Анализ риска хромосомных аномалий продуктов зачатия при неразвивающейся беременности: вспомогательные репродуктивные технологии или естественное зачатие

Выявление и каталогизация генетических аномалий, несовместимых с эмбриональным развитием, весьма актуальны и являются важными задачами медицинской генетики, направленными на выяснение причин репродуктивных неудач и разработку мероприятий по профилактике потери плода и лечению пациентов.

Хромосомные аномалии обнаруживаются в 60—70% случаев неразвивающейся беременности на ранних сроках (до 12 нед) [1]. Тем не менее мнения ученых [2, 3] о различиях в фактическом риске возникновения патологий кариотипа при потере беременности на ранних сроках в популяции, использующей вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ), и в общей популяции расходятся.

Вспомогательные репродуктивные технологии постепенно становятся неотъемлемой частью современного мира и важным средством, позволяющим бесплодным парам забеременеть и родить здорового ребенка. Во всем мире к началу 2018 г. в результате ВРТ родилось более 8 млн детей [4]. По данным Регистра ВРТ Российской ассоциации репродукции человека (РАРЧ) [5], в 2021 г. в РФ выполнено 161 705 циклов ВРТ, известно о наступлении 46 783 (28,93%) беременностей. Даже в таком небольшом регионе РФ, как Приморский край, за 2019 г. [6] тремя медицинскими организациями проведена 721 процедура экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), из которых наступило 210 (29%) беременностей. Одной из важных причин таких низких показателей наступления беременности является высокий уровень ранних самопроизвольных абортов (СА), частота которых у пациенток после применения ВРТ колеблется в пределах 22—63% [7].

Неудача лечения ВРТ может быть связана со многими факторами, но генетические дефекты, особенно эмбриональные хромосомные аномалии, по мнению J. Qin и соавт. [7], являются одной из основных причин самопроизвольного выкидыша в I триместре беременности.

При учете большого числа детей, зачатых с помощью ВРТ, любая потенциальная проблема для здоровья потомства, вызванная данными методиками, становится актуальной как с медицинский точки зрения, так и с социальной, а аспекты риска и безопасности конкретных технологий приобретают важное значение для будущих поколений. Поэтому цитогенетическое исследование абортивного материала является чрезвычайно ценным диагностическим инструментом, позволяющим установить роль генетических факторов в прекращении развития беременности.

Цель исследования — анализ риска хромосомных аномалий продуктов зачатия при неразвивающейся беременности в случаях спонтанного ее наступления и при применении ВРТ для повышения эффективности генетического консультирования и профилактики репродуктивных потерь.

Для достижения указанной цели представлялось необходимым решить следующие задачи:

1) выявить распространенность и структуру эмбриональных хромосомных аномалий абортивного материала при неразвивающейся беременности вследствие естественного зачатия и после применения ВРТ;

2) оценить связь частоты аномалий кариотипа плода с такими клиническими факторами, как возраст матери и количество предшествующих СА.

Ретроспективно проанализированы результаты цитогенетического исследования абортивного материала, полученного в период с 2018 по 2022 г. медико-генетической консультацией ГБУЗ «Приморский краевой перинатальный центр» (Владивосток, Приморский край). Для цитогенетического анализа использовался прямой метод приготовления препаратов (без предварительного культивирования на питательных средах). Применялось стандартное кариотипирование клеток ворсин хориона. Цитогенетический анализ дифференциально GTG-окрашенных хромосом выполнялся в соответствии с действующими требованиями [8].

Всего в исследование включено 943 случая неразвивающейся беременности. В данном исследовании кариотип 46,XN определен как нормальный, остальные — как аномальные.

Статистический анализ осуществлялся с использованием программ SPSS Statistics и Microsoft Excel. Распределение данных, отличное от нормального, оценивалось с помощью критерия Колмогорова—Смирнова, в связи с чем количественные данные описывались с помощью медианы и квартилей (Me, (Q1—Q3)). Расчет критериев Краскела—Уоллиса и χ² Пирсона использовался для сравнения групп, при этом p<0,05 считалось статистически значимым.

