Введение
Наследственные заболевания часто являются причиной снижения качества и продолжительности жизни [1]. Их вклад в общую заболеваемость населения составляет около 1,5% [2], в связи с чем профилактика этих заболеваний представляется особенно актуальной для системы здравоохранения. Основной инструмент такой профилактики — скрининг на носительство генов аутосомно-рецессивных или X-сцепленных заболеваний [3]. Скрининг на носительство направлен на выявление лиц или пар, подверженных высокому риску рождения ребенка с соответствующим заболеванием [2, 3]. Приблизительно у 1—2 пар из 100 есть риск рождения ребенка с рецессивным заболеванием, тяжесть заболевания может варьировать от очень мягкого до тяжелого [4].
Для скрининга на носительство используют разные методы, среди них: секвенирование следующего поколения (next-generation sequencing — NGS), полимеразная цепная реакция (ПЦР), секвенирование по Сэнгеру, мультиплексная лигазнозависимая амплификации зондов (multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA) [3]. До недавнего времени скрининг часто выполняли на небольшое количество частых вариантов с помощью ПЦР [5], однако к сегодняшнему дню, по мере увеличения доступности технологии NGS и расширения списка исследуемых генов и вариантов, бо́льшую часть исследований проводят с помощью таргетных панелей или экзомного секвенирования [6—9].
В настоящее исследование были включены заболевания, имеющие высокую частоту в популяции, но разную степень тяжести. Так, по классификации, предложенной G. Lazarin и соавт. [10], муковисцидоз и фенилкетонурия относятся к тяжелым (severe) болезням, а дефицит α1-антитрипсина и GJB2-обусловленная нейросенсорная тугоухость — к умеренно тяжелым (moderate) [10—12].
Цель исследования — сравнение трех подходов к скринингу аутосомно-рецессивных заболеваний: генотипирования предварительно отобранных вариантов (панель из 115 вариантов) с помощью ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), секвенирования предварительно отобранных вариантов (панель из 115 вариантов) с прилегающими последовательностями (25 п.н. с каждой стороны) с помощью секвенирования следующего поколения (NGS-панель), а также секвенирования всех экзонов целевых генов с прилегающими последовательностями (25 п.н. с каждой стороны) с помощью NGS (NGS-экзоны).
Материал и методы
В исследование были включены: 1) две репрезентативные выборки населения Ивановской и Вологодской областей из исследования «Эпидемиология сердечно-сосудистых заболеваний в различных регионах Российской Федерации» (ЭССЕ) [13] — ЭССЕ-Иваново (1667 участников) [14, 15] и ЭССЕ-Вологда (1243 участника) [15, 16]; 2) выборка НОМТЦ МГТУ им. Н.Э. Баумана, сформированная на основе скринингового обследования на носительство 350 посетителей поликлиники репродуктивного возраста [15]; 3) выборка пациентов (1284 участника), которая была сформирована из пациентов с разными заболеваниями, не включенными в исследование, и наблюдаемых в Национальном медицинском исследовательском центре терапии и профилактической медицины Минздрава России (НМИЦ ТПМ, Москва, Россия). Клинические данные собраны из анкет НМИЦ ТПМ и исследования ЭССЕ-РФ [13].
В группу ПЦР-РВ были включены образцы из выборок ЭССЕ-Вологда и НОМТЦ МГТУ им. Н.Э. Баумана, в группу NGS-панель — из выборок ЭССЕ-Иваново и НМИЦ ТПМ, в группу NGS-экзоны — из выборок ЭССЕ-Вологда и НМИЦ ТПМ. Образцы между группами не пересекались. Родственные образцы были исключены из анализа.
Сбор и хранение биоматериала осуществляли по регламенту биобанкирования в Биобанке НМИЦ ТПМ (Москва, Россия) [17]. Для хранения образцов цельной крови с ЭДТА и буккальных мазков использовали температуру –30°C и +4°C соответственно.
