Большинство заболеваний в стоматологии, приводящих к инвалидизации, связаны с приобретенной утратой альвеолярной костной ткани. К таким заболеваниям относят: рецессию десны, выраженную атрофию беззубых челюстей, посттравматические деформации лица и т. д. В связи с этим актуальной задачей остается поиск эффективных способов борьбы с потерей альвеолярной кости. Восстановить утраченный объем костной ткани позволяет остеопластика, «золотым стандартом» которой является аутотрансплантация (так называемая костная аугментация) из крыла подвздошной кости. В качестве других источников используется аутологичный костный материал бедра, затылка, челюсти человека. Операционная процедура достаточно тяжело переносится пациентами, не всегда возможна, костная ткань в месте оперативного вмешательства формируется обычно через 4—8 мес [1]. Проблемы использования трупной кости или синтетических материалов часто связаны с отсутствием остеоиндуктивного и остеогенного потенциала используемых материалов [2].

Одним из наиболее перспективных подходов к решению этой проблемы является направленная регенерация тканей, основанная на способности стволовых и прогениторных клеток к восстановлению поврежденных в результате болезни или травмы тканей человека. Для усиления регенерации кости требуется три ключевых фактора: эффективные прогениторные клетки, эффективные микроносители или поддерживающий их матрикс, сигнальные молекулы (цитокины и ростовые факторы) [3].

Для создания биоинженерных конструкций в качестве клеточного материала широко применяются мезенхимальные стволовые клетки (МСК) — плюрипотентные стволовые клетки, обладающие хондрогенной, остеогенной и адипогенной дифференцировкой. В качестве источника таких прогениторных клеток, дифференцирующихся в остеобласты, цементобласты и фибробласты, наиболее часто рассматривают пульпу зуба, периодентальную связку и расщепленные молочные зубы [4, 5]. Однако трудности стимуляции МСК и контроль их дифференцировки invivo затрудняют их широкое использование в клинической практике. В отличие от МСК, клетки надкостницы обладают лишь остеогенной и хондрогенной потенцией [6]. Забор надкостницы является малоинвазивной процедурой, которая может выполняться при плановых хирургических вмешательствах.

Регенеративная роль надкостницы была отмечена еще в прошлом веке, но только в начале 2000-х годов было подтверждено наличие периостальных прогениторных клеток в надкостнице трубчатых и плоских костей. Причем прогениторные клетки надкостницы обладают более высоким остеогенным потенциалом по сравнению со стромальными МСК. В то же время, остеогенная активность периостальных клеток плоских костей более выражена по сравнению с периостальными клетками трубчатых костей [7].

Данная работа посвящена оценке возможности использования аутологичных клеток надкостницы для восполнения утраченной альвеолярной кости.

Образец ткани надкостницы альвеолярной кости, размером 5×5 мм, получали во время операции с соблюдением стерильных условий, помещали в пробирку (SARSTEDT, 50 мл), содержащую транспортную среду. Процедура забора согласована и одобрена локальным этическим комитетом.

Через 1—2 ч после забора биоптат подвергался механической и ферментной обработке в условиях стерильного бокса. После 16—20-часовой инкубации в растворе коллагеназы II типа («Sigma»), измельченный тканевой гомогенат центрифугировали (800 об/мин, в течение 5 мин при t –18—20 °C), после чего осадок ресуспендировали в ростовой среде DMEM-GlutaMAX («Gibco») с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (FBS, «Gibco») и антибиотика/антимикотика («Gibco», 100х) в стандартной концентрации.

Полученную суспензию клеток переносили в культуральный 25 см² пластиковый флакон (Corning) и культивировали в СО₂-инкубаторе при 5% CO₂ в течение 10—15 дней до формирования субконфлюэнтного монослоя. Затем часть клеток использовали для проведения иммуногистохимических исследований по стандартной методике, другую часть культивировали с микроносителями в соотношении 2:1. В качестве микроносителей в эксперименте использованы: Bio-Оss, Tutoplast, Botiss Dental-Maxresorb, Botiss Dental-Ctrabone, Botiss Dental, Pacific Coast Tissue Bank-Dembone, Pacific Coast Tissue Bank-Osteomin, SynthoGraft, AlloGraft, LyoПласт. Непосредственно перед посадкой клеток на носители, последние дважды отмывали стерильным раствором Хенкса с феноловым красным. После промывки в лунки вносили по 1 мл полной ростовой среды. На 3-и сутки совместимость микроносителей к клеткам оценивали по количеству клеток на микроносители (окраска с DAPI) и степень их распластанности при фазово-контрастной микроскопии, пролиферативную активность оценивали по количеству клеток, положительно окрашенных с антителами к Ki-67 при люминесцентной микроскопии.

Для оценки остеоиндуктивной активности биоинженерной конструкции кроликам массой 3 кг под местной анестезией проводили эктопическую трансплантацию суспензии клеток на микроносителях в объеме 1 мл в длинную мышцу спины. В качестве контроля использовали биоинженерную конструкцию из клеток надкостницы кролика на микроносителях и микроносители без клеток.

