Современные высокотехнологичные методические подходы молекулярной биологии и медицины с использованием постгеномных технологий позволяют выяснить ранее неизвестные механизмы развития осложненной беременности. В последнее десятилетие интенсивное развитие начали получать технологии протеомного анализа, позволяющие изучить протеом - совокупность белков, экспрессируемых геномом исследуемого биологического объекта [1]. Белки, являясь «молекулярной машиной», которая реализует информационную программу клеток, играют ключевую роль во всех процессах, происходящих на молекулярном уровне в системе мать-плацента-плод (трофика плода, активный фетоплацентарный транспорт, антигенные взаимодействия между организмами матери и плода, межклеточные контакты, рецепция сигнальных биомолекул, ферментативные процессы и антиоксидантная защита плода). При срыве гомеостазирующих механизмов и развитии акушерской патологии в протеоме наступают вначале обратимые, а затем и необратимые нарушения, которые во многих случаях проявляются в изменении спектра и структурно-динамического состояния белков. Эти отклонения выражаются в появлении или исчезновении отдельных белковых фракций.

Важной биологической средой организма, быстро реагирующей изменением своего состава на патологические процессы, происходящие в организмах матери и плода, являются околоплодные воды, белки которых имеют как материнское, так и фетоплацентарное происхождение [3]. Протеомный анализ околоплодных вод может представлять весьма ценную информацию о течении беременности, состоянии плода и, как следствие, дает возможность прогнозировать состояние новорожденного.

В последние годы в литературе начали появляться работы по изучению протеомного состава амниотической жидкости, краткий обзор которых приведен в монографии В.И. Орлова и соавт. [3]. Однако в этих исследованиях отсутствуют сведения о динамике протеомного спектра при задержке роста плода (ЗРП), а данные при гестозе весьма малочисленны и относятся только к состоянию преэклампсии [13, 14]. В то же время указанные осложнения беременности до настоящего времени остаются ведущими акушерскими причинами, приводящими к пренатальной патологии [2, 4].

В связи с вышеизложенным целью настоящей работы явилось изучение протеомного состава амниотической жидкости при физиологической беременности, ЗРП и гестозе для выявления белков-маркеров акушерской патологии.

В проспективное исследование были включены 42 женщины в возрасте от 23 до 33 лет (в среднем 25,7±0,4 года), составившие 3 группы. В 1-ю группу вошли 20 клинически здоровых женщин с неосложненным течением беременности и родов, во 2-ю - 10 женщин с асимметричной формой ЗРП на фоне плацентарной недостаточности; 3-ю группу составили 12 пациенток, у которых беременность осложнилась гестозом средней степени тяжести. Тяжесть гестоза оценивали по шкале C. Goeke в модификации Г.М. Савельевой. По возрасту, индексу массы тела, числу беременностей и родов в анамнезе, экстрагенитальной и гинекологической патологии обследуемые группы беременных были сопоставимы. Критериями исключения из исследования являлись декомпенсированные формы соматических заболеваний, тяжелые формы гестоза, антенатальная гибель плода, отсутствие информированного согласия женщины участвовать в исследовании. Материалом для исследования служили околоплодные воды, взятые при физиологической беременности и ЗРП во II триместре (23-26 нед) путем трансабдоминального амниоцентеза по акушерским показаниям и при вскрытии плодного пузыря в первом периоде родов (39-40 нед).

Все пациентки наблюдались в женской консультации по месту жительства и в консультативной поликлинике Ростовского НИИАП по программе «Акушерский мониторинг», предусматривающей расширенный протокол обследования во время беременности. Все пациентки были родоразрешены в родильном отделении института.

Протеомные карты амниотической жидкости получали с помощью двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле [15] по двум параметрам - электрическому заряду (IPG-стрипы pH 3-10, прибор Protean IEF Cell) и молекулярной массе (8-16% гель, прибор Protean II xi Multi-Cell). После завершения второго направления электрофореза для визуализации белковых пятен в гелях фореграммы окрашивали азотнокислым серебром, сканировали и анализировали с использованием пакета программ PDQuest. Идентификацию белков после вырезания пятен из геля и процедуры трипсинолиза проводили методом времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS) на масс-спектрометре Autoflex II с использованием программы Mascot MS Search и баз данных NCBI и Swiss-Prot.

Сравнительный анализ протеомных карт осуществляли по виртуальным интегрированным «мастер-гелям» двухмерных электрофореграмм (программа PDQuest) амниотической жидкости. Статистическую обработку данных осуществляли с использованием лицензионного пакета программ Statistica (версия 6.0. фирмы StatSoft. Jnc.) и Excel 2002. Достоверность различий между сравниваемыми группами для каждого белка отличия определяли с помощью критерия χ² и четырехпольных таблиц сопряженности, используемых при анализе качественных признаков.

Протеомные исследования выполнены на базе отдела молекулярной биологии Института аридных зон ЮНЦ РАН.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что протеомный профиль околоплодных вод при физиологической беременности характеризуется значительной гетерогенностью (см. рисунок),

В околоплодных водах женщин с ЗРП во II триместре беременности отсутствуют 7 белков, характерных для аналогичного периода нормальной беременности, в числе которых идентифицированы 3: связывающий жирные кислоты эпидермальный белок, участвующий в регуляции трансмембранных процессов и клеточной дифференцировки [7], неферментативный антиоксидант гаптоглобин и антиоксидантный фермент пероксиредоксин-2 (см. табл. 1). Можно полагать, что нарушение синтеза этих антиоксидантов способствует усилению окислительных процессов и развитию оксидантного стресса, имеющегося при ЗРП на фоне плацентарной недостаточности [5]. Остальные 4 белка не удалось идентифицировать в связи с их недостаточным количеством для достижения чувствительности используемого масс-спектрометра.

