Одним из актуальных вопросов эстетической стоматологии является закрытие рецессии десны. Современные методы устранения этой патологии ограничены только хирургическими, травматичными для пациента вмешательствами, которые далеко не во всех случаях позволяют получить стабильный результат [1—5].

Успехи терапевтического клонирования, тканевой инженерии, изучения стволовых/дифференцированных клеток послужили поводом для разработки новых подходов к восстановлению объемов прикрепленной десны, основная задача которых — замещение или восстановление утраченных тканей посредством трансплантации выращенных

Цель настоящего исследования — оценка клинической эффективности применения аутоФС СОПР человека для устранения рецессий десны, восстановления утраченных межзубных десневых сосочков и увеличения объема десны при тонком ее биотипе.

Обследовано 120 участков пародонта у 20 пациентов (16 женщин, 4 мужчины в возрасте 20—45 лет). Участки пародонта разделили на 2 группы: 1) в области имплантатов (18 и 2) в области зубов с рецессиями десны, развившимися в результате лечения хронического пародонтита (102).

Период клинического наблюдения — от 1 нед до 9 мес. Для определения оптимального количества аутоФС, вводимых в мягкие ткани краевого пародонта, изучали концентрации от 2·10⁶ до 10·10⁶ клеток в 0,2 мл физиологического раствора для инъекций. Критерием клинической эффективности служило уменьшение величины рецессии и увеличение толщины десны.

Клинические индексы:

— оценка величины рецессии десны по Miller, 1985;

— индекс гигиены полости рта по Silness-Loe, 1962.

Лабораторные методы:

— оптическая когерентная томография (ОКТ) (изучение плотностных характеристик и микроструктуры десны [2, 3] — оптический когерентный томограф, Институт прикладной физики РАН, Нижний Новгород;

— автоматизированная компьютерная диагностическая система «Florida Probe», США (изучение метрических параметров десны);

— фотометрия исследуемых участков десны (с использованием цифрового фотоаппарата «Canon PowerShot G5» и мерной сетки, стандартное увеличение 1:1);

— параметры регистрации: толщина десны, высота межзубных десневых сосочков, величина рецессии десны.

Определение иммунофенотипа клеток с помощью проточной флуориметрии и флюоресцентного окрашивания

Клеточные суспензии ФС анализировали на проточном цитометре FACS Canto™ II с программным обеспечением «FACSDiva™» («Becton Dickinson», США). В работе использовали мышиные моноклональные антитела фирмы «BD Pharmingen» (США) к маркерам гемопоэтических (CD34, CD45), мезенхимных (CD73, CD90, CD105) и эпителиальных клеток (панцитокератины 14, 15, 16 и 19).

Экспрессию маркеров ФС — коллагена I, III типов, эластина («Abcam», Великобритания) — определяли посредством иммунофлюоресцентного анализа с использованием первичных моноклональных антител и вторичных антивидовых антител, меченных родамином, при помощи микроскопа Axioplan™ 200 с камерой «Axiocam™ HRm» и программного обеспечения «AxioVision™» («Carl Zeiss», Германия).

Оценка стабильности генетического аппарата культуры ФС человека

Получение препаратов хромосом

Для получения хромосом ФС использовали митотически обогащенную фракцию клеток, находящихся в фазе логарифмического роста. После часового гипотонического шока 50 мМ КС1 ФС, находящиеся в стадии митоза, собирали и фиксировали раствором метанола и уксусной кислоты, после чего наносили на охлажденные предметные стекла и высушивали.

Дифференциальное окрашивание препаратов хромосом, GTG-метод

Препараты хромосом обрабатывали 0,25% раствором трипсина в течение 7 мин и окрашивали по Гимзе. Анализу подвергались хромосомы не менее 20—25 метафазных четко визуализируемых пластин.

Оценка онкобезопасности трансплантированных ФС

Для оценки онкобезопасности ФС использовали стандартную модель формирования опухолей под кожей у бестимусных мышей (n=30) линии NUDE balb/C с подкожным введением 100 мкл суспензии ФС (3·10⁶ клеток).

