Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения, меланома составляет <5% всех случаев рака кожи, но представляет собой наиболее агрессивный подтип, на который приходится примерно 80% смертей, связанных с новообразованиями кожи [1]. В 2021 г., по данным анализа заболеваемости населения России злокачественными новообразованиями и смертности от них, заболеваемость меланомой кожи среди всех выявленных онкологических заболеваний у женщин составила 2%. С 2011 по 2021 г. в России прирост заболевших лиц обоих полов составил 31,62%.

Средний возраст умерших от меланомы кожи за последние 10 лет увеличился с 62,8 до 67,7 года [2].

Меланома возникает в результате злокачественной трансформации меланоцитов, которые представляют собой клетки эпидермиса, содержащие меланин. Эти клетки необходимы для защиты митотически активных кератиноцитов от повреждений, вызываемых ультрафиолетовым (УФ) излучением. Факторами риска развития меланомы помимо воздействия УФ-излучения могут быть наследственные и соматические мутации, однако генетическая предрасположенность является причиной лишь небольшого числа случаев [3].

Меланома — это гетерогенное заболевание со сложной этиологией и патогенезом. Клетки меланомы имеют высокую мутационную нагрузку из-за вызванного ультрафиолетом повреждения ДНК и ошибок репликации ДНК. Следует отметить, что ключевые мутации, инициирующие онкогенез, в генах NRAS (NRAS proto-oncogene, GTPase), BRAF (B-Raf proto-oncogene, serine/threonine kinase) и NF1 (neurofibromin-1) не связаны с УФ-повреждением, и их триггер неизвестен [4, 5].

Меланомы кожи могут быть классифицированы в две крупные группы по происхождению: вследствие хронического повреждения кожи солнцем (cumulative solar damage, CSD) или периодического воздействия солнца (non-cumulative solar damage, non-CSD). Меланомы CSD, как правило, возникают у пожилых пациентов с наличием в анамнезе других различных видов рака кожи и с высоким кумулятивным воздействием УФ-излучения в течение жизни. Напротив, меланомы non-CSD возникают у людей в возрасте младше 55 лет, чаще у очень светлокожих людей с полиморфными вариантами гена рецептора меланокортина первого типа (MC1R). MC1R локализован на хромосоме 16q24.3 и кодирует трасмембранный белок, который участвует в формировании пигментации кожи [6]. Меланомы non-CSD обычно ассоциированы с мутацией BRAF V600E и демонстрируют сравнительно более низкую мутационную нагрузку [7]. Прогрессирование меланоцитарной неоплазии от нормальных меланоцитов до метастатической меланомы представляет собой многоэтапный процесс, включающий геномные изменения [8].

Для ранней диагностики меланомы необходимо учитывать генетические и клеточные структурные модификации, такие как аномалии коллагеноподобных последовательностей или структурных белков, наследственные онкогенные мутации, УФ-индуцированные мутации ДНК, молекулярные сигнальные пути.

Монослойные культуры клеток меланомы

Культивирование клеток меланомы человека in vitro включает их выделение из послеоперационного материала и выращивание в виде монослоя. Скрининг веществ, потенциально обладающих цитотоксичностью в отношении клеток меланомы, в большинстве исследований выполняется с использованием монослойных культур [9]. Эти методики просты в применении и сыграли важную роль в продвижении понимания биологии опухолей, однако в двумерных культурах опухолевые клетки организуются в монослой, тогда как приближенной к условиям in vivo является трехмерная модель, с помощью которой можно проследить динамику опухолевого роста [10]. Двумерные культуры не отражают многие комплексные свойства микроокружения меланомы in vivo (см. рисунок на цв. кклейке).

Микроокружение опухоли (схематическое изображение).

Опухолевая экосистема состоит из гетерогенной популяции, образованной опухолевыми клетками, опухоль-ассоциированными фибробластами, супрессорными клетками миелоидного происхождения и иммунными клетками. Взаимодействие между этими компонентами играет важную роль в росте, прогрессии и метастазировании опухоли.

