Введение

Привычный выкидыш (привычное невынашивание беременности, ПНБ) — одно из самых серьезных и социально значимых осложнений беременности, частота которого, по многочисленным литературным данным, составляет 1—5% [1—5]. В 50% случаев ПНБ связано с идиопатическими причинами [6, 7]. В большинстве этих нарушений современное научное сообщество считает дефекты иммунного ответа материнского организма в ответ на интеграцию материнских и плодовых тканей [8]. Особого внимания при привычном выкидыше заслуживает система врожденного иммунитета, неотъемлемой частью которой являются моноциты/тканевые макрофаги [9]. В ранние сроки беременности, когда преобладают воспалительные реакции, тканевые макрофаги последовательно дифференцируются в две различные субпопуляции — М1 и М2. Эти клетки выполняют различные гомеостатические функции, связанные с тканевой организацией, обеспечением процессов имплантации, волнами инвазии трофобласта, трансформацией тканей и спиральных артерий [10]. Широко известно, что популяция М1-макрофагов характеризуется выработкой провоспалительных цитокинов, М2-популяция — провоспалительных цитокинов, а для благоприятного течения беременности необходимо их равновесие. Переключение (поляризация) популяций макрофагов осуществляется под действием микроокружения в зоне контакта матери и плода и достигается балансом между активацией сигнальных путей STAT1 и STAT3 [11]. Преимущественное вовлечение STAT1, который активируется IFNγ, способствует поляризации моноцитов/макрофагов в сторону фенотипа М1 и активации цитотоксической и провоспалительной функции макрофагов [11, 12]. В противоположность этому сигнальный путь STAT3 приводит к поляризации как М1, так и М2-макрофагов. Сигнальный путь STAT3 активируется такими цитокинами, как LIF, GM-CSF, IL 6. В основном STAT3 активируется IL-6 и по механизму положительной обратной связи увеличивает экспрессию данного цитокина [12]. Сдвиг в сторону М1-моноцитов/макрофагов, вырабатывающих провоспалительные цитокины, значительно увеличивает риск потери беременности и развития осложнений у женщин с привычным выкидышем [13], однако в литературных источниках недостаточно данных о поляризации макрофагов при привычном выкидыше. Кроме того, направленная активация сигнальных путей STAT1 и STAT3 при беременности может стать одним из новых направлений в разработке методов лечения осложнений беременности у пациенток с привычным выкидышем [14].

Цель исследования — оценить особенности экспрессии матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) STAT1 и STAT3 моноцитами у женщин с угрозой прерывания и ПНБ на ранних сроках беременности, а также выявить особенности экспрессии мРНК STAT1 и STAT3 моноцитами женщин с неосложненным течением беременности на ранних сроках под воздействием супернатантов (СН) 24-часовых культур моноцитов беременных с угрозой прерывания беременности и привычным выкидышем.

Материал и методы

В условиях гинекологической клиники Ивановского НИИ МиД им. В.Н. Городкова было проведено обследование 111 женщин с угрозой прерывания беременности и ПНБ в анамнезе в ранние сроки беременности и 54 женщины с неосложненным течением беременности и неотягощенным репродуктивным анамнезом в те же гестационные сроки. Иммунологически обследовано 48 женщин: 25 женщин основной группы и 23 женщины контрольной группы. В исследование были включены пациентки с диагнозом: привычный выкидыш, в анамнезе которых было 2 и более прерывания беременности подряд в сроке до 22 нед перед настоящей беременностью (код по МКБ-X: О26.2) и угрозой прерывания ранних сроков (код по МКБ-X: О20.0), имеющие прогрессирующую одноплодную маточную беременность в I триместре беременности. Из исследования исключали женщин с самопроизвольным выкидышем в ходу, многоплодной беременностью, беременностью, наступившей в результате вспомогательных репродуктивных технологий, анэмбрионией, аномалиями развития женской половой системы, структурными перестройками кариотипов супругов, началом терапии препаратами прогестерона до 5 нед беременности, а также острыми либо обострением хронических инфекционно-воспалительных заболеваний, тяжелой экстрагенитальной патологией в стадии декомпенсации. Все беременные основной группы поступили на стационарное лечение с признаками угрозы прерывания в I триместре, проявляющейся тянущими болями внизу живота и пояснице (98,2%), кровяными выделениями из половых путей (19,8%), отслойкой плодного яйца по УЗИ (27,4%).

