Введение
Лечебные свойства цинка известны еще со времен Древнего Египта, где цинковую мазь использовали при лечении ран. Парацельс упоминал о медицинском применении цинка в своем труде Liber Mineralicum II. В настоящее время обнаружено более 300 ферментов, содержащих цинк, которые обеспечивают различные физиологические процессы [1]. Высока роль цинка в поддержании репродуктивной функции [2]. Ионы цинка начинают проникать в сперматозоиды на завершающих этапах сперматогенеза. Дополнительно цинк поступает в сперматозоид при эякуляции. Цинк, связанный с липопротеинами, содержится в мембранах сперматозоидов, выполняя мембраностабилизирующую функцию. Цинк принимает участие в антиоксидантной защите организма. В исследовании J. Wu и соавт. in vitro после обработки спермы раствором перекиси водорода отмечено снижение подвижности и жизнеспособности сперматозоидов, а также выявлена фрагментация ДНК сперматозоидов (ФДНКС). Добавление цинка существенно снижало степень выраженности данных изменений, что доказывает его защитный эффект при окислительном стрессе [3].
В исследовании H.A. Guidobaldi и соавт. экспериментальным путем доказана роль цинка в обеспечении хеморепульсии, сделано предположение, что градиент концентрации цинка — важный фактор, который указывает вектор движения сперматозоидов (из зоны большей концентрации цинка в область меньшей), хотя данная гипотеза пока не подтверждена [4].
A.E. Omu и соавт. провели исследование, в которое включены 45 пациентов с астенозооспермией. Пациенты рандомизированы на четыре группы; пациенты первой группы получали препараты цинка, второй — цинк и витамин Е, третьей — цинк, а также витамины Е и С в течение 3 мес, четвертая группа была контрольной. Показано, что терапия цинком и его комбинациями способствовала снижению окислительного стресса, апоптоза сперматозоидов и степени ФДНКС [5].
F. Giacone и соавт. в исследовании с включением 24 пациентов, которые принимали комбинированный препарат, содержащий цинк, D-аспаргиновую кислоту и коэнзим Q10, отметили статистически значимое повышение подвижности сперматозоидов, но не выявили снижения уровня ФДНКС [6].
Информации о влиянии аргинина и глицина на мужскую репродуктивную функцию значительно меньше. Применение аргинина усиливает функцию многих систем человеческого организма, в том числе репродуктивной [7]. Кроме того, аргинин обладает антиоксидантными свойствами [8].
Аргинин способствует синтезу оксида азота, который, в свою очередь, активирует выработку цГМФ, а цГМФ-протеинкиназа G стимулирует подвижность сперматозоидов [9]. S. Hatakeyama и соавт. выявили наличие в сперме трофинин-связывающего пептида GWRQ, состоящего из глицина, триптофана, аргинина и глютаминовой кислоты. Трофинин обеспечивает адгезию апикальных клеток в начальной стадии имплантации человеческого эмбриона. Авторами данного исследования выявлено положительное влияние трофинин-связывающего пептида на подвижность сперматозоидов [10]. Глицин, так же как цинк и аргинин, обладает антиоксидантными свойствами [11, 12].
Для реализации лечебных эффектов цинка, глицина и аргинина разработан комплекс цинка аргинил-глицината дигидрохлорид (ЦАГ) — C8H17N5O4Zn×2HCl, представляющий собой хелатное соединение цинка, аргинина и глицина.
Включение в состав помимо регуляторных пептидов предстательной железы композиции субстанции в виде хелатного соединения ЦАГ (180 мг) позволило разработать препарат простатилен АЦ на основе препарата простатилен и расширить область применения данного лекарственного средства, используя его для лечения больных хроническим абактериальным простатитом с нарушением репродуктивной функции. Доклинические исследования простатилена АЦ продемонстрировали позитивные результаты [13]. Положительные результаты подтверждены и на уровне клинических исследований [14—18].
