Введение
Опухоли кожи являются распространенными заболеваниями, которые значительно снижают качество жизни пациентов и приводят к значительным финансовым потерям [1]. Особого внимания заслуживают базальноклеточная карцинома кожи (БКК), плоскоклеточная карцинома кожи (ПКК), меланома и др. [1, 2]. Как известно, пациенты часто обращаются за медицинской помощью на поздней стадии заболевания, что ведет не только к необратимому прогрессированию патологии, но и к выполнению инвазивных вмешательств и удлинению реабилитационного периода после проведенной операции [3].
В современной клинической медицине широко используются цитологический, гистологический методы диагностики, а также магнитно-резонансная томография, компьютерная томография, терагерцовая спектроскопия, оптическая когерентная томография и др. Каждый из представленных методов обладает своими плюсами и минусами [1, 4—9]. Одной из ключевых проблем в диагностике опухолей кожи является определение их границ.
Для лечения злокачественных заболеваний кожи применяются операции по Моосу, которые являются дорогостоящими, и для их проведения требуется использование специального оборудования и обученного высококвалифицированного персонала. Выполнение хирургического вмешательства без соответствующей навигации может приводить в дальнейшем к рецидиву опухоли и повторной, более обширной операции, поскольку в настоящее время не представляется возможным четко определять границы опухоли на основании клинического обследования и дерматоскопии. Например, трудности возникают при идентификации типов плоскоклеточных карцином, некоторых форм базальноклеточной карциномы (склеродермоподобной формы), ангиосарком и др.
Метод конфокальной микроспектрометрии комбинационного рассеяния света в дальнейшем может позволить определять четкие границы опухоли и избежать сложных операций и повторных хирургических вмешательств. Данный метод дает возможность оценить изменения, происходящие в ткани на уровне молекулярного состава, а также обладает такими характеристиками, как высокая точность, скорость, неинвазивность, чувствительность, специфичность при спектральном анализе новообразований кожи. Важным является использование неинвазивных методов [6, 8—15], в том числе для получения возможности не только идентифицировать тип патологического процесса, но и оценить границы резекции опухоли [16].
Цель исследования — изучить возможности использования конфокальной микроспектроскопии комбинационного рассеяния света и флюоресценции с длиной волны возбуждающего излучения 785 нм для дифференциальной диагностики новообразований кожи области головы и шеи.
Материалы и методы
Проведен анализ спектральных характеристик тканей при доброкачественных и злокачественных новообразованиях кожи. Всего проанализировано 1066 спектров интактной кожи, тканей БКК и ПКК кожи и доброкачественных новообразований кожи (дермальных невусов) (n=244; n=220, n=180, n=422 соответственно). Опухоли кожи локализованы в области кончика, ската и крыла носа, наружного слухового прохода и ушной раковины, в лобной и щечной анатомических зонах. Для конфокальной спектроскопии комбинационного рассеяния света и флуоресценции применяли аппаратно-программный комплекс конфокальный микроскоп-спектрометр комбинационного рассеяния света Confotec MR520, функционирующий на длине волны возбуждающего лазерного излучения 785 нм. Спектры сняты в условиях in vitro. Исследованы образцы тканей опухолей на стадии T1N0M0. В качестве метода сравнения применяли гистологическое исследование. Операции проведены в специализированном онкологическом отделении, лечение осуществляли в соответствии с действующими стандартами, порядками оказания медицинской помощи, клиническими рекомендациями. Изучаемый фрагмент ткани (интактной кожи, базальноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы кожи, дермального невуса) диаметром до 2 мм помещали на столик сканирующего конфокального микроскопа с указанными выше характеристиками. Мощность излучения составила 2,2 мВт; время накопления сигнала — 10 с в каждой точке; среднее количество спектров на один образец — 15. В ходе исследования из результирующего спектра вычитали интенсивность сигнала флуоресценции с использованием алгоритма Ванкувера, затем проводили сглаживание методом Савицкого—Голея и нормировку на наиболее стабильную интенсивность полосы 1442 см–1.
Проведение исследования одобрено межвузовским этическим комитетом (выписка из протокола № 3 от 16.03.2023).