В зависимости от методов зачатия пациентки разделены на две группы. Первая группа включала 853 (90,4%) женщины, зачатие у которых происходило естественным путем, а вторая группа — 90 (9,5%) женщин, применявших методы ВРТ.

Аномалии кариотипа в группе, в которой беременность наступила в результате естественного зачатия, встречались в 540 (63,3%) случаях, а в группе, где применялись ВРТ, — в 55 (61,1%). Относительный риск хромосомных аномалий в группе пациенток, применявших ВРТ, на 3,5% ниже, чем в группе с естественным зачатием (95% доверительный интервал (ДИ) — 0,812—1,147), однако эти данные статистически не подтвердили свою значимость (χ²=0,168; p=0,682).

Наблюдалась различная частота встречаемости типов аномалий кариотипа в исследуемых группах (табл. 1). Среди всех аномалий наиболее высоким в обеих сравниваемых группах являлся уровень анеуплоидии. Наиболее частыми типами числовых аномалий в обеих группах стали аутосомные трисомии. Причем в группе ВРТ выявлен 41 случай анеуплоидии, среди которых 92,7% (38 случаев) составили трисомии (табл. 2).

Таблица 1. Распределение типов аномалий по двум группам пациенток: со спонтанно наступившей беременностью и применявших методы вспомогательных репродуктивных технологий

Примечание. Здесь и в табл. 2—5: ВРТ — вспомогательные репродуктивные технологии.

Таблица 2. Распределение типов анеуплоидий по двум группам пациенток: со спонтанно наступившей беременностью и применявших методы вспомогательных репродуктивных технологий

По сравнению с группой пациенток, достигших естественного зачатия, в группе женщин, использовавших ВРТ, наблюдался более низкий (14,5%) уровень полиплоидий и отсутствовали сегментарные анеуплоидии. В то же время комплексные аномалии чаще (10,9%) диагностировались в группе пациенток, использовавших ВРТ (см. табл. 1).

Большинство хромосомных аномалий касалось 16-й хромосомы и наблюдалось в 116 (25%) случаях в группе пациенток, зачавших естественным путем, и в 11 (20,4%) — в группе пациенток, применявших ВРТ (см. рисунок).

Распределение аномалий по хромосомам по двум группам пациенток.

1 — женщины, у которых беременность наступила спонтанно; 2 — женщины, применявшие для зачатия вспомогательные репродуктивные технологии. По оси абсцисс — номер хромосомы, по которой произошла аномалия, где X — половая хромосома. По оси ординат — количество хромосомных аномалий, выраженное в процентах.

При анализе возраста пациенток, применявших и не применявших ВРТ, с использованием U-критерия Манна—Уитни выявлены статистически значимые различия (p<0,001) (табл. 3).

Таблица 3. Медиана возраста женщин, применявших и не применявших вспомогательные репродуктивные технологии

Все исследуемые случаи разделены в зависимости от возраста матери на две группы. Первую группу составили 649 (68,8%) женщин в возрасте младше 35 лет, вторую — 294 (31,2%) женщины старше 36 лет.

Для группы с естественным зачатием риск аномалий в возрастной категории старше 36 лет выше (73,5%), чем в младшей возрастной группе (58,4%), что подтверждается статистически (отношение шансов (OR)=2,78; 95% ДИ — 2,11—3,67; p<<0,001; p^f<<0,001) (табл. 4).

Таблица 4. Подгрупповой анализ результатов цитогенетического исследования 943 случаев замершей беременности, стратифицированный по возрасту матери

Примечание. Здесь и в табл. 5: OR — отношение шансов; ДИ — доверительный интервал.

В группе пациенток, использовавших для зачатия ВРТ, хромосомные аномалии в старшей возрастной группе также наблюдались чаще (67,6%), чем в группе женщин младше 35 лет (54,7%), что является статистически значимым различием (OR=2,08; 95% ДИ — 1,05—4,15; p=0,0025; p^f=0,0067) (см. табл. 4).