В частности, культуры клеток не могут воспроизводить взаимодействия клеток меланомы с внеклеточным матриксом (extracellular matrix, ЕСМ) и межклеточные коммуникации, необходимые для регулирования пролиферации, адгезии и протеолитического расщепления микроокружения, ответственного за метастазирование опухоли. Состав и трехмерная структура ECM подвергаются непрерывному ремоделированию во время прогрессирования опухоли [11]. По данным литературы, клетки, культивируемые в 3D-моделях, более устойчивы к противоопухолевым препаратам, чем 2D-культуры [12]. По этим причинам разработка трехмерных моделей меланомы обладает потенциалом в преодолении разрыва между двумерными культурами и меланомой in vivo.

Последние разработки в области 3D-моделирования меланомы человека

Условно можно выделить два подхода к созданию опухолевых 3D-моделей: создание сфероидов и 3D-биопринтинг.

Сфероиды из клеток меланомы

Клеточные сфероиды представляют собой трехмерные структуры, которые образуются в результате самосборки путем межклеточной адгезии [13].

За последние 10 лет разработано большое количество 3D-моделей меланомы в виде сфероидов. Самая первая трехмерная модель сфероида опухоли создана в начале 70-х годов XX века [14, 15], а один из первых трехмерных сфероидов непосредственно меланомы описан в 1973 г. J. Folkman и M. Hochberg [16]. Первая трехмерная модель меланомы основана на клеточной линии меланомы B16 у мышей. В 1981 г. разработана модель кожи in vitro с использованием фибробластов крыс. Фибробласты культивировали с коллагеном и эндотелиальными клетками. Сфероиды меланомы, полученные непосредственно из опухолевого материала человека, описаны в 1984 г. [17]. Наконец, в 2000 г. несколько исследовательских групп разработали различные подходы к созданию гуманизированных трехмерных полноформатных моделей меланомы [13]. В то время как большинство из них использовали де-эпидермальную дерму человека (de-epidermized derma, DED) в качестве дермального слоя, на который сверху высевались клетки меланомы, кератиноциты и/или фибробласты [18, 13] другие исследователи разработали первую полностью клеточную трехмерную модель меланомы человека с использованием фибробластов и коллагена для формирования дермальной основы с добавлением сверху клеток меланомы и кератиноцитов [19]. Одна из первых полностью клеточных трехмерных полноформатных моделей меланомы человека с интегрированными эндотелиальными клетками и без DED в качестве дермальной основы разработана в 2013 г. [20]. В 2013 г. H. Vörsmann и соавт. создали трехмерную модель меланомы человека, основанную на интегрированных сфероидах, а не на отдельных клетках меланомы [21]. В 2018 г. опубликована клеточная трехмерная органотипическая сфероидная модель меланомы человека. Модель включала определенное количество зрелых и дифференцированных сфероидов меланомы, интегрированных в трехмерную конструкцию, состоящую из первичных ювенильных кератиноцитов и фибробластов и приближенную по архитектуре к настоящей коже человека. Клеточный состав и статус дифференцировки интегрированных сфероидов меланомы сходны с метастазами меланомы кожи in vivo [15].

3D-биопринтинг моделей меланомы

3D-биопринтинг позволяет моделировать живые ткани, которые включают в себя различные типы клеток, в сложной и заданной исследователем пространственной архитектуре. Преимущество таких моделей заключается в том, что организация ткани может быть полностью спроектирована заранее, а материал, являющийся основой модели, может быть химически или механически отвержден для получения желаемой механической устойчивости ткани [22, 23].

В 2017 г. разработана 3D-модель эквивалента меланомы кожи (melanoma skin equivalent, MSE) человека для изучения миграции, пролиферации и инвазии клеток двуклеточных линий меланомы человека (WM35 и SK-MEL-28) [24].

