки Wizard Ver 1.9.47(275).

Результаты

За период с 01.04.20 по 30.09.20 проанализирован 5181 образец крови беременных женщин — жительниц Москвы. Средний возраст всех пациенток, которые прошли НИПТ, составил 34,4±4,3 года. Средний срок беременности, в котором определены риски хромосомных аномалий, — 14 недель и 1 день±1 неделя и 3 дня. В 53,0% случаев возраст беременных женщин составил 35 лет и старше. Большинство беременностей — спонтанные и одноплодные (96,8 и 98,6% соответственно).

Из 5181 проанализированных образцов крови женщин результаты НИПТ, свидетельствующие о наличии риска хромосомной патологии (далее по тексту — положительный результат НИПТ), получены в 117 случаях. В 94 случаях выявлен положительный результат НИПТ по частым хромосомам, включая половые хромосомы: трисомии 21-й хромосомы (синдром Дауна) — в 50 случаях, трисомии 18-й хромосомы (синдром Эдвардса) — в 17 случаях, в 5 случаях — трисомии 13-й хромосомы (синдром Патау) и аномалии по половым хромосомам — в 22 случаях. В 21 случае выявлены «случайные находки» (табл. 1).

Таблица 1. Выявленные «случайные находки» в результате полногеномного неинвазивного пренатального тестирования и результаты инвазивной пренатальной диагностики

Примечание. НИПТ — неинвазивное пренатальное тестирование; ИПД — инвазивная пренатальная диагностика; ВПР — врожденные пороки развития; ЗРП — задержка развития плода; МПК — маточно-плацентарное кровобращение; ФПК — фетоплацентарное кровообращение.

Расценены как имеющие низкий риск наличия хромосомных аномалий (далее — отрицательный результат) 4888 образцов крови. В 176 случаях проведение НИПТ не удалось ввиду низкой фетальной фракции (ниже 3,5%).

Из 21 положительного результата НИПТ по наличию редких трисомий и/или микроструктурных хромосомных изменений по результатам ИПД 6 подтверждены. В 12 случаях положительные результаты НИПТ не подтверждены по результатам ИПД (ложноположительные результаты). Отказались от проведения ИПД 3 пациентки. Частота ложноположительных результатов в нашем исследовании составила 0,21% для редких ХА.

Доля образцов, при анализе которых выявлены и подтверждены ИПД «случайные находки», среди всех образцов с положительным подтвержденным ИПД результатом НИПТ составила 8,2% (6 из 73).

Статистически значимых различий по полу плода, по возрасту, массе тела и росту женщин, у которых с помощью НИПТ выявлены «случайные находки», и у женщин, у которых по НИПТ у плода выявлен риск частых анеуплоидий, не было (табл. 2).

Таблица 2. Влияние пола, возраста и роста беременных женщин, а также мужского пола плода на выявление положительного результата неинвазивного пренатального тестирования

Далее представлены наиболее интересные клинические случаи, подтверждающие эффективность применения НИПТ у пациенток из группы риска 1:101—1:2500 по результатам пренатального скрининга первого триместра.

Клинические случаи

Беременная 1, 29 лет. Первая самостоятельная беременность, протекала без патологии. Пренатальный скрининг первого триместра проведен в кабинете пренатальной диагностики (КПД) в сроке 11—12 недель.Копчико-теменной размер (КТР) плода на момент исследования — 54,0 мм (11 нед 6 дней), толщина воротникового пространства (ТВП) — 1,70 мм, частота сердечных сокращений (ЧСС) плода 175 уд/мин.

Пороков и аномалий развития плода на момент исследования не выявлено. Сывороточные маркеры: ХГЧ — 3,017 МоМ, PAPP — A 0,701 МоМ. Рассчитанный индивидуальный риск хромосомной патологии плода (Astraia): трисомия 21 — 1:137; трисомия 18 — 1:20000; трисомия 13 — 1:4644. Согласно приказу №199 ДЗМ, женщине проведен НИПТ в 12—13 недель. Результат: риск хромосомной патологии плода не может быть определен из-за низкой фетальной фракции. Рекомендован повторный анализ. НИПТ выполнен повторно в 16—17 недель беременности. Результат НИПТ: дупликация 2-й хромосомы — dup(2p25.3-p21) (рис. 1). По результатам НИПТ проведена консультация врача-генетика, рекомендовано проведение ИПД (амниоцентез) в 18—19 недель.

Рис. 1. Выявленный риск дупликации 2-й хромосомы по результатам неинвазивного пренатального тестирования.

С целью дообследования беременная обратилась в госпиталь «Мать и дитя», где проведен молекулярно-генетический анализ (aCGH) плода.