В 116 (12,3%) случаях из исследуемых анамнез пациенток не был известен, поэтому в анализ различий хромосомных аномалий, связанных с клиническими факторами, они не включены. В зависимости от количества предшествующих СА пациентки разделены на две группы: группу 1 составляли 755 (91,2%) женщин, у которых отсутствовали СА в анамнезе, группу 2 — 73 (8,8%) женщины с наличием СА в анамнезе.

В группе с естественным зачатием наблюдались статистически значимые различия между нормальными и аномальными хромосомными группами (p<0,05) в зависимости от наличия СА в анамнезе. В группе без СА в анамнезе в 61,3% случаев отмечались хромосомные аномалии. OR=0,605 указывает на то, что вероятность аномалий в этой группе ниже, чем в группе с предшествующими СА, а 95% ДИ от 0,576 до 0,648 и p<<0,001 подтверждают точность этого соотношения и указывают на высокую статистическую значимость. В группе женщин, имевших в анамнезе СА, при естественном зачатии наблюдалось 72% кариотипов с патологиями. OR, равное 2,56, показывает значительное увеличение риска аномалий по сравнению с группой без СА в анамнезе. 95% ДИ от 1,44 до 4,57 указывает на достаточно широкий диапазон возможных значений OR, а p-значение <<0,001 подтверждает статистическую значимость. Таким образом, при наличии предшествующих СА повышается риск хромосомных аномалий плода при естественном зачатии (p^f<<0,001) (табл. 5).

Таблица 5. Результаты подгруппового анализа распределения хромосомных аномалий в 943 случаях, стратифицированных по количеству предшествующих самопроизвольных абортов и методу зачатия

Примечание. СА — самопроизвольный аборт.

В группе, где пациентки применяли ВРТ для зачатия, при наличии в анамнезе СА патологии кариотипа наблюдались чаще (62,5%), чем при отсутствии предшествующих СА (55,6%). Тем не менее наличие предшествующих СА не показало статистически значимого различия между нормальными и аномальными хромосомными группами (p>0,05, p^f=0,226) (см. табл. 5).

После широкого распространения использования методов ВРТ частота клинической беременности значительно увеличилась, но частота клинически значимых родов осталась на уровне 20—30%. Однако E. Winter и соавт. (2002) утверждают, что риск потери беременности на ранних сроках выше в популяции, получающей ВРТ, чем в общей популяции, и составляет от 12 до 48% [9].

Отбор и имплантация эмбрионов — неотъемлемый этап ВРТ. Тем не менее этот процесс не исключает того, что выбранные эмбрионы могут иметь аномалии кариотипа, особенно если не проводится предымплантационная генетическая диагностика. На поздних стадиях созревания ооцитов неблагоприятным фактором воздействия на геном может стать контролируемая гормональная стимуляция яичников супрафизиологическими дозами эстрадиола, прогестерона и гонадотропинов. На стадиях постзиготного репрограммирования аномалии могут возникнуть из-за того, что культура in vitro не идеально воспроизводит среду in vivo [10]. В результате влияния внешних факторов, стресса или воздействия на эмбрион лабораторной среды увеличивается риск возникновения хромосомных аномалий. Однако некоторые исследователи считают, что различий в частоте хромосомных аберраций при ранних выкидышах между зачатием с помощью ВРТ и естественным зачатием нет [11, 12]. S. Yuan и соавт. (2022) в своем исследовании продемонстрировали, что у плодов, зачатых с помощью ВРТ, наблюдалось небольшое, но статистически незначимое увеличение количества аномальных кариотипов по сравнению с плодами, зачатыми естественным путем [2]. J. Qin и соавт. (2013) провели метаанализ на основании 15 исследований и не обнаружили существенной разницы в частоте хромосомных аномалий между группами беременностей с естественным зачатием и с применением ВРТ [7]. Подобные противоречивые выводы могут быть связаны с разнообразием типов выборок, популяций и т.д.