Всего в анализ были включены данные 4544 участников (табл. 1).
Таблица 1. Характеристика образцов, включенных в исследование
| Показатель | ПЦР-РВ | NGS-панель | NGS-экзоны |
| Число участников, абс. | 1221 | 2101 | 1222 |
| Средний возраст (±стандартное отклонение), годы | 36,2±14,4 | 54,1±12,5 | 55,9±12,4 |
| Доля участников мужского пола, % | 50,6 | 39,1 | 41,3 |
Выделение ДНК
Геномную ДНК выделяли из образцов цельной крови или буккального мазка с использованием набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Германия). Для измерения концентрации ДНК использовали флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific, США) или спектрофотометр NanoDrop OneC (Thermo Fisher Scientific, США).
Генетическая панель вариантов
Панель включала 115 анализируемых вариантов, из которых 65 относились к CFTR (ENST00000003084.6; ENSP00000003084.6), 23 — к PAH (ENST00000553106.1; ENSP00000448059.1), 10 — к SERPINA1 (ENST00000448921.1; ENSP00000416066.1) и 17 — к GJB2 (ENST00000382844.1; ENSP00000372295.1) [15, 16].
ПЦР в режиме реального времени
ПЦР-генотипирование выполняли методом ПЦР-РВ с использованием технологии TaqMan (Thermo Fisher Scientific, США) [15, 16]. Реакционную смесь, состоящую из образца ДНК с 2×TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, США), загружали на планшеты OpenArray с помощью системы QuantStudio 12K Flex AccuFill (Thermo Fisher Scientific, США), после чего покрывали иммерсионной жидкостью и загружали в QuantStudio 12K Flex (Thermo Fisher Scientific, США) для амплификации в соответствии со стандартным протоколом производителя. Анализ данных проводили с использованием пакета программного обеспечения TaqMan Genotyper v. 1.4.0 (Thermo Fisher Scientific, США).
NGS
Библиотеки для панели NGS были приготовлены с использованием набора SeqCap EZ Prime Choice Library (Roche, Швейцария), экзомные библиотеки — с использованием протокола IDT-Illumina TruSeq DNA Exome (Illumina, США). Секвенирование проводили на приборе Nextseq 550 (Illumina, США). Все этапы секвенирования осуществляли в соответствии с протоколами производителей.
Секвенирование по Сэнгеру
Валидацию результатов проводили секвенированием по Сэнгеру для выбранных образцов с выявленными вредоносными вариантами на секвенаторе Applied Biosystem 3500 DNA Analyzer (Thermo Fisher Scientific, США) с использованием набора реагентов ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1 (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с протоколом производителя.
Биоинформатический анализ
Чтения с парными концами в формате fastq были выровнены на референсный геном GRCh37. Обработку данных и оценку контроля качества выполняли с помощью специально разработанного пайплайна на базе GATK 3.8 [18]. Анализ вариаций числа копий (copy number variation — CNV) для обнаружения больших делеций (например, CFTRdele2,3) осуществляли с использованием CNVkit2 [19]. Более подробно биоинформатический анализ описан ранее [15].
Для полученных данных были проведены контроль качества, оценки родства и анализ с помощью метода главных компонент (principal component analysis — PCA). Около 65% участников исследования относились к репрезентативным выборкам регионов, в которых доля русского населения составляет 85% и 89% для Вологодской и Ивановской областей соответственно [20]. По результатам анализа с помощью метода главных компонент провели исключение 4 образцов из выборки ЭССЕ-Иваново, 2 образцов из выборки ЭССЕ-Вологда и 87 образцов из выборки пациентов.
Отбор вариантов для анализа
Включение вариантов в панель из 115 вариантов проводили на основе данных литературы [21—27].
