Согласно глобальному исследованию, кариес зубов занимает первое место по распространенности и второе — по заболеваемости среди всех болезней, которыми подвержен человек [1]. В настоящее время 1,8 млрд человек ежегодно впервые поражаются кариесом зуба. При этом распространенность кариеса среди детей неуклонно растет [2, 3]. Наряду с постоянным ростом стоимости реставрационного пломбирования зубов такие тенденции создают дополнительную нагрузку на системы здравоохранения стран всего мира, и без того находящиеся под существенным давлением от новых видов болезней.

Причиной развития кариеса служит потеря зубной тканью минеральных компонент ввиду сдвигов в составе и функциональном профиле зубной биопленки, что вызвано изменениями в микробиоме [4—7]. Кроме того, особенности структуры зубной биопленки могут влиять не только на развитие кариеса, но и на заболевания пародонта [8]. В последние годы особый интерес ученых был направлен не только на изучение вариаций в составе зубной биопленки в норме и при развитии различных заболеваний, но также на эволюции их молекулярной структуры при различных способах воздействия (модуляции) на них извне. Одними из видов таких модуляций являются экзо/эндогенные методы профилактики и использование таблетированных лекарственных средств [6, 9, 10]. Однако выявление и распознавание изменений в молекулярной структуре зубной биопленки на начальной стадии развития кариеса является непростой задачей. Тем не менее она может быть успешно решена за счет использования спектроскопических методов молекулярной идентификации. Так, методы колебательной Фурье-микроспектроскопии в инфракрасной области (ИК) позволяют получить уникальную информацию о молекулярных превращениях, происходящих не только в первичной, но и во вторичной структуре белковой части биопленки [11—13]. В частности, анализ вторичной структуры методом ИК позволяет выделить специфические особенности в белковой фракции, несмотря на схожесть молекулярного состава входящих в нее различных белковых соединений [14—17]. Более того, определение вклада α-спирали (α-helix), β-листа (β-sheet), неупорядоченной структуры и других компонент при трансформации вторичной структуры позволяет выявить изменения в молекулах белков под действием определенных агентов или факторов [14, 15, 18].

Цель исследования — сравнительное изучение изменений во вторичной структуре белков биопленки зубов у людей с кариесогенным и кариесопротективным статусом с помощью синхротронной ИК-микроспектроскопии.

Материал и методы

В исследовании приняли участие 50 человек (мужчины и женщины в возрасте 18—25 лет) без соматической патологии и вредных привычек. Пациенты вели стандартный режим жизни, питаясь здоровой пищей, не принимали лекарственные препараты и не употребляли алкоголь. Участники эксперимента были разделены на 2 группы. В 1-ю группу включили 25 пациентов без выявленных клинически различимых кариозных поражений зубной ткани (ICDAS 0) [19]. У 25 участников 2-й группы во время осмотра были выявлены кариозные поражения эмали (ICDAS 1—2). В ходе обследования у всех участников исследования не выявлены признаки развития пародонтита или гингивита.

Образцы биопленки забирали в утреннее время до приема пищи с предварительной механической чисткой зубов и полосканием рта водой. По истечении 30 мин после подготовительных процедур биопленку аккуратно снимали с поверхности центральных резцов верхней челюсти пациента стерильным скальпелем, не касаясь десневого края. Образцы биопленки брали в два этапа. На первом этапе биопленка была взята в 1-й день исследования. Со 2-го дня исследования пациенты принимали таблетки, содержащие минеральный комплекс с глицерофосфатом кальция [20]. В соответствии с рекомендацией производителя участники эксперимента принимали по 1 таблетке 3 раза в день. На 4-й день биопленка была взята во второй раз (второй этап). После забора образцы биопленки не подвергались дополнительной обработке, каждый образец помещали в отдельный стерильный контейнер в исходном виде и хранили при температуре 4 °C без использования субстратов.

Для исследования молекулярной структуры образцов биопленки использовали ИК-микроспектроскопию («Австралийский синхротрон», Виктория, Австралия) и ИК-спектроскопию («Пхохан», Южная Корея). Высокочувствительный спектральный анализ был проведен на пучке IMBUIA накопительного кольца четвертого поколения Sirius в Бразильской лаборатории синхротронного излучения («Кампинас», Бразилия) с использованием ИК-микроскопа Agilent Cary 660. Все синхротронные ИК-спектры были записаны в спектральном диапазоне 2000—700 см^–1 со спектральным разрешением 4 см^–1. Дизайн исследования приведен на рис. 1.

Рис. 1. Дизайн исследования.