Результаты настоящего исследования продемонстрировали неоднозначное влияние способа зачатия на конкретные хромосомные аномалии. Более высокая частота хромосомных аномалий наблюдалась в группе естественного зачатия (63,3% — 540 случаев), а в группе ВРТ она составила 61,1% — 55 случаев, что может быть связано с отбором гамет и эмбрионов на стадии бластоцисты с более высокими морфологическими показателями у пациентов, применявших ВРТ. Исследование E. Fragouli и соавт. (2013) показало, что частота эмбриональной анеуплоидии на стадии бластоцисты значительно ниже, чем у эмбрионов на стадии дробления, поскольку некоторые аномальные эмбрионы прекращают свое развитие, так и не достигнув стадии бластоцисты. Тем не менее общая частота хромосомных аномалий оставалась высокой даже на стадии бластоцисты [13]. Соответственно, бластоцисты с более высокими морфологическими показателями не обязательно лишены генетических аномалий, в связи с этим помочь избежать отбора эмбрионов с патологией кариотипа и определить вероятность успешной беременности может предымплантационное генетическое тестирование [14].

На долю 16-й хромосомы приходится большая часть всех хромосомных аномалий среди обеих исследуемых групп, что согласуется с большинством предыдущих исследований [11]. Трисомия 16-й хромосомы является наиболее распространенной аномалией из изолированных геномных мутаций, частота ее встречаемости в нашем исследовании составила 120 случаев (32,4% от количества всех аномальных кариотипов). Дополнительная хромосома при этом типе патологии возникает в результате нерасхождения гомологичных хромосом в первом мейотическом делении, причем доля материнского происхождения значительно выше, чем у других трисомий [15]. Хотя теоретически все хромосомы должны иметь одинаковую скорость нерасхождения, A. Vičić и соавт. (2008) утверждают, что скорость нерасхождения варьируется среди хромосом и, вероятно, 16-я хромосома обладает самым высоким показателем среди остальных аутосом [16].

Анеуплоидии диагностировались чаще остальных патологий в группах как с естественным зачатием, так и с применением ВРТ, однако распределение аномальных хромосом в группах было совершенно различным (см. табл. 1), за исключением разницы в размере выборки двух групп. Так, частота анеуплоидий при использовании ВРТ составила 74,5% (41 случай) от всех хромосомных аномалий этой группы, в то время как при естественном зачатии — 72% (389 случаев) от количества хромосомных аномалий соответствующей группы (см. табл. 1). Указанные результаты подтверждаются данными исследования R. Lathi и соавт. (2004), которые утверждают, что риск анеуплоидии продуктов зачатия значительно повышен при беременности, наступившей с помощью ВРТ. Также авторы обнаружили, что анеуплоидии чаще наблюдались у абортного материала пациентов после применения интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов [17]. На основании этого можно предположить, что закономерность, обнаруженная в нашем исследовании, связана с высоким риском генетических аномалий сперматозоидов у бесплодных мужчин или же с самой методикой ВРТ.

В настоящем исследовании именно аутосомные трисомии явились основной причиной СА в группе ВРТ и составили 92,7% (38 случаев) от количества анеуплоидий (см. табл. 2), что, вероятно, связано с искусственным отбором гамет и эмбрионов, которые могут исключать перенос эмбрионов с некоторыми другими патологиями кариотипа.

В результате проведенного анализа показано, что частота моносомий по половой хромосоме составила 7,3% (3 случая) от количества анеуплоидий при беременностях с использованием ВРТ и 14,4% (56 случаев) — от количества анеуплоидий при естественном зачатии (см. табл. 2). Однако в исследовании M. Martínez и соавт. (2010) частота моносомии половых хромосом значительно выше в случаях применения для зачатия интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов, чем при самопроизвольно наступившей беременности [18].