Цель исследования — оценить эффективность ректального введения ЦАГ в дозе 16 мг на 1 кг массы тела в экспериментальной модели мужской инфертильности (патозооспермии) и сравнить полученные результаты с имеющимися в настоящее время данными клинических исследований.
Материал и методы
В исследовании использованы 30 аутбредных крыс-самцов линии Wistar половозрелого возраста (11 нед). Характеристика экспериментальных групп представлена в таблице. В каждой из 3 групп находились по 10 крыс. В 1-ю группу (фон) включены интактные животные, во 2-ю группу (контроль) — крысы, получавшие свечи без действующего вещества (плацебо), в 3-ю группу (опытную) — животные, которым вводили ЦАГ в дозе 16 мг на 1 кг массы тела в пересчете на цинка аргинил-глицинат (аргинина 8,8 мг на 1 кг массы тела и цинка 3,3 мг на 1 кг массы тела). Дозы рассчитывали с учетом массы тела животных. Вводимый объем не превышал 0,5 мл. Исследуемые вещества вводили ректально, в виде желатиновых свечей, один раз в день ежедневно в течение 5 дней до и 5 дней после введения вещества, моделирующего патологию. Для формирования экспериментального мужского бесплодия в модели патозооспермии крысам-самцам из 2-й и 3-й групп однократно вводили противоопухолевый препарат этопозид (этопозид-тева, Teva, Израиль) внутривенно в максимально переносимой дозе 30 мг на 1 кг массы тела. Изучение степени выраженности патозооспермии в семенниках крыс-самцов проводили через 6 сут после введения цитостатического препарата.
Экспериментальные группы животных и их характеристика
| Группа | Количество животных | Масса тела, г | Средство, моделирующее патозооспермию | Исследуемое вещество |
| 1-я группа (фон) | 10 | 280,20±10,44 | — | — |
| 2-я группа (контроль) | 10 | 258,63±6,87 | Этопозид 30 мг/кг однократно на 6-й день эксперимента | Плацебо |
| 3-я группа (опытная) | 10 | 282,00±12,64 | ЦАГ 16 мг/кг |
Примечание. Данные представлены в виде M±m.
Морфологическая и функциональная оценка состояния сперматозоидов
Через сутки после последнего введения определяли показатели, характеризующие морфофункциональное состояние мужских половых клеток:
— общее количество сперматозоидов (ОКС);
— процент подвижных форм (ППФ);
— процент дегенеративных (патологических) форм (ПДФ).
Для подсчета ОКС гомогенизировали один из двух эпидидимисов в 2 мл физраствора, проводили разведение 1:20 и в 20 больших квадратах камеры Горяева подсчитывали количество сперматозоидов (аналогично лейкоцитам). Итоговый подсчет производили по формуле:
Х=а/2×1 млн (×106), (1)
где: а — число сперматозоидов, подсчитанное в 20 больших квадратах камеры Горяева.
Для подсчета процента ППФ второй эпидидимис надрезали продольно и помещали в достаточное количество (5 мл) теплого (37°C) 0,9% раствора натрия хлорида. Каплю полученной клеточной взвеси помещали на теплое предметное стекло и под микроскопом «Микмед-6» (ОАО «Ломо», увеличение ×600) в 5 полях зрения (не менее 20 клеток в каждом) подсчитывали количество подвижных (ПС) и неподвижных сперматозоидов (НС):
ППФ=ПС/(ПС+НС)×100%. (2)
Количество дегенеративных (ДС) и нормальных форм сперматозоидов (НормС) подсчитывали под микроскопом «Микмед-6» (ОАО «Ломо», увеличение ×600) в 5 полях зрения (не менее 20 клеток в каждом). Затем определяли процент дегенеративных форм сперматозоидов:
ПДФ=ДС/(ДС+НормС)×100%. (3)
Статистическая обработка данных
Обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ Statistica. Для представления количественных показателей в таблицах вычисляли среднее значение (M) и стандартную ошибку среднего (m), на рис. 1, 2 данные представлены как М и стандартное отклонение (σ). Межгрупповое сравнение данных проводили с помощью непараметрического U-критерия Манна—Уитни. Различия считали статистически значимыми при p≤0,05.