Тестирование на исключение инфекционных агентов

Клеточный материал тестировали стандартизированными методами на исключение вирусных, бактериальных и грибковых инфекционных агентов.

Определение жизнеспособности трансплантируемых ФС (in vivo)

Жизнеспособность трансплантируемых клеток изучали на бестимусных мышах (n=10) линии NUDE balb/C после внутрикожного введения фибробластов десны человека, экспрессирующих флюоресцентный белок GFP (Green Fluorescent Protein), введенный в клетки посредством генно-инженерной конструкции (срок наблюдения — 4 мес), и на новозеландских кроликах (n=5) после введения в десну аутоФС, экспрессирующих флюоресцентный белок GF, введенный в клетки посредством генно-инженерной конструкции (срок наблюдения — 6 мес).

В первом случае проводили флюоресцентный анализ живых клеток человека на тотальном препарате только что извлеченного биоптата (тотальный срез), во 2-м — иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов десны кролика с использованием специфических к GFP белку антител.

Для определения кратности оценивали результаты одно-, двух- и трехкратного введения культивированных аутоФС в концентрации 2—5·10⁶ клеток в 0,2 мл физиологического раствора для инъекций. Оценивали также интервалы между инъекциями: 1 раз в 9 мес и 1 раз в 1 нед в течение 3 нед.

Биопсию СОПР проводили при отсутствии у пациентов противопоказаний, в том числе инфекционных и онкологических заболеваний, аутоиммунных заболеваний соединительной ткани, острых и хронических (в стадии обострения) заболеваний пародонта. Биоптат брали под местным обезболиванием ультракаином из твердого неба или со стороны преддверия полости рта (рис. 1, см. на цв. вклейке).

Выделенные посредством ферментативной обработки коллагеназой II фибробласты культивировали в условиях GMP лаборатории в течение 4—6 нед, используя среду DMEM Hyclone («Thermo Scientific», США) с добавлением 10—15% сыворотки человека. После получения необходимого количества клеток часть из них криоконсервировали для хранения в криобанке.

Для обеспечения оптимальной жизнеспособности фибробластов клеточный материал использовали в течение 24 ч с момента приготовления суспензии. До использования клеточный материал хранили при температуре +4—8 °С.

Перед трансплантацией в десну клеточный материал ресуспендировали для получения гомогенной суспензии. АутоФС вводили в соединительнотканный слой слизистой оболочки десны, прилежащей к шейке зуба, и/или в межзубные десневые сосочки (рис. 2, см. на цв. вклейке).

Критериями эффективности введения клеточного материала в ткань десны служили напряжение тканей десны и перифокальное побледнение слизистой оболочки в месте инъекции.

Графические и аналитические показатели, их средние величины и средние ошибки обрабатывали статистически посредством MS Excel 2010 (Microsoft Inc.). Для проведения статистических расчетов использовали уровень значимости р<0,05 инъекции.

При культивировании клеток были получены популяции адгезивных клеток, имеющих фибробласт-подобную морфологию. Методом проточной цитофлуориметрии полученные клетки исследованы на экспрессию маркеров мезенхимных (рис. 3, см. на цв. вклейке, а),

При исследовании онкобезопасности применяемых ФС, проведенном на иммунодефицитных мышах, в месте введения ФС новообразования не выявлены.

При изучении жизнеспособности ФС, проведенном как на мышах (рис. 4, см. на цв. вклейке, а),

Цитогенетический анализ аутоФС на разных пассажах (от 1-го до 10-го), основанный на дифференциальной окраске хромосом, показал, что хромосомный аппарат остается стабильным на всех изученных пассажах культивирования клеток.

В течение всего периода наблюдения цвет десны (бледно-розовый) не отличался от такового у окружающих тканей полости рта. Симптомов воспаления десны, гиперемии, кровоточивости не отмечено. Не выявлено ни одного случая системных (анафилактическая реакция, реакция «трансплантат против хозяина» и т.п.) или местных побочных реакций (гематомы, инфекционные осложнения).

Динамика гигиенического состояния была предсказуемой и закономерной в обеих группах пациентов, уровень гигиены оставался стабильным на протяжении всего срока наблюдения; среднее значение индекса Силнесса —Лоэ — 0,6±0,1.