Полиплоидии чаще наблюдались при естественном зачатии и составляли 20% (108 случаев) от всех хромосомных аномалий после естественного зачатия, при этом полиплоидии после применения ВРТ — только 14,5% (8 случаев), однако эта разница статистически не значима (p=0,427) (см. табл. 1). Тем не менее низкая частота полиплоидии, наблюдаемая после использования ВРТ, может быть обусловлена само́й технологией, которая предотвращает двойное оплодотворение и влечет за собой искусственный отбор сперматозоидов и ооцитов. Это подтверждают и исследования M. Martínez и соавт. (2010) [18] и X. Zhang и соавт. (2020) [19].

Наблюдаемая комплексная аномалия включала аномалии более 2 хромосом или более 2 типов аберраций. Комплексные аномалии встречались чаще в группе, где пациентки использовали ВРТ для зачатия, и составляли 10,9% (6 случаев) от количества аномалий, в то время как в группе пациентов с естественным зачатием они составили 5,4% (29 случаев). Согласно исследованию D. Diego-Alvarez и соавт. (2006), ошибки в мейозе, приводящие к множественной анеуплоидии, чаще возникают в яйцеклетках у женщин старшего возраста [20]. Кроме того, подобные цитогенетические аномалии обнаруживаются в раковых клетках, например в случаях острого лейкоза [19].

Таким образом, взаимосвязь частоты хромосомных аномалий на ранних сроках беременности с методами зачатия требует дальнейшего изучения с помощью соответствующих исследований.

Возраст является значимым фактором риска для генетических аномалий. Женщины, обращающиеся за ВРТ, часто находятся в старшем репродуктивном возрасте, что наблюдалось и в исследуемой нами выборке. Так, медиана возраста женщин, беременности которых наступили в результате естественного зачатия, составила 32 (28—36) года, а у пациенток, которые использовали ВРТ, — 34 (32—38) года (см. табл. 3). Большинство исследователей [21—23] полагают, что старший возраст женщин и субоптимальная вспомогательная репродукция ассоциируются со снижением количества и качества ооцитов. В ооцитах с увеличением возраста женщины снижается скорость оплодотворения из-за митохондриальной дисфункции, которая приводит к окислительному стрессу. Это впоследствии приводит к повреждению ДНК и контрольной точки сборки веретена, к потере сцепления хромосом, укорочению теломер, дисфункции адгезина, что в итоге ведет к эмбриональным хромосомным аномалиям [24]. Более 90% хромосомных дисбалансов имеют материнское происхождение вследствие преждевременного разделения сестринских хроматид в мейозе [25], причем наиболее распространенным способом разделения является обратное [26]. Соответственно, частота хромосомных аномалий значительно увеличивается с возрастом, особенно частота анеуплоидии [13, 27].

В нашем исследовании анализ связи между возрастом и хромосомными аномалиями показал повышение риска хромосомных аномалий с увеличением возраста как в группе беременностей с естественным зачатием, так и в группе ВРТ. Соответственно, эти данные подтверждают предположение о высоком риске цитогенетических аномалий у женщин старшего возраста (см. табл. 4). Представленные результаты подчеркивают важность учета возраста матери как значимого фактора риска цитогенетических аномалий, особенно при планировании беременности. Они также указывают на потенциальное влияние методов ВРТ на риски аномалий, хотя для более точных выводов требуются дополнительные исследования.