Материалом для исследования служила периферическая венозная кровь, взятая до начала лечения в сроке беременности 5—12 нед. Выделение обогащенной популяции мононуклеарных клеток из периферической крови осуществляли стандартным методом скоростного центрифугирования при 1500 оборотах в минуту в течение 40 мин в градиенте плотности фиколл-урографина (d=1,078). Выделенные клетки дважды отмывали в Среде 199, затем инкубировали в пластиковых чашках Петри с целью выделения прилипающей фракции моноцитов. СН культур моноцитов получали путем 24-часового культивирования моноцитов периферической крови в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO₂, инкубируя в среде RPMI1640. По завершении инкубации образцы центрифугировали в течение 5 мин при 10 000 об/мин. Полученную надосадочную жидкость — СН — пулировали, замораживали в стерильных флаконах и хранили при –80 °C. Для количественного определения экспрессии мРНК STAT1 и STAT3 моноцитами периферической венозной крови использовали количественный метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (RT-PCR). Процедуру выделения тотальной РНК из моноцитов периферической венозной крови, а затем выделенную РНК переводили в комплементарную ДНК (кДНК), используя коммерческий набор реагентов «Набор для постановки обратной транскрипции» (ООО «Фрактал Био», Россия). ПЦР-амплификацию в режиме реального времени проводили в соответствии с инструкцией производителя на амплификаторе с оптической насадкой iCycleriQ (BIORAD, USA). Для проведения количественной RT-PCR в реальном времени использовались праймеры и зонды для STAT1, STAT3, а также β2-микроглобулина в качестве гена домашнего хозяйства (ООО «Фрактал Био», Россия). В каждом образце определяли количество копий с использованием стандартной кривой, построенной с помощью программного обеспечения iCycleriQ («BIORAD», USA). Математический анализ полученных данных проводился с помощью лицензионных программ Microsoft Office 2007, Statistica for Windows 13.0. Данные представлялись в виде медианы с указанием 25-го и 75-го перцентилей [Me (Q25%—Q75%)]. Достоверность различий между показателями оценивалась с помощью критериев Манна—Уитни, Колмогорова—Смирнова, Лиллиефорса, и считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Возраст обследованных беременных находился в интервале от 18 до 40 лет, при этом средний возраст женщин с привычным выкидышем был выше, составив 32 (29—36) года, в контрольной группе — 30 (26—34) лет (p=0,0001). Большинство пациенток основной группы были старше 30 лет (74,8%), а в группе контроля процент таких женщин составил 51,5% (ОШ 2,82; 95% ДИ 1,71—4,64; p=0,000). Полученные результаты созвучны с данными многих авторов и подчеркивают, что возраст старше 30 лет является фактором риска развития угрозы прерывания у женщин с ПНБ [15, 16]. Начало половой жизни до 18 лет отмечено у 50% женщин с привычным выкидышем, в группе контроля — у 36,7% (ОШ — 1,71; 95% ДИ 1,08—2,7; p=0,03), среднее количество половых партнеров у беременных исследуемых групп не различались. Наступление первой беременности после начала половой жизни в контрольной группе было позже и составило 5 (3—9) лет, тогда как в основной — через 4 (2—6) лет (p=0,009). Раннее начало половой жизни и вероятное отсутствие контрацепции создают благоприятные условия для инфицирования патогенами, передающимися половым путем, развития воспалительных заболеваний органов малого таза, наступления нежелательной беременности и ее прерывания.

