По данным отчета Европейского союза по нанотехнологиям, мировой рынок биоматериалов (речь идет не только о материалах для восстановления кости) достиг в 2009 г. 47 млрд долларов и по прогнозам, увеличится до 113 млрд к 2025 г. [8]. Рост потребности в новых костезамещающих биоматериалах для травматологии, челюстно-лицевой хирургии и стоматологии обусловлен тем, что ежегодно в мире проводится около 4 млн операций с использованием костных трансплантатов и остеопластических материалов [5].

Научные исследования по созданию биоматериала, приближающегося по своим свойствам к аутологичной кости, ведутся активно, о чем свидетельствует значительный объем отечественных и иностранных публикаций по данному вопросу. Так, в научной электронной библиотеке www. e-library.ru по ключевым словам «костный материал» можно найти 25 412 источников (статьи, патенты), при поиске в базе www.sciencedirect.com по ключевым словам «bone material» — 465 996 источников, «bone substitute material» — 32 208; аналогичный поиск в базе www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed дает результат по «bone material» 23 235 источников, «bone substitute material» — 2919.

Несмотря на наличие большого количества разных костезамещающих материалов, де-факто аутологичные костные трансплантаты остаются «золотым стандартом», так как только аутотрансплантаты содержат 3 основных компонента, обеспечивающих их свойства: нативный костный матрикс, костные клетки и набор костных цитокинов. Однако проблемы, сопутствующие применению аутотрансплантантов, — травматичность операций и невозможность восстановления больших объемов костной ткани заставляют ученых и клиницистов разрабатывать более совершенные технологии, которые, по их мнению, станут новым «золотым стандартом».

Наиболее перспективным кандидатом на эту роль могут стать костные имплантаты (КИ) ортотопической формы с органотипичным, характерным для костной ткани строением. Основные преимущества подобных КИ — прежде всего отсутствие необходимости в дополнительном хирургическом вмешательстве по забору костного аутотрансплантата, возможность их моделирования так, чтобы они в точности соответствовали по форме корректируемому дефекту, высокие матриксные свойства, обеспечивающие биорезорбируемость и остеокондуктивность, соответствие по химическому составу минеральной компоненте кости и отсутствие антигенных свойств, что обеспечит иммунологическую инертность.

К созданию таких КИ ученых приблизили технологии объемного прототипирования или 3D-печати, позволяющие создавать индивидуальные по форме К.И. Методологическая концепция создания КИ включает в себя следующие этапы: компьютерное моделирование на основе данных компьютерной томографии (КТ) цифровых моделей челюстей в специальном программном обеспечении; моделирование индивидуального имплантата, замещающего дефект костной ткани у пациента (рис. 1—3 и далее см. на цветной вклейке); прочностные расчеты биоинженерной конструкции, 3D-печать спроектированного имплантата.

Для 3D-прототипирования КИ можно использовать следующие методы:

— лазерную cтереолитографию (Stereo Lithography Apparatus — 3D-Systems, «F&S Stereolithographietechnik GmbH», Институт проблем лазерных и информационных технологий РАН);

— технологию лазерного спекания (Selective Laser Sintering — 3D-Systems, «F&S Stereolithographietechnik GmbH», «The ExOne Company/Prometal, EOS GmbH»);

— технологию послойного моделирования (Fused Deposition Modeling — «Stratasys Inc.»);

— технологию струйного моделирования (Ink Jet Modelling — 3D-Systems, «Objet Geometries Ltd.», «Solidscape, Inc.»);

— технологию склеивания порошков (Binding powder by adhesives, «Z Corporation»).

Подробно современные технологии 3D-печати костезамещающих материалов описаны нами ранее [4]. Аналогичный подход с созданием цифровых моделей и последующей 3D-печатью используется также при моделировании индивидуальных имплантатов для контурной пластики [2].

Помимо создания индивидуальной формы имплантата, объемное прототипирование позволяет достигать заданной канальности, пористости и в определенной мере микроструктуры имплантата (что больше зависит от материала, из которого печатается имплантат, и последующей обработки). Крупные, и средние микроканалы обеспечивают прорастание сосудов в имплантат и заселение его живыми клетками, что в конечном счете ведет к его интеграции с окружающими тканями. Текстура поверхности и микропористость являются ключевыми для миграции, прикрепления, пролиферации и дифференцировки костных клеток-предшественников. Эти матриксные свойства и химический состав материала в конечном счете влияют на скорость резорбции имплантата и замещение его живой костной тканью. Все это свидетельствует о том, что технологии 3D-печати приблизили ученых к созданию КИ.

В настоящее время известно несколько белковых молекул, способных существенно модулировать процесс костной регенерации. Это, например, такие факторы, как фактор роста эндотелия сосудов — ФРЭС (англ. VEGF, Vascular endothelial growth factor), костные морфогенетические белки (англ. BMP — bone morphogenetic protein). Ранее нами было показано, что введение ФРЭС в состав костезамещающих материалов может существенно модулировать процессы репаративной регенерации костной ткани благодаря формированию развитого микрососудистого русла [3]. Очевидно, что в будущем именно такие сложные композитные КИ смогут претендовать на роль нового «золотого стандарта» для костной пластики.