Результаты
После получения спектров флюоресценции и комбинационного рассеяния света БКК кожи, ПКК кожи, а также интактной кожи in vitro на длине волны возбуждающего излучения 785 нм проведена их обработка, затем каждый полученный спектр сопоставлен с данными гистологического исследования. На основе полученных данных проведено сравнение спектров при указанных заболеваниях между собой и со спектрами интактной кожи.
На рис. 1, а, б на цв. вклейке изображены спектры интактной кожи, БКК и ПКК в сравнении друг с другом при длине возбуждающего излучения 785 нм в диапазоне волновых чисел от 900 до 3100 см–1.
Рис. 1. Спектры конфокальной микроспектроскопии комбинационного рассеяния света при длине волны возбуждающего излучения 785 нм.
а — в диапазоне волновых чисел от 900 до 1900 см–1 базальноклеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы и интактной ткани кожи; б — в диапазоне высоких волновых чисел от 2800 до 3100 см-1 базальноклеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы и интактной ткани кожи. Синим цветом показаны спектры базальноклеточной карциномы, фиолетовым — плоскоклеточной карциномы, зеленым — интактной ткани кожи.
Наиболее информативными линиями комбинационного рассеяния света при регистрации спектров с поверхности невусов были следующие: 937, 1002, 1031, 1060, 1085, 1125, 1156, 1171, 1206, 1249, 1300, 1342, 1442, 1552, 1606, 1656, 1745 см–1. При злокачественных новообразованиях регистрировались следующие линии комбинационного рассеяния света в данном диапазоне частот: 938, 1004, 1062, 1082, 1175, 1208, 1248, 1266, 1302, 1316, 1393, 1445, 1585, 1604, 1654, 1745 см–1. Определены спектральные различия дермальных невусов в зависимости от накопления пигмента, главным образом меланина, а также отличие данных спектров от спектров при БКК, ПКК в сравнении с интактной кожей, не вовлеченной в опухолевый процесс (рис. 2 на цв. вклейке). Полученные результаты могут быть информативными в диагностике как пигментных, так и беспигментных доброкачественных и злокачественных новообразований.
Рис. 2. Спектры конфокальной микроспектроскопии комбинационного рассеяния света при длине волны возбуждающего излучения 785 нм.
Диапазон волновых чисел от 900 до 1900 см–1 дермального невуса с накоплением пигмента (показано коричневым цветом), дермального невуса без накопления пигмента (показано серым цветом) и интактной ткани кожи (показано зеленым цветом).
Обсуждение
Как известно, интактная кожа состоит из трех основных слоев: эпидермального, дермального и гиподермы, или подкожного жирового слоя. При формировании новообразования кожи качественный и количественный составы ее компонентов изменяются. Так, при базальноклеточной карциноме и плоскоклеточной карциноме кожи при разрушении мембран клеток могут обнаруживаться специфические гистологические изменения, которые коррелируют с данными микроспектроскопии комбинационного рассеяния света (см. рис. 1, а, б).
Как известно, БКК кожи относится к одному из наиболее распространенных злокачественных новообразований кожи, которое может вызвать деструкцию местных тканей, при этом она редко метастазирует [17]. При анализе гистологических данных можно отметить, что БКК кожи представлена клетками с крупными удлиненными ядрами, а в клетках наблюдается выраженный процесс митоза и апоптоза, сопровождающийся лимфоцитарным воспалением. Визуализируются также большое количество фибробластов и утолщение волокон коллагена [18], что сопровождается усилением сигнала в диапазоне от 900 до 1900 см–1 при длине волны 785 нм (см. рис. 1, а). Некоторые виды БКК имеют схожую гистологическую картину с компонентами ткани ПКК, что может отражаться в спектрах в виде линий комбинационного рассеяния света на одной и той же величине волнового числа [19—21], как продемонстрировано на рис. 1, а, б, однако пики могут различаться по интенсивности, полуширине и другим параметрам.