У женщины основной группы чаще в анамнезе был диагностирован острый и/или хронический эндометрит (18,9 и 1,2%, ОШ 18,59; 95% ДИ 5,41—63,83; p=0,0001), эндометриоз (26,1 и 12,9%, ОШ 2,41; 95% ДИ 1,37—4,24; p=0,003). Перечисленные выше гинекологические заболевания сопровождаются изменениями локальных иммунных реакций, проявляющихся в повышенной активации гуморального и клеточного звеньев воспалительного ответа, что способствует нарушению имплантации и плацентации, приводит к прерыванию беременности в первой ее половине, преждевременным родам (ПР), предлежанию плаценты, преждевременному разрыву плодных оболочек, преждевременной отслойке плаценты [17, 18]. Женщины основной группы чаще, по сравнению с женщинами контрольной группы, отмечали в анамнезе инфекции, передающихся половым путем в целом (42,6 и 20,2%, ОШ 2,95; 95% ДИ 1,80—4,85; p=0,0001), а в частности хламидийной (13,9 и 5,9%, ОШ 2,58; 95% ДИ 1,20—5,56; p=0,023), уреаплазменной (26,9 и 13,1%, ОШ 2,45; 95% ДИ 1,39—4,33; p=0,003), микоплазменной инфекций (10,2 и 1,7%, ОШ 6,63; 95% ДИ 2,06—31,34; p=0,001). Оперативных вмешательств на органах малого таза также чаще встречались у беременных с ПНБ по сравнению с женщинами контрольной группы (43,2 и 21,7%, ОШ 2,75; 95% ДИ 1,62—4,65; p=0,0001): по поводу устранения причин бесплодия (10,2 и 1,3%, ОШ 8,47; 95% ДИ 2,24—32,07; p=0,001), по поводу внематочной беременности (9,1 и 0,9%, ОШ — 11,2; 95% ДИ 2,33—53,85; p=0,001). При оценке репродуктивной функции в группе женщин с ПНБ настоящая беременность в среднем была 4 по счету (3—5), тогда как в группе контроля — 2 (1—3) (p=0,0001). Своевременные роды в анамнезе чаще были у пациенток контрольной группы (52,7 и 38,7%, p=0,018), тогда как среднее количество неразвивающихся беременностей и самопроизвольных выкидышей было выше в основной группе и составило 2 (2—3), в контроле — 0 (0—0) (p=0,0001). Беременные основной группы чаще по сравнению с группой контроля указывали на развитие признаков угрозы прерывания ранних сроков и угрожающих ПР в анамнезе: 90,1 против 24,1% (p=0,0001) и 20,7 против 8,7% (p=0,003) соответственно. При анализе экстрагенитальных заболеваний пациенток с привычным выкидышем в анамнезе отмечена частая встречаемость заболеваний щитовидной железы (16,0 и 4,9%, ОШ 3,74; 95% ДИ 1,67—8,39; p=0,002). Также у пациенток основной группы сочетанная соматическая патология встречалась чаще (20,0 и 8,85%, ОШ 2,59; 95% ДИ 1,32—5,06; p=0,008). Патология щитовидной железы значительно повышает риск развития ПР, формирования пороков развития плода, гипертензивных расстройств, задержка роста плода, антенатальной гибели плода [19], а сочетание нескольких экстрагенитальных заболеваний еще раз подчеркивает более старший возраст беременных основной группы, наличие у них хронических воспалительных процессов. Таким образом, нами были установлены факторы риска развития угрозы прерывания ранних сроков у женщин с привычным выкидышем в анамнезе: возраст женщины старше 30 лет; начало половой жизни до 18 лет; наличие в анамнезе инфекций, передающихся половым путем (хламидийной, уреаплазменной, микоплазменной); перенесенный острый и/или хронический эндометрит; эндометриоз; наличие в анамнезе оперативных вмешательств на органах малого таза по поводу бесплодия, внематочной беременности, аномалий развития половых органов; заболевания щитовидной железы, сочетание нескольких соматических заболеваний.

Согласно данным проведенного анализа, выявлено повышение экспрессии мРНК STAT3 в моноцитах у женщин с ПНБ по сравнению с параметрами женщин контрольной группы (p=0,004). Статистически значимых различий по уровню экспрессии мРНК STAT1 в сравниваемых группах не обнаружено (p>0,05). Соотношение мРНК STAT1/STAT3 в моноцитах у женщин обеих групп не различалось (p>0,05) (табл. 1).

Таблица 1. Особенности экспрессии мРНК STAT1 и STAT3 в моноцитах женщин с угрозой прерывания и ПНБ в I триместре

Примечание. p — статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой по критерию Манна—Уитни.

Таким образом, у женщин с угрозой прерывания и ПНБ отмечалось повышение экспрессии мРНК STAT3 в моноцитах по сравнению с параметрами контрольной группой.

При оценке уровня экспрессии мРНК STAT1 и STAT3 в моноцитах женщин с угрозой прерывания и ПНБ в зависимости от исхода настоящей беременности статистически значимых различий между всеми группами не выявлено (p>0,05 во всех случаях). Нами не обнаружено статистически значимой разницы в соотношении мРНК STAT1/STAT3 в моноцитах женщин с ПНБ в зависимости от исхода беременности среди всех сравниваемых групп (p>0,05 во всех случаях) (табл. 2).

Таблица 2. Экспрессия мРНК STAT1 и STAT3 моноцитами беременных с угрозой прерывания и ПНБ в зависимости от исхода беременности

В нашем исследовании была проведена серия экспериментов по оценке влияния СН 24-часовых культур моноцитов женщин с угрозой прерывания ранних сроков и ПНБ на экспрессию мРНК STAT1 и STAT3 моноцитами женщин с неосложненным течением беременности in vitro. Для сравнения использовали СН 24-часовых культур моноцитов женщин с неосложненным течением беременности. В качестве контроля использовали моноциты женщин с физиологической беременностью, культивируемые в среде PRMI-1640 без добавления СН.

Экспрессия мРНК STAT1 в моноцитах женщин с неосложненным течением беременности (ФБ) под влиянием СН и в моноцитах женщин с угрозой прерывания и ПНБ существенно не менялась и не различалась между собой (p>0,05 в обоих случаях). Однако и в группе с неосложненным течением беременности (ФБ), и в группе с угрозой прерывания и ПНБ отмечались достоверно более низкие показатели экспрессии мРНК STAT1 относительно моноцитов женщин с неосложненным течением беременности без стимуляции СН (p=0,014 и p=0,003 соответственно).