3D-модель MSE напечатана с использованием клеток DED человека, указанных выше клеточных линий меланомы, меченых флюорофорами (Mel Im GFP и MV3dc) в комбинации с Matrigel и двумя различными типами коммерчески доступных биочернил. В работе использовался биопринтер Cellink (Cellink, Швеция), в основе работы которого лежит принцип пневматической экструзии. Перед печатью суспензии клеток смешаны в соотношении 1:11 с разными гидрогелями (чернилами) (Cellink Bioink, Cellink RGD, GelXA или GelXA Laminink+) производства Cellink (Швеция) до конечной концентрации 10⁵ клеток/мл и раскапаны в картриджи (Cellink, Швеция). Для печати с Matrigel клетки смешивали в соотношении 1:11 до конечной концентрации 10⁵ клеток/мл и переносили в картридж. После полимеризации чернил все конструкции покрывали соответствующей культуральной средой и инкубировали при 37 °C во влажной среде с 8% содержанием CO₂ в течение 14 дней. В результате продемонстрирована пригодность всех протестированных биочернил для биопечати с клетками меланомы. Клетки в напечатанных моделях оставались жизнеспособными в течение 14 дней культивирования. Исследуемые линии клеток меланомы при культивировании продемонстрировали некоторые отличия в зависимости от биочернил, использованных для печати. В Matrigel клетки были способны распространяться, пролиферировать и образовывать плотные сети по всей конструкции, а в биочернилах на основе альгината клетки не пролиферировали. В биочернилах на основе метакрилата желатина клетки пролиферировали кластерами [24].

Несмотря на существование сфероидных и биопечатных моделей меланомы кожи, остается нерешенной проблема разработки модели, способной более полно воспроизводить различные особенности патогенеза, микроокружения, процессов прогрессирования и метастазирования опухоли, архитектуры и клеточного состава кожи. Поэтому актуальной задачей остается разработка полноформатных моделей меланомы, которые смогут наиболее приближенно к условиям in vivo имитировать описанные выше существенные особенности заболевания [25].

Полноформатные 3D-модели кожи

За последнее десятилетие значительно возрос интерес к использованию биопринтинга для изготовления искусственной кожи. Такие разработки имеют потенциал для моделирования меланомы. В идеале модель кожи с меланомой должна включать эпидермальный, дермальный и гиподермальный слои, придатки кожи (например, волосяные фолликулы и потовые железы), пигментацию (меланоциты) и функционирующую сосудистую сеть. По мере развития технологий биопринтинга и дизайна биочернил стало возможным создание многослойных моделей кожи [26—31].

Биопринтинг придатков кожи, таких как волосяные фолликулы и потовые железы, является важным направлением в разработке биомиметических моделей кожи в связи с их ролью в терморегуляции, поддержании гомеостаза и способствовании заживлении ран. H.E. Abaci и соавт. в 2018 г. разработали модель волосяного фолликула с помощью 3D-биопринтинга [32]. Результаты in vitro продемонстрировали дифференцировку кератиноцитов в специфические ростки волос, а длительное культивирование показало выпячивание волосяных фолликулов за пределы конструкции.

Пигментация кожи является одним из основных аспектов разработки жизнеспособной модели меланомы. Поэтому исследования в области биопечати с использованием меланоцитов и оценке производства ими меланина имеют решающее значение. Например, в 2018 г. W.L. Ng и соавт. изготовили трехмерные пигментированные модели кожи человека с использованием 3D-биопринтинга. Конструкции созданы с использованием трех различных типов клеток кожи (кератиноцитов, меланоцитов и фибробластов от трех разных доноров кожи), и они продемонстрировали такую же пигментацию (бледную пигментацию), что и доноры кожи [33]. D. Min и соавт. напечатали полнослойную модель кожи с пигментацией. Гистологический анализ модели показал наличие дермального и эпидермального слоев, а также конечную дифференциацию кератиноцитов, которые сформировали роговой слой. Кроме того, отмечена пигментация в виде веснушек на дермо-эпидермальном переходе, возникшая без использования УФ-излучения или химических раздражителей [34].

Не менее важна васкуляризация моделей кожи, так как долгосрочная жизнеспособность биопечатной конструкции зависит от создания функциональной сосудистой сети [35—37]. При прогрессировании меланомы ключевую роль в росте опухоли и метастазировании играет сосудистая сеть, поэтому васкуляризированные дермальные и гиподермальные компоненты в модели меланомы кожи обеспечат среду, более приближенную к таковой in vivo. Есть разработки, представляющие собой искусственные аналоги здоровой кожи.