Наряду с отсутствием в околоплодных водах во II триместре при ЗРП вышеуказанных белков выявлено появление 10 белков, отсутствующих при физиологической беременности, из которых идентифицированы 3: гиппокальцин-подобный белок-1 (нейрокальцин дельта), CDC37-подобный белок, NKG2D лиганд-2. Появление этих регуляторных белков в околоплодных водах у женщин 2-й группы, по-видимому, имеет большое значение в механизмах развития данной патологии. Так, экспрессия NKG2D лиганда-2, усиливающего секрецию эмбриотоксических цитокинов, в частности фактора некроза опухолей, способна привести к активации апоптоза [8]. В то же время появление нейрокальцина дельта, участвующего в ингибировании нейронального апоптоза [10], можно рассматривать как компенсаторный процесс, предотвращающий переход апоптоза в апонекроз в структурах мозга плода. Аналогичную роль, по-видимому, играет появление CDC37-подобного белка, который контролирует смену фаз клеточного цикла и поддерживает пролиферацию [11].

В околоплодных водах, взятых при ЗРП во время родов, количество дополнительных белков по сравнению с таковым во II триместре беременности снижается в 2 раза. Из 5 появившихся белков идентифицированы 2 - NKG2D лиганд-2 и CDC37-подобный белок, которые обнаруживаются при ЗРП и во II триместре. Что касается нейрокальцина дельта, то этот регуляторный белок в отличие от II триместра отсутствует в конце беременности в околоплодных водах женщин 2-й группы. Количество отсутствующих белков к моменту родов, напротив, превышает их число в предыдущем триместре. Кроме вышеуказанных белков отличия II триместра, к их числу относятся транстиретин, кальгранулины А и B, которые и в конце гестации при ЗРП не секретируются в околоплодные воды, хотя в нормальном спектре они в этот период обнаруживаются.

Протеомный анализ околоплодных вод при беременности, осложнившейся гестозом, выявил отсутствие 10 белков, из которых идентифицированы 5: НАДФН-зависимая карбонилредуктаза-3, эпидермальный белок, связывающий жирные кислоты, гаптоглобин, кальгранулины А и B (табл. 2).

При анализе результатов исследования околоплодных вод, взятых во время родов, у женщин 2-й и 3-й групп обнаруживаются как общие изменения протеомного спектра по сравнению с таковым при физиологической беременности (отсутствие эпидермального белка, связывающего жирные кислоты, гаптоглобина, кальгранулинов А и B), так и отличия: появление при ЗРП ряда белков, отсутствующих при гестозе, в их числе НАДФН-зависимая карбонилредуктаза-3, CDC37-подобный белок, NKG2D лиганд-2. При беременности, осложнившейся гестозом, появляются белки, не выявленные при ЗРП: пероксиредоксин-2, транстиретин, С-участок каппа-цепи иммуноглобулина, белок-1, содержащий AIG2-подобный домен, супрессор-1 метастазирования рака молочной железы.

Резюмируя полученные данные, можно заключить, что развитие осложненной беременности происходит на фоне изменения продукции белков, участвующих в регуляции апоптоза, клеточной дифференцировки и пролиферации, мембранного транспорта, поддержания про- и антиоксидантного баланса и других важных биологических процессов. Эти изменения, по-видимому, имеют патогенетическое значение в формировании осложнений беременности. Различие в протеомных спектрах, очевидно, определяет специфику развития акушерской патологии.

Таким образом, проведенные нами исследования расширяют представления о молекулярных механизмах развития ЗРП и гестоза, занимающих лидирующее место в структуре материнской и перинатальной заболеваемости. Выявленные белки отличия околоплодных вод могут быть использованы в качестве информативных маркеров акушерской патологии.

1. Протеомный спектр околоплодных вод при акушерской патологии отличается от такового при физиологической беременности, причем разные осложнения гестации характеризуются определенной спецификой изменений.

2. В околоплодных водах при ЗРП выявлены и идентифицированы белки отличия, отсутствующие в разные периоды неосложненной беременности: нейрокальцин дельта (во II триместре), CDC37-подобный белок и NKG2D лиганд-2 (во II и III триместрах). К числу белков, не обнаруженных при ЗРП, в отличие от физиологической беременности, относятся кальгранулины А и В, транстиретин (в III триместре), гаптоглобин, пероксиредоксин-2 и эпидермальный белок, связывающий жирные кислоты (во II и III триместрах).

3. В протеомном профиле амниотической жидкости при гестозе появляются 3 белка: С-участок каппа-цепи иммуноглобулина, белок-1, содержащий AIG2-подобный домен, супрессор-1 метастазирования рака молочной железы. В числе идентифицированных отсутствующих белков при гестозе - НАДФН-зависимая карбонилредуктаза-3, эпидермальный белок, связывающий жирные кислоты, гаптоглобин, кальгранулины А и В.

4. При задержке роста плода в околоплодных водах, взятых в родах, отсутствуют 5 белков, обнаруженных при гестозе: пероксиредоксин-2, транстиретин, С-участок каппа-цепи иммуноглобулина, белок-1, содержащий AIG2-подобный домен, супрессор-1 метастазирования рака молочной железы.

5. В околоплодных водах при гестозе отсутствуют 3 белка, присутствующих при задержке роста плода: НАДФН-зависимая карбонилредуктаза-3, CDC37-подобный белок, NKG2D лиганд-2.