При оценке влияния СН 24-часовых культур моноцитов женщин с неосложненным течением беременности (ФБ) и угрозой прерывания и ПНБ на экспрессию мРНК STAT3 в моноцитах женщин с неосложненным течением беременности отмечалось ее подавление в обеих группах (p=0,012 и p=0,007 соответственно) относительно контроля. При этом достоверных различий в экспрессии мРНК STAT3 в моноцитах между группами с добавлением СН 24-часовых культур моноцитов женщин с неосложненным течением беременности и угрозой прерывания с ПНБ выявлено не было (табл. 3).

Таблица 3. Влияние СН 24-часовых культур моноцитов женщин с угрозой прерывания ранних сроков и ПНБ на экспрессию мРНК STAT1 и STAT3 моноцитами женщин с неосложненным течением беременности

Примечание. p — статистически значимые различия между показателями групп М0+СН ФБ и М0+СН ПНБ по сравнению с М0+Среда PRMI-1640 по критерию Манна—Уитни.

Обсуждение

Как уже упоминалось выше, в процессе поляризации моноцитов важную роль играют сигнальные пути STAT и их правильная количественная регуляция [12, 13]. При активации мембран моноцитов под влиянием IFNγ и других сигналов, опосредуемых через Toll-like-рецепторы, осуществляется через сигнальный путь STAT1 [14]. Действие IL-6, IL-10 осуществляется с вовлечением STAT3-сигнального пути, а IL-4 в большей степени с участием STAT6 пути [20], активированный STAT3, в свою очередь, способствует усилению экспрессии IL-6 согласно действию положительной обратной связи [21]. Исходя из вышесказанного следует, что повышение экспрессии STAT3 напрямую коррелирует со степенью воспалительного процесса [22, 23], что и подтверждается данными нашего исследования. У женщин с ПНБ и угрозой прерывания было выявлено повышение экспрессии мРНК STAT3 в моноцитах по сравнению с параметрами контрольной группы. Подобные изменения отмечались и в группе женщин с ПНБ и прерыванием гестации до 22 нед: соотношение STAT1/STAT3 выше по сравнению с группой пациенток, чья беременность завершилась своевременными родами, при этом наиболее низкий показатель был в группе с преждевременными родами, однако статистически значимых различий не выявлено. Можно предположить, что повышенный уровень моноцитов, синтезирующих провоспалительные цитокины, в частности IL-6+ способствует повышению экспрессии мРНК STAT3, и, согласно механизму положительной обратной связи, увеличивает выработку IL-6, что проявляется выраженной воспалительной реакцией. Полученные нами данные согласуются с данными литературы [24, 25]. Таким образом, смещение репрограммирования в сторону моноцитов с провоспалительными свойствами способствует развитию чрезмерной воспалительной реакции и развитию угрозы прерывания.

Оценивая серию экспериментов влияния СН 24-часовых культур моноцитов женщин с угрозой прерывания ранних сроков и ПНБ на экспрессию мРНК STAT1 и STAT3 моноцитами женщин с неосложненным течением беременности in vitro, нами выдвинут ряд предположений. Наличие в СН других цитокинов и хемокинов, вырабатываемых непосредственно моноцитами, способны подавлять экспрессию STAT1 и STAT3, что может свидетельствовать о наличии аутокринной регуляции. С другой стороны, возможно, необходимо воздействие цитокинов и хемокинов, вырабатываемых другими клетками, для усиления экспрессии STAT3-сигнального пути и дифференцировки моноцитов в М2-популяцию. Мы предполагаем, что полученные результаты отражают недостаточное усиление экспрессии STAT3-сигнального пути и, как следствие, поляризацию моноцитов в М2-популяцию у женщин с ПНБ в анамнезе, способствую сниженной воспалительной реакции и неадекватному противовоспалительному ответу. В конечном итоге это приводит к дисбалансу иммунной реакции и вырабатываемых цитокинов и, как следствие, недостаточной инвазии трофобласта, развитию угрозы прерывания, в том числе и у женщин с привычным выкидышем в анамнезе.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Таланова И.Е., Малышкина А.И., Сотникова Н.Ю.

Сбор и обработка материалов — Таланова И.Е., Крошкина Н.В., Григушкина Е.В., Песикин Р.О.

Статистическая обработка — Таланова И.Е., Григушкина Е.В.

Написание текста — Таланова И.Е.

Редактирование — Малышкина А.И., Сотникова Н.Ю.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.