Результаты эктопической трансплантации оценивали через 8 и 12 нед. Мышечную ткань из зоны эктопической трансплантации фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилин-эозином по стандартной методике.

При морфологическом исследовании клетки надкостницы альвеолярной кости имели фибробластоподобную форму. При иммуногистохимическом исследовании этих клеток практически все исследуемые клетки положительно окрашивались с антителами к виментину, костному морфогенетическому белку 8а, костному сиалопротеину, остеокальцину, остеопонтину, костной щелочной фосфатазе и тромбопоэтину, что свидетельствует об их остеогенной природе (рис. 1).

При фазово-контрастном и люминисцентном исследовании взаимодействия микроносителей с культивируемыми клетками наибольшее количество остеогенных клеток надкостницы обнаружено на поверхности гранул Botiss Dental-Maxresorb, Pacific Coast Tissue Bank-Dembone и LyoПласт. Степень распластанности клеток оказалась наиболее высокой на этих же микроносителях, особенно при предварительной обработке их коллагеном человека I типа в течение 1 ч. Иммунофлюоресцентная микроскопия выявила скопления пролиферирующих клеток на этих же носителях.

На основании полученных данных в качестве носителей для биоинженерной конструкции выбраны Botiss Dental-Maxresorb и LyoПласт. Остеогенные клетки надкостницы альвеолярной кости человека и кролика культивировали с микроносителями Botiss Dental-Maxresorb и Лиопласт в течение 2 сут в среде с эмбриональной телячьей сывороткой и 1 сут в бессывороточной среде. Экспериментальные животные были подразделены на 3 группы: 1-я — контрольная (микроносители без клеток); 2а — микроносители Botiss Dental-Maxresorb с остеогенными клетками человека; 2б — микроносители Botiss Dental-Maxresorb с остеогенными клетками кролика; 3а — микроносители LyoПласт с остеогенными клетками человека; 3б — микроносители LyoПласт с остеогенными клетками кролика.

К 8-й неделе исследования в контрольной группе кроликов отмечались небольшие фрагменты микроносителей в мышечной ткани, слабо инфильтрированные мононуклеарными лейкоцитами и единичными многоядерными клетками (рис. 2). В зоне контакта микроносителей с мышечной тканью признаки воспаления отсутствовали. На 12-й неделе следов микроносителей в мышечной ткани кроликов не обнаружено.

В группе 2 и 3 на 8-й неделе исследования в мышечной ткани обнаружены зоны с выраженным формированием костной ткани (рис. 3). Структура кости носила сформированный трабекулярный характер. В зоне контакта костной ткани с мышечной тканью отмечалась мононуклеарная инфильтрация, представленная в основном макрофагами, лимфоцитами и единичными многоядерными клетками. Плазматические клетки в составе инфильтрата отсутствовали (рис 4). Степень мононуклеарной инфильтрации вокруг формирующийся костной ткани более выражена при использовании клеток человека, чем кролика. На 12-й неделе мононуклеарная инфильтрация в мышечной ткани кроликов вокруг сформированной кости отсутствовала.

Таким образом, морфологическое исследование показало, что уже к концу второго месяца созданная нами биоинженерная конструкция индуцировала образование полноценной костной ткани. Наличие мононуклеарной инфильтрации вокруг очагов формирующейся кости безусловно связано с развитием местной асептической воспалительной реакции. Реакция организма животного на введение чужеродных клеток человека также может играть свою роль, поскольку мононуклеарная инфильтрация в группах, где использовались клетки надкостницы человека, более выражена по сравнению с группами, где использовались клетки кролика.

Использование эктопической трансплантации позволяет более полноценно определить остеогенный потенциал изучаемых клеток, учитывая возможные различия остеогенного потенциала клеток надкостницы invitro и invivo [9]. Столь высокий остеогенный потенциал клеток надкостницы альвеолярной кости очевидно связан с особенностями эмбрионального развития организма. Периостальные клетки плоских костей развиваются как из мезенхимальных клеток, так и из клеток нервного гребня [7, 8]. Результаты последних исследований по изучению возрастных особенностей прогениторных клеток надкостницы показали, что высокий остеогенный потенциал этих клеток не зависит от возраста, а выраженные остеогенные свойства сохраняются в течение 45 сут без всякой внешней индукции [10]. Таким образом, прогениторные клетки надкостнициы имеют выраженное направление дифференцировки в костную ткань, что минимизирует риск изменения направления дифференцировки в долгосрочном прогнозе.

Результаты проведенного исследования показали высокий остеогенный потенциал клеток периоста. При эктопической трансплантации биоинженерной конструкции (микроносителей с остеогенными клетками кролика и человека) уже через два месяца в мышечной ткани формируется полноценная костная ткань. Клеточная реакция организма кролика на введение человеческого материала не препятствует эктопическому формированию костной ткани у животного. Таким образом, надкостницу можно рассматривать как эффективный источник остеогенных клеток для восполнения резорбированной альвеолярной кости.