В NGS-группах помимо 115 вариантов дополнительно в анализ были включены:
1) патогенные или вероятно патогенные варианты согласно базе данных ClinVar. В случае если данные о патогенности варианта были противоречивы (Conflicting interpretations of pathogenicity; противоречивые интерпретации патогенности), вариант включали в анализ при наличии хотя бы одной интерпретации в качестве pathogenic (патогенного) или likely pathogenic (вероятно патогенного) по одному из следующих заболеваний: cystic fibrosis (муковисцидоз), α1-antitrypsin deficiency (дефицит α1-антитрипсина), autosomal recessive nonsyndromic hearing loss 1A (аутосомно-рецессивная несиндромальная тугоухость 1А), autosomal recessive deafness type 1A (аутосомно-рецессивная глухота 1А типа), hearing impairment (нарушение слуха), phenylketonuria (фенилкетонурия ) [28];
2) варианты, приведенные в Регистре пациентов с муковисцидозом в Российской Федерации за 2020 г. [29], за исключением: вариантов «непатогенных» по базе CFTR2 [30] и вариантов с неизвестным фенотипом [29]; rs73715573 (c.1210-11T>G) в связи с низкой пенетрантностью в случае муковисцидоза [31]; rs1805177 (c.1210-7_1210-6del), который вызывает муковисцидоз только in cis с rs78655421 (c.350G>A; p.Arg117His) [32], но участников с таким сочетанием вариантов выявлено не было;
3) варианты, указанные в базе данных CFTR2 как CF-causing (вызывающий муковисцидоз) или Varying clinical consequence (разные клинические последствия) [30].
4) варианты, включенные в базу данных PAHvdb со значениями Allelic Phenotype Value, соответствующие классической фенилкетонурии, мягкой фенилкетонурии и мягкой гиперфенилаланинемии [33].
Статистический анализ
Статистический анализ был проведен при помощи языка программирования R v. 4.1.2 [34]. Для возраста приведены среднее и стандартное отклонение (см. табл. 1). Сравнение аллельных частот между группами участников выполняли с помощью точного критерия Фишера. Участника считали носителем патогенного варианта в том или ином гене при наличии в соответствующем гене хотя бы одного варианта из числа включенных в анализ. Поправку на множественные сравнения осуществляли с помощью метода Бенджамини—Хохберга. Ассоциации считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Генотипирование с использованием ПЦР-РВ проводили в образцах ЭССЕ-Вологда и НОМТЦ МГТУ им. Н.Э. Баумана. Генотипирование в образцах ЭССЕ-Иваново и НМИЦ ТПМ выполняли с использованием панели NGS, включающей те же 115 вариантов четырех генов с дополнительным прочтением 25 п.н. с обоих концов от изучаемого варианта.
Проверку результатов генотипирования осуществляли секвенированием по Сэнгеру. Доля подтвержденных результатов составила 86,67% для ПЦР-РВ, 94,32% для NGS-панели и 89,36% для экзомного секвенирования. Наибольшее количество подтвержденных генотипов было отмечено при использовании метода NGS, наименьшее — при использовании ПЦР-РВ, что можно объяснить отсутствием необходимых для повышения точности генотипирования положительных контролей для каждого из аллелей.
Кроссплатформенную валидацию проводили с помощью подходов ПЦР-РВ и NGS-экзонов у 366 участников; 15 вариантов из панели были детектированы у 58 участников (у 3 было выявлено по 2 варианта) обоими методами. Вариант rs80338939 (c.35del; p.Gly12ValfsTer2) в гене GJB2 был выявлен у 13 участников только методом NGS-экзонов.
К сожалению, ни один подход не позволил достичь полной точности генотипирования. Так, анализ с использованием ПЦР-РВ не выявил носительства варианта rs80338939 гена GJB2, наиболее распространенного среди российских пациентов с нейросенсорной тугоухостью [35], предположительно, в связи с некорректной работой зондов. Этот вариант был обнаружен с помощью NGS-панели с аллельной частотой 1,74% (ЭССЕ-Иваново) [15] и с помощью экзомного секвенирования с аллельной частотой 3,55% (ЭССЕ-Вологда). С другой стороны, при анализе с помощью NGS-панели из-за низкого покрытия не был генотипирован вариант rs397508184 (c.1243_1247del; p.Asn415Ter) гена CFTR. Анализ с помощью экзомного секвенирования не был выполнен для двух вариантов, включенных в панель, так как они были не покрыты в экзомах: интронный rs75039782 (c.3718-2477C>T) гена CFTR и сайта сплайсинга rs80338940 (ENST00000382848.5:c.-23+1G>A) гена GJB2.