Рис. 1. Влияние цинка аргинил-глицината дигидрохлорид на общее количество сперматозоидов (ОКС).
Данные представлены в виде M±σ. # — различия статистически значимые по сравнению с фоном (p≤0,01); * — различия статистически значимые по сравнению с контролем (p≤0,01).
Рис. 2. Влияние цинка аргинил-глицината дигидрохлорид на процент подвижных форм (ППФ) и процент дегенеративных (патологических) форм (ПДФ).
Данные представлены в виде M±σ. # — различия статистически значимые по сравнению с фоном (p≤0,01); * — различия статистически значимые по сравнению с контролем (p≤0,01).
Результаты
Влияние исследуемого вещества на морфофункциональное состояние гонад в условиях модели мужского бесплодия показано на рис. 1, 2. Введение этопозида вызывало статистически значимое снижение общего количества половых клеток, приходящихся на придаток семенника, по сравнению с фоновыми значениями. Их число снижалось до 65,8% от уровня фона, что свидетельствует о том, что в эксперименте воспроизведена модель олигозооспермии.
Общее количество половых клеток, приходящихся на хвостовую часть придатка семенника, в опытной группе животных оказалось статистически значимо в 2 раза выше контрольных значений и практически не отличалось от фона (рис. 1).
Введение этопозида приводило к статистически значимому снижению количества подвижных сперматозоидов. Их число сокращалось до 69,4% от фона, что свидетельствует о том, что в эксперименте воспроизведена модель астенозооспермии. У животных опытной группы ППФ сперматозоидов возрастал и статистически значимо превышал на 64% контрольные значения, при этом статистически значимо не отличаясь от фона (рис. 2).
Введение этопозида приводило к статистически значимому возрастанию на 54% от фоновых значений количества дегенеративных (патологических) форм сперматозоидов. Полученные данные свидетельствуют о том, что в эксперименте воспроизведена модель тератозоосперпии. У животных опытной группы ПДФ статистически значимо снижался в 2 раза по сравнению с контролем.
Таким образом, при изучении эффективности тестируемого соединения в модели патозооспермии (олиго-, астено- и тератозооспермии) установлено, что ЦАГ обладает фармакологической активностью в отношении всех трех видов патоспермии.
Обсуждение
Доклиническое исследование эффективности комплекса ЦАГ в модели патозооспермии (олигозооспермии, астенозооспермии, тератозооспермии) выявило высокую степень выраженности фармакологической активности тестируемого соединения. Различия были статистически значимыми по сравнению с показателями в контрольных группах. Эти данные дополняют полученные ранее сведения о том, что эффективность лекарственного препарата простатилен АЦ доказана в эксперименте у животных и в клинической практике.
В 2012 г. опубликованы результаты исследования эффективности препарата простатилен АЦ в лечении экспериментального простатита у крыс [13]. Препарат в дозе 190 мг на 1 кг массы тела животного вводили через 28 дней от момента инициации воспаления в течение 30 дней в расплавленном виде с помощью атравматического зонда. В данном исследовании продемонстрировано, что противовоспалительный эффект препарата простатилен АЦ превышал лечебный эффект препаратов, содержащих только регуляторные пептиды. Простатилен АЦ оказывал выраженное органотропное противовоспалительное действие, проявляющееся в уменьшении массы простаты, снижении содержания белка в моче, активности кислой фосфатазы, концентрации церулоплазмина и С-реактивного белка в сыворотке крови.