Известно, что ПКК относится к одному из наиболее распространенных форм немеланоцитарного рака кожи, на которую приходится 20% всех злокачественных новообразований кожи [17]. При сохранности базальной мембраны клеток некоторые пики комбинационного рассеяния света могут быть одинаковыми в норме и при ПКК, однако в данном случае следует анализировать все линии в совокупности, их характеристики: высоту, полуширину, сдвиг по оси абсцисс и др. (см. рис. 1а, б). При формировании такой опухоли развивается воспалительная реакция, состоящая из инфильтрации лимфоцитов, плазматических клеток и эозинофилов, окружающих стромальные сосуды и иногда проникающих в опухоль; эпидермис, покрывающий поверхность ткани при ПКК, в свою очередь, может быть изъязвлен, структура клеток нарушена, что и определяет различие спектральных данных в норме и при ПКК.
На рис. 1, а мы видим, что в указанном диапазоне величин волновых чисел на длине волны возбуждающего излучения 785 нм при БКК наиболее интенсивными линиями комбинационного рассеяния света являются 938, 1062, 1248, 1316, 1445, 1654 см–1, при этом совпадение интенсивности линий наблюдается на величине волнового числа 1445 см–1. При ПКК в данном диапазоне частот они также регистрируются, однако данные пики менее выражены по интенсивности, чем при БКК, а в норме они минимальные по сравнению с таковыми при БКК и ПКК. Такой феномен можно объяснить с позиций пересечения некоторых стадий опухолевого процесса при этих видах патологии. В указанном диапазоне величин волновых чисел и при указанной длине волны возбуждающего излучения наиболее информативными полосами комбинационного рассеяния света являются 938, 1004, 1062, 1082, 1175, 1208, 1248, 1266, 1302, 1316, 1393, 1445, 1585, 1604, 1654, 1745 см–1.
В диапазоне волнового сдвига 936—940 см–1 на длине волны возбуждающего излучения 785 нм отмечаются пики комбинационного рассеяния, свидетельствующие о наличии в тканях углеродных связей C—C, в том числе в составе белков (α-спираль), коллагена 11-го типа [22]. При длине волны возбуждающего света 785 нм в диапазоне волновых чисел 1000—1005 см–1 отмечаются пики, иллюстрирующие наличие ν(C—C)-связей, растяжение ароматического кольца, наличие фенилаланина, белков (Phe), коллагена, эластина, кератина [22—24], соотношение которых меняется при появлении злокачественного роста при ПКК. В диапазонах величин волновых чисел 1060—1064 см–1 и 1080—1084 см–1 соответственно (при длинах волн возбуждающего излучения 532 нм и 785 нм) визуализируются спектры, свидетельствующие о наличии связей ν(CC)–, ν(CN)– в составе триолеина, фосфолипидов, нуклеиновых кислот. При этом на величинах волновых чисел в диапазонах 1079—1085 см–1 и 1126—1130 см–1 отмечаются ν(CC)-скелетные трансконформации, ν(CN)-связи в составе фосфолипидов [23, 25]. В диапазонах волновых чисел 1208—1210 см–1 и 1248—1250 см–1 на длинах волн 532 нм и 785 нм соответственно отмечаются спектральные признаки амида III, белка (α-спирали), коллагена, эластина [26]. В диапазоне 1440—1454 см–1 выявляемые спектры иллюстрируют наличие связей δ(CH2), δ(CH3) в составе липидов, белков (алифатических аминокислот, триолеина, церамидов [23, 25, 26]. При БКК в данном случае изменения в спектрах коррелируют с регистрацией пиков на уровне молекулярного состава. В диапазоне волновых чисел 1440—1450 см–1 и 1554—1559 см–1 регистрируется наличие ν(C= C)-связей в составе триптофана [25, 27]. На наличие амида I указывает полоса на величине волнового числа 1654 см–1, которая характеризует α-спиральную структуру молекул. Помимо этого, можно предполагать, что на величине волнового числа 1654 см–1 имеется вклад не только амидной полосы I белков, но и воды [28]. В диапазонах величин волновых чисел 1652—1656 см–1 и 1743—1745 см–1 отмечается наличие ν(C=O)-связей в составе липидов [23, 29]. Из спектральных особенностей следует отметить, что данные пики в норме и при БКК совпадали после обработки сигналов, однако были ниже по интенсивности при БКК, что можно объяснить травматизацией ткани при БКК, когда происходит разрушение ее компонентов.