Клинический эффект, заключающийся в увеличении толщины десны, увеличении высоты межзубных десневых сосочков, уменьшении рецессии десны, отмечали со 2-го месяца после трансплантации аутоФС. Эффект сохранялся на протяжении не менее 9 мес (рис. 5—8, см. на цв. вклейке).

Оценка эффективности влияния разных доз аутоФС на состояние краевой и прикрепленной десны

При использовании суспензий концентраций клеток от 2·10⁶ до 10·10⁶ отметили трудность аспирации содержимого пробирок с клеточным материалом в дозах 8·10⁶ и 10·10⁶ аутоФС в 0,2 мл физиологического раствора (объем, оптимальный для введения в десну) в шприц, связанную с невозможностью получить гомогенную суспензию. По этой причине данные дозы клеточного материала были исключены из исследования.

Результаты, полученные посредством ОКТ-исследования, показали отсутствие различий в выраженности клинического эффекта при введении аутоФС в диапазоне концентраций от 2·10⁶ до 5·10⁶ в 0,2 мл физиологического раствора для инъекций.

Динамика изменения глубины десневых карманов и рецессий десны

Для замера глубины десневых карманов и рецессии исследуемых зубов использовали автоматизированную компьютерную диагностическую систему Florida Probeе [4].

На рис. 9 (см. на цв. вклейке)

Похожая динамика рецессии десны выявлена и в периимплантатных тканях (рис. 10, см. на цв. вклейке).

После трехкратного введения аутоФС с интервалом в 1 нед (рис. 11, см. на цв. вклейке)

Динамика плотностных характеристик и микроструктуры десны. При оценке микроструктуры десны с помощью ОКТ до введения клеток изображение слизистой оболочки прикрепленной части десны характеризовалось отсутствием слоистой структуры, наличием едва заметной границы между эпителиальным слоем и собственной базальной пластинкой слизистой оболочки (рис. 12, см. на цв. вклейке, а).

После введения аутоФС в слизистую оболочку десны в обеих исследуемых группах отмечено нарастающее со временем увеличение контрастности изображения, появление слоистости структуры, увеличение толщины эпителиального слоя и собственной пластинки десны (см. рис. 12 б, в,г).

Традиционный подход к увеличению объема мягких тканей пародонта состоит в инвазивных хирургических вмешательствах, связанных со значительной травмой тканей [1]. Зачастую для получения удовлетворительных результатов возникает необходимость в проведении повторных операций [2, 3], и поэтому поиск инновационных атравматичных методов устранения рецессии десны со стабильным клиническим эффектом чрезвычайно актуален. В этой связи основная цель настоящего исследования — разработка метода, лишенного указанных недостатков. Так, для получения аутоФС, применение которых лежит в основе данного метода, требуется лишь незначительная по объему хирургическая биопсия СОПР. Небольшой биоптат (1,5 мм2) позволяет не только получить препарат для трансплантации, но и создать криобанк аутоФС пациента, что дает возможность в случае необходимости многократно производить клеточный препарат. Введение же клеточного материала в десну, окружающую рецессию, осуществляется посредством простой и практически безболезненной инъекции.

В основе метода лежит способность главного клеточного компонента соединительной ткани десны — ФС — продуцировать коллаген и другие компоненты (МКМ). Известно, что соединительнотканная пластинка десны наряду с другими компонентами МКМ представлена волоконным каркасом, на 60% состоящим из коллагеновых волокон, обеспечивающих прочность соединительной ткани и участвующих в формировании и поддержании ее специфической структуры.

Иммунофенотипическое исследование применяемых культур аутоФС продемонстрировало высокую экспрессию ими коллагенов I, III типов и эластина, что свидетельствует о высокой синтетической активности клеток. После трансплантации в соединительную ткань синтетическая активность культивированных аутоФС сохраняется в течение длительного времени (не менее 6 мес).