Оптимальным с точки зрения установки дентальных имплантатов и дальнейшей функциональной нагрузки является II тип строения кости (Lekholm и Zarb, 1985). Он характеризуется наличием выраженного компактного кортикального слоя снаружи и мелкоячеистого губчатого слоя, расположенного внутри. Поэтому речь идет не просто о восстановлении альвеолярной кости, а о биоинженерии костного органа, фрагмента челюсти. Этого можно добиться методами объемного прототипирования КИ оргнанотипичного строения, имеющего структуру кортикального и губчатого слоев за счет их разной плотности, а также дифференцированного насыщению этих слоев цитокинами. На данном этапе методы компьютерного моделирования достигли достаточного развития и позволяют создавать модели КИ для восстановления альвеолярной кости. Нами отработана технология изготовления анатомических имплантатов сложной формы на основе данных компьютерного моделирования (рис. 4, 5).

Описанные технологии создания сложных КИ пока находятся на доклинических стадиях разработки. Однако именно в хирургической стоматологии одна из технологий 3D-печати вплотную приблизилась к практическому клиническому внедрению. Речь идет о печати каркасных изолирующих мембран.

Использование биодеградируемых полимеров для изготовления каркасных мембран методом 3D-печати позволяет получить качественно новый продукт, обладающий преимуществами нерезорбируемых каркасов, — прочностью и стабильностью — и при этом подвергающийся биодеструкции со скоростью, соответствующей таковой при формировании костного регенерата. Поскольку такие мембраны могут изготавливаться индивидуально для каждого пациента на основе данных КТ, не возникает проблемы с адаптацией их формы в области костной реконструкции, что сокращает время операции и снижает ее травматичность. Постепенная резорбция мембраны избавляет от необходимости удаления.

Для изготовления прототипов КИ сложной формы авторами разработан метод комбинированной 3D-печати на основе биосовместимых пластиков (PLA, PLA/GLY) и пасты с гидроксиапатитом (ГА). Для этого проведена модификация 3D-принтера Engineer V2 (Printers3d.ru, Россия). В его состав введен дополнительный экструдер для печати пастой на основе альгината натрия и Г.А. Это позволило печатать внешнюю форму и внутреннюю структуру (каналы и поры) имплантата 1-м экструдером из полимерного стренга (полимолочной кислоты); 2-й экструдер заполняет внутреннее пространство имплантата пастой.

Авторами получены прутки (стренги) для 3D-печати на основе полимолочной кислоты. Данный полимер был выбран в качестве основы КИ, так как его прочностные характеристики близки к костной ткани: модуль Юнга полилактида составляет 3,5 ГПа, губчатой кости — 1,5—3 ГПа, кортикальной кости — 12—18 ГПа. В работе использовалась полимолочная кислота марки 4032D производства компании «NatureWorks» (США).

Пасту изготавливали на основе альгината натрия («Sigma-Аldrich», США). Альгинат натрия был выбран в качестве основы, так как, по данным литературы, он может использоваться в качестве носителя факторов роста и детерминированных костных стволовых клеток, что в перспективе позволит наделять КИ не только остеокондуктивными, но и остеоиндуктивными и остеогенными свойствами. В пасту включали ГА, который служит основным остеокондуктивным материалом.

Наноразмерный ГА получали в условиях механоакустической активации реакции ионного обмена между диаммоний фосфатом и нитратом кальция. Механоакустическая активация обменной реакции позволяет успешно контролировать размерность частиц образующегося ГА, частицы которого имеют средний диаметр 20 нм. Массовая доля таких частиц в реакционной среде — 90%. Очистка Г.А. от примеси побочного продукта — нитрата аммония — проводилась последовательной промывкой водой. Следует отметить изменение во времени дисперсности ГА, очищенного от побочных продуктов реакции. Это изменение направлено в сторону укрупнения частиц дисперсной фазы. На агрегативную неустойчивость нанодисперсии указывает найденное для нее значение дзета-потенциала, составляющее около 5 мВ.

Все компоненты и полученные их них изделия проверяли на цитотоксичность в отношении культуры клеток мышиных фибробластов линии Balb/NIH 3Т3 методом прямого контакта in vitro. Исследование проводили согласно ГОСТ Р ИСО 10993—5—2009 «Оценка биологического действия медицинских изделий». Клетки культивировали в стандартных условиях, высевали в лунки и инкубировали с исследуемыми материалами. Цитотоксическое влияние оценивали визуально, используя инвертированный микроскоп при постановке пролиферативного теста с применением реагента Cell Titer 96 AQ_ueous One Solution Cell Proliferation Assay (метод MTS) через 24 ч.

С применением модифицированного 3D-принтера Engineer V2 (Printers3d.ru, Россия), работающего по принципу послойного моделирования расплавленным полимером и пастой, были изготовлены образцы каркасных изолирующих мембран и КИ для их исследования in vivo на модели животного.

На рис. 6 представлены этапы компьютерного моделирования индивидуализированной каркасной мембраны и изготовленный образец. Толщина мембраны составляет 0,3—0,5 мм.