Информация о количестве вариантов, выявленных в исследуемых группах, из числа 115, включенных в панель, представлена в табл. 2. Доля выявленных вариантов варьирует от 18,3% до 29,6% от 115 вариантов, а по генам в отдельности — от 9% до 48%. Доля вариантов, не выявленных ни одного раза, составила 63,5%.
Таблица 2. Количество выявленных с помощью разных подходов вариантов из 115, включенных в панель, и их носителей (число выявленных вариантов/носителей)
| Подход | PAH (23 варианта) | GJB2 (17 вариантов) | SERPINA1 (10 вариантов) | CFTR (65 вариантов) | Всего (115 вариантов) |
| ПЦР-РВ | 5/25 | 8/80 | 2/51 | 6/25 | 21/174 |
| NGS-панель | 11/48 | 8/185 | 4/88 | 12/35 | 35/331 |
| NGS-экзоны | 8/30 | 8/97 | 4/51 | 10/31 | 30/198 |
В связи с тем, что NGS позволяет выявлять не только включенные в панель варианты, был проведен их анализ (табл. 3). В результате было выявлено 18 и 25 дополнительных вариантов в группах NGS-панель и NGS-экзоны соответственно. Частота носителей (вероятно) патогенных вариантов изучаемых генов отражена в табл. 4.
Таблица 3. Количество дополнительных (вероятно) патогенных вариантов изучаемых генов, выявленных с помощью NGS, и их носителей (число выявленных вариантов/носителей)
| Подход | PAH | GJB2 | SERPINA1 | CFTR | Всего |
| NGS-панель | 8/13 | 4/5 | 1/3 | 5/12 | 18/31 |
| NGS-экзоны | 5/11 | 6/10 | 3/5 | 10/13 | 24/38 |
Таблица 4. Частота носителей (вероятно) патогенных вариантов изучаемых генов (%)
| Подход | PAH | GJB2 | SERPINA1 | CFTR | Всего |
| ПЦР-РВ (n=1221) | 2,05 | 6,55 | 4,18 | 2,05 | 14,25 |
| NGS-панель (n=2101) | 2,90 | 9,04 | 4,33 | 2,05 | 16,75 |
| NGS-экзоны (n=1222) | 3,60 | 8,76 | 4,58 | 3,27 | 18,82 |
Сравнение частот носителей, обнаруженных в разных группах, представлено в табл. 5. Статистически значимые различия в частоте выявленных носителей обнаружены в группе сравнения ПЦР-РВ и NGS-панель только для гена GJB2 (p=0,037 после поправки на множественное сравнение). Вероятно, значимые различия для гена GJB2 в группах сравнения ПЦР-РВ и NGS-панель объясняются тем, что частый вариант в гене GJB2 был некорректно генотипирован в группе ПЦР-РВ. Для проверки этого предположения было выполнено повторное сравнение частоты выявленных носителей без рассмотрения варианта rs80338939 в группах NGS-панель и NGS-экзоны. В таком анализе статистически значимых различий частоты носителей как по гену GJB2 (p=0,385), так и по всем генам обнаружено не было (p=0,640), что является подтверждением выдвинутого предположения. Кроме того, данные, полученные в ходе кроссплатформенной валидации, показали наличие носителей этого варианта в образцах группы NGS-экзоны, для которых было проведено также тестирование с помощью ПЦР-РВ, не выявившее этого варианта.