На рис. 1, б продемонстрированы спектры в диапазоне высоких волновых чисел при длине волны возбуждающего излучения 785 нм. Наиболее интенсивные полосы комбинационного рассеяния света в норме отмечаются на величинах волновых чисел 2853 см–1, 2880 см–1, при этом при ПКК и БКК они также регистрируются, что свидетельствует о наличии схожих компонентов тканей при данных заболеваниях. В диапазонах волновых чисел 2929—2934 см–1 и 2925—2933 см–1 регистрируется асимметричное растяжение CH2-групп в составе липидов и белков. Пики комбинационного рассеяния света на величинах волновых чисел 2935 см–1 и 2853 см–1 являются характерными для метильных групп в белках и метиленовых групп в жирных кислотах [30]. Наиболее интенсивными полосами комбинационного рассеяния света при ПКК являются 2930 см–1 и линии диапазона 2800—2825 см–1. При БКК регистрируется пик с максимальной интенсивностью линии комбинационного рассеяния света на 3062 см–1. При этом наиболее информативными полосами комбинационного рассеяния света являются 2853, 2880, 2930, 3011, 3040, 3062 см–1.
При сравнении наиболее информативных полос комбинационного рассеяния света при дифференциации доброкачественных и злокачественных новообразований выявлены спектральные особенности. Так, на величинах волновых чисел 1266, 1316, 1393, 1585 см–1при регистрации спектров с поверхности злокачественных новообразований обнаруживались пики, которых не было при регистрации спектров с поверхности дермальных невусов. При этом при снятии спектров с поверхности доброкачественных новообразований (пигментных и беспигментных дермальных невусов) также отмечены линии комбинационного рассеяния света, которые не прослеживались в случае идентификации злокачественного процесса: 1031, 1125, 1156, 1342, 1552 см–1. В остальных случаях можно продемонстрировать сдвиг линий комбинационного рассеяния света вдоль оси абсцисс, при этом такие линии регистрировались как в случае злокачественного, так и в случае доброкачественного процесса в области кожи. Полученные данные свидетельствуют о том, что с использованием конфокальной спектроскопии комбинационного рассеяния света представляется возможным идентифицировать тип патологического процесса, провести экспресс-диагностику доброкачественных и злокачественных новообразований кожи, в том числе с определением границ резекции опухоли.
Заключение
В результате исследования получены спектральные различия интактной ткани кожи, плоскоклеточной карциномы кожи, базальноклеточной карциномы кожи и дермальных невусов. По полученным данным представляется возможным дифференцировать эти заболевания между собой и от интактной ткани кожи. Использование конфокальной микроспектроскопии комбинационного рассеяния света, по-видимому, позволит в перспективе выявлять новообразование (плоскоклеточную карциному кожи или базальноклеточную карциному кожи) на стадии инициации онкологического процесса, а также определять границы резекции опухоли. Создание базы данных спектральных характеристик опухолей кожи и других новообразований с использованием комбинационного рассеяния света, коррелирующих с данными гистологического исследования, является важным вспомогательным инструментом врача при установлении диагноза и обеспечении своевременного направления пациента на рациональное лечение.
Вклад авторов: концепция, основная идея, методология и дизайн исследования — Тимурзиева А.Б., сбор и обработка материала — Тимурзиева А.Б., Федина М.С., Вертиева Е.Ю., Омарова А.Р., Римская Е.Н., Шелыгина С.Н.; статистический анализ данных — Тимурзиева А.Б., Римская Е.Н., Шелыгина С.Н., Сараева И.Н.; написание текста — Тимурзиева А.Б., Вертиева Е.Ю., Федина М.С., Попадюк В.И.; научное редактирование — Попадюк В.И.
Финансирование: работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда, проект №23-25-00249.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Authors contribution: concept, main idea, methodology and research design — Timurzieva A.B., collection and processing of material — Timurzieva A.B., Fedina M.S., Vertieva E.Yu., Omarova A.R., Rimskaya E.N., Shelygina S.N.; statistical data analysis — Timurzieva A.B., Rimskaya E.N., Shelygina S.N., Sarajeva I.N.; writing the text — Timurzieva A.B., Vertieva E.Yu., Fedina M.S., Popadiuk V.I.; editing — Popadiuk V.I.
Financial Support: by Russian Science Foundation, grunt number №23-25-00249.