На рис. 7 приведены этапы изготовления КИ для замещения сегментарного дефекта НЧ на модели мини-свиньи. Изготовленный имплантат имел внутреннюю пористость 2×2 мм и центральный разветвленный канал для кровеносных сосудов диаметром 3 мм, соединяющийся с внутренними порами. Цитотоксичность произвольно взятых фрагментов полученных изделий составила 0 (не цитотоксично; шкала цитотоксичности — от 0 до 3, где 0 — не цитотоксично, 3— значительная цитотоксичность.

3D-технологии изготовления КИ находятся на стадии становления. Первой и единственной компанией, которая получила разрешение Food and Drug Administration — FDA (агентство Министерства здравоохранения и социальных служб США) применять в клинической практике индивидуальные КИ, изготовленные методом 3D-прото-типирования, является Oxford Performance Materials, Inc. (OPM) [13]. В России имеется зарегистрированная и разрешенная к клиническому применению технология производства индивидуальных накостных имплантатов для контурной пластики из политетрафторэтилена, однако материалы данного класса относятся к биоинертным и не замещаются костной тканью [2].

Над производством КИ работают ряд компаний. Cyfuse Biomedical разработала 3D-принтер Regenova. Технология заключается в «сборке» клеточных сфероидов, состоящих из тысяч клеток с помощью тонких игл. После расположения сфероидов в определенном порядке у них появляется склонность к росту и организации, и в конечном счете образуется живая ткань. Уже сейчас компания может создавать кровеносные сосуды, органы пищеварительной и мочевой системы, хрящевую ткань и даже миниатюрную печень (www.cyfusebio.com). FDM-3D-принтер компании «Rokit» (Южная Корея) имеет возможность печатать костные структуры из биосовестимой керамики (www.rokit.co.kr).

3Dynamic Systems Ltd. (3DS) разработала собственную платформу для печати костной ткани индивидуальной формы на основе полимеров и биосовместимых композитов, которые можно насыщать клетками и факторами роста (www.bioprintingsystems.com).

Полученная нами внутренняя структура КИ соответствует описанной в литературе. Так, в работе [12] подчеркивается, что костные матриксы должны иметь открытые и соединенные между собой поры, позволяющие клеткам врастать и обеспечивать необходимое пространство для неоваскуляризации. Необходимый размер пор все еще обсуждается. Приводятся различные «оптимальные» значения диаметра пор — от 200 до 500 нм [9, 11]. Длина пор также является критическим параметром, так как проблема недостаточного костного роста внутрь матрикса встречается и описана [10].

Как показано в работах [6, 7], кровоснабжение КИ, особенно при восстановлении сегментарных дефектов костей, например нижней челюсти, играет критическую роль. Поэтому формирование внутреннего канала в КИ для прорастания питающего сосуда или прокладка сосудистого анастомоза внутри данного канала микрохирургическим методом — обязательные условия успешной тканевой интеграции всего КИ.

Несмотря на наличие на рынке большого количества современных, в том числе и многокомпонентных, материалов, многие вопросы 3D-печати КИ не решены: выбор материала для 3D-печати; выбор самого метода прототипирования (послойное наплавление, стереолитография, робокастинг, прямая керамическая печать и т. д.); обработка и модификация имплантата после прототипирования; стерилизация и многое другое; насыщение клетками и факторами роста. Только насыщение цитокинами и факторами роста, о которых шла речь выше, позволит получить материал, оптимальный для восстановления кости любого типа. В настоящее время это научное направление является приоритетным в разработке новых костезамещающих материалов.

Итак, внедрение технологии 3D-печати в изготовление КИ представляет собой проявление принципа «положительной обратной связи» — почти обязательного условия всех крупных преобразований, происходящих в природе [1]. Данный механизм заключается в том, что усложнение системы ведет к конфликту, снятие которого возможно только путем дальнейшего ее усложнения. Потребуются дальнейшие усложнения технологического процесса производства этих имплантатов, но уже с новыми биологическими свойствами. В этой ситуации неизбежна интеграция разработчиков КИ со специалистами в области современных клеточных технологий, молекулярными биологами, генными инженерами и биотехнологами.

Таким образом, нами показана возможность 3D-печати с использованием биодеградируемого полимерного материала и минеральной кальций фосфатной компоненты при создании КИ, изолирующих и целиком восполняющих костный дефект. Можно с уверенностью сказать, что изготовление описанных выше КИ методами 3D-прототипирования для сложной объемной реконструкции альвеолярной кости технически осуществимо, может быть выполнено в условиях мелкосерийного производства и осуществлено по индивидуальному заказу. Использование индивидуальных каркасных мембран позволит улучшить результаты костной пластики, снизить травматичность операций и оптимизировать сроки лечения. В рамках дальнейшей практической реализации данной технологии следует ожидать совершенствования и усложнения технологий 3D-биопечати и их интеграцию с достижениями молекулярной биологии и тканевой инженерии.

Работа выполнялась при финансовой поддержке РФФИ Проект № 15−29−04862.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.