Данные, полученные экспериментально на животных, находятся в согласии с результатами клинических исследований лекарственного препарата простатилен АЦ, проведенных в медицинских учреждениях Санкт-Петербурга и Москвы, доказана его эффективность в условиях реальной клинической практики при ведении пациентов с хроническим простатитом и нарушенной фертильностью [14—16].
Результаты исследования, проведенного О.Б. Жуковым и соавт., продемонстрировали, что дополнительное влияние цинка аргинил-глицината увеличивает число прогрессивно-подвижных форм сперматозоидов и их морфологически нормальных форм, а также способствует выраженному снижению уровня антиспермальных антител и ФДНКС в эякуляте [16]. Прием препарата простатилен АЦ по сравнению с применением комплекса аргинин-цинк в течение 20 дней у пациентов с бесплодием более эффективно улучшал показатели эякулята: увеличивал подвижность сперматозоидов, их морфологию, снижал уровень ФДНКС и уровень окислительного стресса [17]. Через 5 дней после окончания терапии доля прогрессивно-подвижных сперматозоидов увеличилась по сравнению с исходным уровнем на 62% у пациентов с хроническим абактериальным простатитом, получавших простатилен АЦ (p<0,001), и всего на 10% у пациентов, принимавших аргинин-цинк. После приема простатилена АЦ более значительно, чем после приема комплекса аргинин-цинк, уменьшились содержание активных форм кислорода в эякуляте (p<0,001) и степень ФДНКС (p<0,001) [17].
В многоцентровом клиническом исследовании прием простатилена АЦ 98 мужчинами в возрасте 25—45 лет с верифицированным диагнозом хронического абактериального простатита и наличием связанных с ним нарушений репродуктивной функции приводил к уменьшению содержания антиспермальных антител в эякуляте [14]. Полученные результаты имеют большое практическое значение, поскольку избыточное содержание антиспермальных антител в эякуляте является лабораторным признаком аутоиммунного мужского бесплодия. В другом исследовании, проведенном на кафедре урологии ФГБОУ ВО «ПСПбГМУ им. И.П. Павлова» Минздрава России, 25 больных хроническим абактериальным простатитом, обратившихся по поводу замершей на ранних сроках беременности у супруги (половой партнерши), получали простатилен АЦ ежедневно в виде ректальных свечей, на курс 10 свечей, с проведением повторного курса через 20 дней [15]. Результаты исследования позволили сделать вывод, что простатилен АЦ при лечении больных хроническим абактериальным простатитом способствует улучшению фертильных свойств эякулята, нормализации ФДНКС со стойким положительным эффектом в течение 2 мес после курса проведенной терапии и может быть рекомендован для подготовки к процедурам искусственного оплодотворения.
Таким образом, полученные экспериментальные данные, дополняя имеющиеся на сегодняшний день клинические результаты, показывают, что применение препарата простатилен АЦ для коррекции патозооспермии у пациентов с хроническим простатитом является патогенетически обоснованным и клинически эффективным [18].
Заключение
Доклиническое исследование эффективности одного из активных компонентов препарата простатилен АЦ — хелатного комплекса цинка аргинил-глицината дигидрохлорид — в модели патозооспермии, вызванной введением этопозида, выявило фармакологическую активность тестируемого соединения при олигозооспермии, астенозооспермии и тератозооспермии. Фармакологическая активность этого соединения характеризовалась высокой степенью выраженности по сравнению с контролем. Полученные экспериментальные данные соответствуют результатам ранее проведенных клинических исследований лекарственного препарата простатилен АЦ, эффективность которого доказана в условиях реальной клинической практики при лечении больных с хроническим простатитом и нарушенной фертильностью.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Аль-Шукри С.Х., Боровская Т.Г.
Сбор и обработка материала — Боровская Т.Г., Вычужанина А.В., Камалова С.И.
Статистический анализ данных — Боровская Т.Г., Камалова С.И.
Написание текста — Рыбалов М.А.
Редактирование — Боровец С.Ю., Апрятина В.А.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.