M. Yanez и соавт. в 2015 году использовали струйную биопечать для изготовления двухслойного кожного трансплантата с эндотелиальными клетками человеческих микрососудов, встроенными между коллагеновым дермальным и эпидермальным слоями, содержащими фибробласты и кератиноциты соответственно. Гистологический анализ показал, что полученный трансплантат кожи имеет сходный вид с естественной кожей, а толщина дермы и эпидермиса приближалась к таковой в нормальной коже [38].

B.S. Kim и соавт. разработали платформу для биопринтинга полнослойной васкуляризированной модели кожи. Напечатная конструкция состояла из нескольких видов биочернил, перфузируемых сосудистых каналов и васкуляризированных дермальных и гиподермальных слоев [27]. Все это обеспечивает сложную микросреду, которую потенциально можно расширить, включая в нее придатки кожи. Такая платформа может быть использована в качестве основы для моделирования меланомы.

Перспективы

Злокачественная меланома является основной причиной смерти от рака кожи. Для борьбы с этим агрессивным заболеванием важно понимать, какие генетические факторы и триггеры лежат в основе возникновения и прогрессирования меланомы, а также динамику микроокружения опухоли. Несмотря на то что существующие 2D-модели предоставили основную информацию о прогрессировании злокачественных процессов, они не полностью пригодны для изучения рака, поскольку не воспроизводят условия in vivo.

Для преодоления барьера между монослойной культурой опухолевых клеток и опухолью in vivo используются 3D-модели, которые точнее, чем 2D-культуры, воссоздают микросреду нативной ткани, а также взаимодействия между клетками и внеклеточным матриксом.

Несмотря на то что удалось достичь значительного прогресса в разработке 3D-моделей меланомы, все еще существует пробел в создании моделей, полноценно имитирующих настоящую кожу, что также является важным аспектом в изучении меланомы. Такие модели необходимы, поскольку кожа представляет собой сложную ткань, которая имеет различия в зависимости от расы (пигментация, влияющая на количество поглощаемого УФ-излучения), расположения на разных частях тела (количество волосяных фолликулов, потовые железы и толщина), а также возраста (эластичность и деградация внеклеточного матрикса).

Биопринтинг трехмерных моделей меланомы с использованием клеток, полученных от пациентов, может предоставить платформу для разработки персонализированного лечения.

Кроме того, достижения в области биопринтинга открывают возможности разработки моделей редких подтипов меланомы, таких как увеальная и меланома слизистых оболочек. В настоящее время стремительно развивается область биопринтинга роговицы, и будущие исследования могут включать увеальный тракт [39]. Прогресс в биопечати эквивалентов кожи человека также может быть полезен в изучении немеланомных видов рака кожи, таких как карцинома из клеток Меркеля, базальноклеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома и карцинома сальных желез.

Заключение

Рост заболеваемости и высокая смертность от меланомы кожи свидетельствуют о том, что более глубокое изучение этого заболевания и поиск новых терапевтических средств являются необходимостью.

Одним из наиболее прогрессивных методов изучения злокачественных процессов в целом и меланомы в том числе является их трехмерное моделирование, позволяющее in vitro воссоздать условия, приближенные к таковым in vivo. Что касается меланомы, на настоящий момент уже существуют 3D-модели как на основе сфероидов, так и созданные с использованием 3D-биопечати. Однако ни одна из существующих моделей меланомы кожи не нашла широкого применения на практике.

Поэтому имеется потребность в создании трехмерных тканевых конструкций, учитывающих недостатки предыдущих моделей и наиболее полно имитирующих человеческую кожу и процессы, происходящие в ней. В моделировании меланомы такие конструкции помогут наиболее точно воссоздать условия, в которых развивается злокачественный процесс в живом организме.

Помимо возможности углубленного изучения биологии и патогенеза меланомы, 3D-модели имеют потенциал в качестве платформы для более эффективного скрининга новых терапевтических подходов и разработки персонализированного лечения.

Участие авторов: концепция и дизайн исследования — С.В. Тимофеева; И.А. Новикова, О.И. Кит, сбор и обработка материала — Т.В. Чембарова, С.Ю. Филиппова, А.О. Ситковская, И.А.; статистический анализ данных — В.В. Позднякова, О.В. Хохлова, Ю.В. Пржедецкий, Н.А. Захарова; написание текста — С.В. Тимофеева; редактирование — О.Г. Ишонина, Е.В. Шалашная.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.