Результат:

1. Обнаружена микроделеция короткого плеча (p) 2-й хромосомы с позиции 42 444 до позиции 2 246 200, захватывающая регион 2p25.3. Размер: 2.203.756 п.н. В зону микроделеции попадают ряд OMIM аннотированных генов, связанных с аутосомно-рецессивными заболеваниями. В базах данных ISCA и DECIPHER обнаруженная микроделеция определена как патогенная, связанная с задержкой развития и характерным фенотипом (в том числе врожденные пороки развития).

2. Обнаружена дупликация короткого плеча (p) 2-й хромосомы с позиции 23 08 980 до позиции 36 982 202, захватывающая регион с 2p25.3 по с 2p22.2. Размер: 34.673.222 п.н. В зону дупликации попадают ряд OMIM-аннотированных генов, связанных с аутосомно-рецессивными заболеваниями. В базах данных ISCA и DECIPHER обнаруженная микроделеция определена как патогенная, связанная с задержкой развития и характерным фенотипом (в том числе врожденные пороки развития) (рис. 2).

Рис. 2. Выявлены микроделеция и дупликация короткого плеча 2-й хромосомы по результатам молекулярно-генетического анализа (aCGH).

По результатам инвазивной диагностики проведен пренатальный консилиум. Семья приняла решение о прерывании беременности с учетом выявленной хромосомной патологии плода.

Беременная 2, 26 лет. Вторая самостоятельная беременность, протекала без патологии. В анамнезе одни срочные роды. Пренатальный скрининг первого триместра проводился в КПД в сроке 12—13 недель. КТР на момент исследования — 68,0 мм (12 нед 3 дня), ТВП — 1,70 мм, ЧСС плода 160 уд/мин. Пороки и аномалии развития плода на момент исследования не выявлены. Сывороточные маркеры: ХГЧ 0,934 МоМ, PAPP-A 0,392 МоМ. Риск хромосомной патологии плода (Astraia): трисомия 21 — 1:2248; трисомия 18 — 1:18084; трисомия 13 — 1:20000. По результатам НИПТ выявлен риск трисомии 7-й хромосомы (рис. 3).

Рис. 3. Выявленный риск трисомии 7-й хромосомы по результатам неинвазивного пренатального тестирования.

Результат FISH: При использовании субтеломерных ДНК-зондов на короткое и длинное плечо хромосомы 7 обнаружен мозаицизм: в 4 клетках — 3 копии локусов 7PTEL03, 7QTEL20 хромосомы 7, в 25 клетках — 2 копии локусов 7PTEL03, 7QTEL20 хромосомы 7. Результат цитогенетического исследования: кариотип плода — mos47,XY,+7[3]/46,XY[22]. При цитогенетическом исследовании выявлен хромосомный мозаицизм: в 3 клетках — трисомия хромосомы 7 (рис. 4), в 22 клетках — нормальный мужской кариотип.

Рис. 4. Результат цитогенетического исследования — трисомия 7-й хромосомы.

По результатам инвазивной диагностики проведен пренатальный консилиум. С учетом выявленной патологии плода по итогам пренатального консилиума семья приняла решение о прерывании беременности.

Беременная 3, 35 лет. Вторая самостоятельная беременность, протекала без патологии. В анамнезе одни срочные роды. Пренатальный скрининг первого триместра проведен в КПД в сроке 12—13 недель. КТР на момент исследования составил — 62,5 мм (12 нед 3 дня), ТВП — 3,00 мм, ЧСС плода 157 уд/мин. Пороки и аномалии развития плода на момент исследования не выявлены. Сывороточные маркеры: ХГЧ 1,676 МоМ, PAPP-A 1,306 МоМ. Риск хромосомной патологии плода (Astraia): трисомия 21 — 1:948; трисомия 18 — 1:7539; трисомия 13 — 1:20000.

Результат НИПТ в 15—16 недель: высокий риск дупликации короткого плеча 12-й хромосомы dup(12p13.33-p11.1) (рис. 5). Рекомендована консультация врача-генетика.

Рис. 5. Выявленный риск дупликации короткого плеча 12-й хромосомы по результатам неинвазивного пренатального тестирования.

По результатам НИПТ проведена консультация врача-генетика, рекомендовано выполнение ИПД (амниоцентез). В сроке беременности 16—17 недель проведен амниоцентез и выполнено цитогенетическое исследование. Результат цитогенетического исследования: кариотип плода: 47,ХХ,+mar (рис. 6). При цитогенетическом исследовании выявлена маркерная хромосома у плода женского пола. Маркерная хромосома представлена двумя короткими плечами 12-й хромосомы. В базе данных редких генетических заболеваний Rarechromo патология описана как тетрасомия короткого плеча 12-й хромосомы (синдром Паллистера—Киллиана). Проявлениями данной патологии могут быть лицевые дизморфии, пороки развития сердечно-сосудистой системы, наиболее характерны диафрагмальные дефекты.