Таблица 5. Сравнение частот носителей (вероятно) патогенных вариантов изучаемых генов, обнаруженных в разных группах
| Подход | Оценка значимости по гену, p (с поправкой на множественное сравнение) | ||||
| PAH | GJB2 | SERPINA1 | CFTR | Всего | |
| ПЦР-РВ против NGS-панель | 0,142 (0,213) | 0,012 (0,037) | 0,859 (0,859) | 1,000 (1,000) | 0,061 (0,092) |
| NGS-панель против NGS-экзоны | 0,304 (0,304) | 0,801 (0,801) | 0,727 (0,859) | 0,037 (0,112) | 0,142 (0,142) |
| ПЦР-РВ против NGS-экзоны | 0,027 (0,082) | 0,048 (0,071) | 0,693 (0,859) | 0,078 (0,116) | 0,003 (0,008) |
Анализ выявил 24 дополнительных варианта у 38 участников в группе NGS-экзоны и 18 дополнительных вариантов у 31 участника в группе NGS-панель. Варианты rs80338945 в гене GJB2 (c.269T>C; p.Leu90Pro), rs61761869 в гене SERPINA1 (c.1177C>T; p.Pro393Ser), rs118092776 (c.158G>A; p.Arg53His) в гене PAH были обнаружены у наибольшего числа участников.
Вариант GJB2:p.Leu90Pro был детектирован у 7 участников в группе NGS-экзоны и у одного участника в группе NGS-панель. В России этот вариант был обнаружен на 23 (1%) хромосомах из 2208 исследованных у пациентов с несиндромальной нейросенсорной тугоухостью разной степени тяжести и занимает 8-е место по частоте среди выявленных вариантов [35].
Вариант SERPINA1:p.Pro393Ser (MWürzburg) выявлен у 3 участников в группе NGS-экзоны и 3 участников в группе NGS-панель. Клиническое значение этого варианта еще не подтверждено окончательно в связи с небольшим количеством описанных клинических случаев, имеющих противоречивый характер [36].
Вариант PAH:p.Arg53His был детектирован у одного участника в группе NGS-экзоны и у 5 участников в группе NGS-панель. Этот вариант был обнаружен на одной хромосоме одного из 50 больных фенилкетонурией карачаевцев [37].
Полученные данные свидетельствуют о важности информации о частоте носительства в изучаемой популяции, так как данные по европейской популяции могут значимо отличаться от данных по российской популяции [14, 15]. Таким образом, для выбора наиболее оптимального списка вариантов для скрининга носителей необходимы как популяционные данные о частотах, так и информация о пенетрантности вариантов из клинических данных, полученных на пациентах.
Заключение
Достоверных различий в числе выявленных носителей при сравнении трех подходов к скринингу носительства аутосомно-рецессивных заболеваний выявлено не было. Таким образом, выбор наиболее подходящего подхода к генотипированию зависит от количества вариантов, включенных в исследование, и экономических ограничений. В случае небольшого количества вариантов метод ПЦР-РВ является наиболее удобным, так как он требует меньших временны́х затрат, относительно дешевле и предполагает более простую интерпретацию из-за отсутствия вариантов неопределенной клинической значимости. Из двух других рассмотренных методов экзомное секвенирование позволяет детектировать наибольшее число вариантов, однако их спектр не ограничен (вероятно) патогенными вариантами, что усложняет их интерпретацию.
Участие авторов: концепция и дизайн исследования — Е.А. Сотникова, А.В. Киселева, А.И. Ершова, А.Н. Мешков, О.М. Драпкина; сбор и обработка материала — Е.А. Сотникова, А.В. Киселева, А.Г. Сопленкова, А.А. Жарикова, В.Е. Раменский, Ю.В. Вяткин, М. Зайченока, О.П. Скирко, М.С. Покровская, С.А. Шальнова; написание текста — Е.А. Сотникова, А.В. Киселева, В.А. Куценко, А.И. Ершова, А.Н. Мешков; редактирование — А.Н. Мешков, В.Е. Раменский, А.И. Ершова
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.