При естественном зачатии наблюдалось статистически значимое повышение вероятности выявления патологий кариотипа при наличии СА в анамнезе женщины. Следовательно, отмечалось уменьшение вероятности появления эмбриона с нормальным кариотипом у этих пациенток. В группе пациенток, применявших для зачатия ВРТ, также наблюдалось увеличение риска аномалий кариотипа при наличии предшествующих СА, однако статистическая значимость этих данных не подтвердилась (см. табл. 5). Подобные результаты продемонстрировали в своем исследовании T. Nikitina и соавт. (2020) и предположили, что высокая частота повторных потерь продуктов зачатия с аномальными кариотипами может быть обусловлена предрасположенностью некоторых женщин к образованию эмбрионов с хромосомными аномалиями. Механизм этого неясен, но может включать носительство генетических мутаций у матери и ее возраст, влияющие на предрасположенность к нерасхождению хромосом в оогенезе или раннем эмбриогенезе [28]. Y. Katagiri и соавт. (2020) утверждают, что у пациентов, обращающихся за помощью ВРТ, могут быть предрасположенности к генетическим аномалиям из-за особенностей их репродуктивной системы или генетического фона [29]. Однако N. Ozawa и соавт. (2019) указали, что частота хромосомных аномалий продуктов зачатия у пациенток с привычным невынашиванием снижается с увеличением количества предшествующих СА. На основании этого авторы высказали предположение, что вероятность рождения нормального эмбриона возрастает с увеличением количества предыдущих выкидышей. Это также может указывать на то, что риск СА, вызванного неэмбриональными хромосомными аномалиями, возрастает с увеличением частоты абортов [30]. Тем не менее изучение влияния анамнеза пациенток имеет важное значение для понимания этиологии и механизмов хромосомных изменений, а также для клинической практики при планировании беременности у женщин с некоторым количеством предшествующих СА.

В настоящем исследовании обнаружено, что хромосомные аномалии являются основной причиной неразвивающейся беременности на ранних сроках (до 12 нед). На основании проведенных исследований выявлена более высокая частота хромосомных аномалий в группе естественного зачатия, чем в группе вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), что может быть связано с отбором гамет и эмбрионов у пациентов, которые получают лечение с помощью ВРТ. Однако распределение хромосомных аномалий в этих группах было различным: в группе, в которой пациенты применяли ВРТ, у абортного материала чаще встречались анеуплоидии, в том числе трисомии, и комплексные аномалии, однако реже — полиплоидии, моносомии и сегментарные анеуплоидии. Тем не менее вопрос о том, влияют ли различные методы зачатия на возникновение или частоту некоторых хромосомных аномалий, требует дальнейшего изучения.

Обнаружено, что с увеличением возраста пациенток женского пола возрастает и количество хромосомных аномалий у эмбрионов как при естественном зачатии, так и при применении ВРТ. Продемонстрировано, что при наличии самопроизвольных абортов в анамнезе женщины увеличивается частота выявления патологий кариотипа у эмбриона в обеих исследуемых группах. Однако в группе пациенток, применявших ВРТ для зачатия, данное утверждение статистически не подтвердилось.

Причины развития хромосомных патологий до конца не известны. В настоящее время нет однозначного ответа на вопрос, что является основным механизмом развития заболеваний: используемые вспомогательные репродуктивные технологии или родительские факторы, связанные с их недостаточной фертильностью. Результаты генетического тестирования продуктов зачатия дают ценную информацию для репродуктивного консультирования, либо объясняя причину репродуктивной потери в случаях выявления хромосомных аномалий, либо стимулируя поиск другой этиологии замершей беременности в случаях нормального кариотипа. Беременность, наступившая с использованием ВРТ, относится к группе высокого риска, а сам метод некоторые авторы называют «методом отчаяния». В связи с этим требуется разработка системы мер, направленных на подготовку семейных пар к естественному зачатию ребенка, что позволит минимизировать количество циклов ВРТ и уменьшить количество осложнений. Необходимо проведение дальнейших исследований со стандартизированными объективными методами стимуляции яичников, количеством перенесенных эмбрионов, полученными сперматозоидами и хорошо подобранной контрольной группой. В дальнейшем это может помочь в предотвращении случаев ранних самопроизвольных абортов, а также в своевременном принятии мер по устранению врожденных дефектов и в значительном увеличении процента рождения здоровых детей.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Коваль И.П., Зинькова Е.А., Маслова А.Д.

Сбор и обработка материала — Зинькова Е.А., Маслова А.Д., Зарембо-Годзяцкая О.В.

Статистическая обработка данных — Садковский А.М.

Написание текста — Зинькова Е.А.

Редактирование — Коваль И.П.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.