Изучение жизнеспособности трансплантируемых клеток, проведенное на мышах после внутрикожного введения фибробластов десны человека и на кроликах после введения в десну аутоФС, выявило, что в зоне трансплантации на всем сроке наблюдения определяются клетки, экспрессирующие флюоресцентный белок GFP. Это позволяет заключить, что жизнеспособность трансплантируемых фибробластов сохраняется не менее 6 мес, что согласуется с данными других исследователей [5].

Основной целью настоящего исследования явилась оценка безопасности и клинической эффективности применения аутоФС для устранения дефектов десны. Так, доклинические исследования, проведенные на иммунодефицитных мышах (Nude), которым внутрикожно вводили по 10⁶ ФС десны человека (срок наблюдения — 4 мес), продемонстрировали отсутствие каких-либо неопластических процессов и других побочных реакций системного и местного характера. При изучении жизнеспособности применяемых клеток также не было выявлено у экспериментальных животных каких-либо побочных реакций.

Клинические исследования, проведенные на 2 группах пациентов с рецессиями десны вследствие лечения хронического пародонтита или проведения имплантологических вмешательств, показали, что параметры рецессии десны, полученные посредством компьютерной диагностической системы Florida Probe характеризовались прогрессирующим со временем статистически достоверным уменьшением рецессии: через 1 мес в среднем на 1 мм, через 3 мес — на 2 мм, через 6 мес — на 2,2 мм, которое сохранялось до 9 мес. При этом показано (см. рис. 5, б), что трансплантация аутоФС сопровождается изменением фенотипа десны: через 3 мес в участках с рецессиями десны отмечается формирование «искусственной борозды» глубиной, равной величине прироста тканей, — 2 мм. В последующий период наблюдения эти значения не изменялись.

Увеличение толщины десны после трансплантации аутоФС было также выявлено с помощью ОКТ. Так, после введения фибробластов в десну отмечено появление нарастающей со временем контрастности изображения, выраженной слоистости структуры, увеличение толщины как соединительнотканного, так и эпителиального слоев. Последнее согласуется с данными Т. Karring и соавт., которые еще в 1978 г. показали значительное влияние на дифференцирование эпителия десны компонентов подлежащей соединительной ткани [6].

Таким образом, использование инструментальных методов исследования продемонстрировало, что после трансплантации в десну аутоФС наблюдается статистически достоверный прирост тканей десны, максимальная величина которого в среднем 2,2 мм. Клинически данный прирост тканей проявляется увеличением толщины десны и десневых сосочков, уменьшением рецессии десны. При этом следует отметить, что ни в одном случае трансплантации аутоФС у пациентов не было выявлено побочных реакций ни местного, ни системного характера.

Вторичные цели данного исследования состояли в оптимизации количества клеточного препарата и кратности его введения. Согласно полученным данным, удалось определить, что оптимально введение 2—5·10⁶ аутоФС в 0,2 мл физиологического раствора для инъекций. Оптимальная кратность введения клеточного материала трижды с интервалом в 1 нед. Это согласуется с данными зарубежных исследователей, которые также продемонстрировали оптимальный клинический эффект после трехкратного введения 2—5·10⁶ клеток.

Проведенное исследование позволяет заключить, что:

— метод трансплантации в десну аутоФС для устранения рецессии и дефицита десны клинически эффективен и безопасен;

— инъекционное введение аутоФС способствует увеличению объема мягких тканей в месте введения клеток и позволяет уменьшить или устранить рецессию десны, развившуюся после проведения пародонтологического лечения и имплантологических вмешательств;

— оптимальным (с позиции как инъекционного введения в десну, так и выраженности клинического эффекта) является введение в десну 2·10⁶—5·10⁶ клеток в 0,2 мл физиологического раствора;

— максимальный прирост ткани в среднем — 2,2 мм, отмечается после трехкратного (с интервалом в 1 нед) введения аутоФС в десну, прилежащую к шейке зуба, и/или в межзубные десневые сосочки.

Таким образом, можно полагать, что данная атравматичная и эффективная инновационная технология (разрешение Росздравнадзора РФ ФС №2010/419 от 09.12.10) [7] позволит существенно расширить арсенал способов устранения рецессии и дефицита десны, обеспечив как эстетику зубного ряда, так и профилактику воспалительных процессов в области шейки зуба.