Рис. 6. Результат цитогенетического исследования материала плода 47,XX,+mar.

Заключение результата УЗ-исследования второго триместра: беременность 19 недель 0 дней. Низкая плацентация. Порок развития органов грудной клетки: левосторонняя диафрагмальная грыжа. Единственная артерия пуповины.

С учетом выявленной патологии плода по итогам пренатального консилиума семья приняла решение о прерывании беременности.

Обсуждение

Возможности полногеномного НИПТ

Развитие молекулярных технологий во всем мире предоставляет возможность пересмотра существующей системы пренатального обследования беременных женщин. В некоторых развитых и развивающихся странах НИПТ включен в государственные программы пренатального скрининга ввиду доказанной высокой чувствительности и специфичности теста для часто встречающихся анеуплоидий (трисомия 21-й, 18-й и 13-й хромосом) [13, 14].

Выявление клинически значимых CNV при использовании НИПТ имеет особое значение. От 20 до 30% врожденных пороков развития связаны с микроделециями и микродупликациями, которые не выявляются стандартным цитогенетическим исследованием из-за низкой разрешающей способности метода (от 5 млн п.н.) [15]. Однако положительные результаты НИПТ рекомендуется подтверждать другими молекулярно-генетическими или цитогенетическими методами. Для подтверждения клинически значимых CNV, выявленных НИПТ, в настоящее время применяют метод сравнительной геномной гибридизации (aCGH) на материале плода, получаемом при ИПД. Выявление родительских (материнских) клинически значимых CNV случайным образом в ходе проведения НИПТ также поднимает этические вопросы об информировании пациентки о найденных CNV, исследование которых она не планировала [16].

Профессиональные и научные организации, такие как Американский колледж медицинской генетики и геномики (American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG) и Европейское общество генетики человека (The European Society of Human Genetics, ESHG) не рекомендуют рутинное применение НИПТ для выявления микрохромосомных аномалий [16—18].

В то же время большинство мнений экспертов и профессиональных рекомендаций говорят о том, что не следует скрывать информацию о клинически значимых аномалиях плода, выявленных при применении полногеномных методов у беременной женщины [19]. Таким образом, в профессиональном сообществе отсутствует единое мнение по данному вопросу. При исследовании предпочтений беременных женщин показано, что они чаще, чем врачи предпочитают иметь информацию о риске дополнительных хромосомных аномалий, а не только частых анеуплоидий [20].

Ложноположительные и ложноотрицательные результаты НИПТ

Несмотря на высокую точность, возможны ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Известно, что основными биологическими причинами ложных результатов являются фетоплацентарный мозаицизм, злокачественные новообразования матери, феномен исчезающего близнеца [21].

В целом частота ложноположительных результатов в нашем исследовании составила 0,21% для редких ХА, включая клинически значимые CNV. Этот показатель значительно ниже, чем в других публикациях [21]. Представленность патогенных микроструктурных аномалий связана с более низкими положительными прогностическими значениями и большей частотой ложноположительных результатов, вероятно, из-за низкой распространенности микроделеционных и микродупликационных синдромов в общей популяции. Частоты истинно положительных и ложноположительных результатов для редких трисомий и микроструктурных аномалий сопоставимы с результатами подобных исследований. Вероятной причиной ложноположительных результатов НИПТ в данном исследовании являются вариации числа копий у матери, а также плацентарный или материнский мозаицизм [22]. Ложноотрицательные результаты являются крайне редким феноменом для НИПТ и составляют в целом 0,01% [21].

Выводы

1. Вопрос рутинного определения редких анеуплоидий и микрохромосомных аномалий плода или вариаций числа копий генов в клинической практике остается широко дискутируемым и, вероятно, преждевременным. Однако при проведении полногеномного неинвазивного пренатального тестирования следует информировать беременных о его возможностях и с их информированного согласия сообщать о клинически значимых «случайных находках» неинвазивного пренатального тестирования, включающих риски развития редких анеуплоидий и микрохромосомных аномалий плода или вариаций числа копий генов.

2. Целесообразно проведение масштабных клинических и этических исследований с дальнейшим формированием рекомендаций по выдаче случайных находок, выявленных пренатально.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Оленев А.С., Сагайдак О.В., Баранова Е.Е., Кузнецова Е.С.

Сбор и обработка материала — Беленикин М.С., Капланова М.Т., Галактионова А.М., Гнетецкая В.А.

Статистический анализ данных — Сагайдак О.В., Кузнецова Е.С., Галактионова А.М.

Написание текста — Кузнецова Е.С., Сагайдак О.В., Баранова Е.Е.

Редактирование — Оленев А.С., Сонголова Е.Н., Сагайдак О.В., Баранова Е.Е., Галактионова А.М., Гнетецкая В.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.