Результаты и обсуждение

Ранее многократно демонстрировалось, что для оценки изменений во вторичной структуре белков наиболее информативно использовать амидные полосы Amide I или Amide II, которые весьма чувствительны к конформационному окружению в этих структурах [14, 15]. Кроме того, важным преимуществом в изучении амидных полос является то, что они располагаются в той части спектрального диапазона, которая зачастую свободна от значительного поглощения фосфолипидами и даже более сложными молекулярными смесями, в том числе из состава бактериальных пленок [11]. Поэтому в текущей работе мы ограничимся анализом диапазона 1800—1480 см^–1, в котором расположен полный спектральный профиль полос Amide I и Amide II.

Трансформация спектрального профиля ИК-полос Amide I и Amide II связана в значимой мере с изменениями, происходящими во вторичной структуре белков, входящих в состав биопленки, а также с вкладом продуктов микробиоты, превалирующей с учетом наличия активных кариозных поражений в ротовой полости пациентов [8, 21]. Поэтому для определения влияния кариеса на компонентный состав зубной биопленки, в том числе при внешней модуляции с помощью ежедневного приема глицерофосфата кальция, вторичная структура белковой сети биопленки была изучена и визуализирована на основе деконволюции полного спектрального профиля полос Amide I и Amide II в ИК-спектрах. Для проведения указанной процедуры спектральные профили в области 1800—1480 см^–1 были проанализированы с помощью программных пакетов обработки данных и моделирования нелинейных кривых Fityk (version 1.3.1) и Origin Lab (b9.5.0.193). Для аппроксимации ИК-спектральных профилей были выбраны гауссовые функции как наиболее корректно описывающие форму колебательных мод в ИК-спектрах [18]. Число максимумов, описывающих спектральные кривые всех образцов, сохранялось неизменным во время процедуры моделирования.

Анализ результатов деконволюции амидных профилей на компоненты, в частности соотнесение максимумов с компонентами вторичной структуры белков, выполнен, исходя из известных работ, в которых изучали белки, в том числе в составе биопленок [11, 12, 21, 22]. В связи с этим в составе профиля инфракрасных полос Amide I и Amide II могут быть обнаружены следующие фундаментальные вторичные структурные элементы: регулярная вторичная структура α-helix β-sheet, β-turn, аминокислотные боковые цепи (amino acid side chains). Большая часть интегральной интенсивности в спектральном профиле соответствует α-helix и β-sheet. При этом в структуре β-sheet, образованном несколькими β-strands, часто выделяют параллельную и антипараллельную компоненты, ровно как для α-helix различают упорядоченную и неупорядоченную (кончики аминокислотных цепей) части [23]. Ранее было показано, что ввиду низкой дисперсии при деконволюции профилей Parallel β-sheet и неупорядоченное содержимое α-helix часто не могут быть прогнозируемы [16]. Поэтому, основываясь на предложенном механизме разложения спектрального профиля зубной биопленки в области полос Amide I и Amide II, мы выделяли следующие компоненты вторичной структуры: α-helix (упорядоченная часть); неупорядоченная компонента; β-sheet с выделенными компонентами Parallel β-strands и Anti-parallel β-strands; β-turn; а также компонента, являющаяся суммой β-turn Anti-parallel и β-turn. Кроме того, значительная часть интенсивности в диапазоне полос Amide I и Amide II в виде перекрывающихся со спектральной областью β-sheet максимумов является вкладом аминокислотных боковых цепей, колебаний CN-, CH-, NH-групп, аминов, а также связей C=O, принадлежащих сложным эфирам липидов и кислот [24].

Для корректной оценки сдвигов в белковом профиле биопленок необходимо использовать не интегральные интенсивности отдельных компонент вторичной структуры, а их процентные веса, т.е. интенсивности, приведенные к общей интегральной интенсивности полного спектрального профиля Amide I и Amide II [22]. Выполненные внутригрупповые попарные сравнения процентных весов компонент вторичной структуры биопленки на первом и втором этапах эксперимента для конкретной группы участников (в норме или при кариозной патологии) позволили выявить влияние модулирующего фактора (таблетки). Для этого использован тест множественных сравнений Данкана. В то же время статистически значимые межгрупповые различия для двух групп участников определены на основе результатов дисперсионного анализа с использованием непараметрического критерия Краскела—Уоллиса. Для этого сравнивали процентные веса соответствующих компонент вторичной структуры для группы пациентов в норме и группы с кариесом зубов как без использования внешнего модулятора (таблетки глицерофосфата кальция) — первый этап исследования, так и после приема этих таблеток — второй этап. Выявленные статистически значимые внутри- и межгрупповые различия на уровне значимости p<0,05 представлены на рис. 2, 3. На рисунках приведена разность (изменение) процентных весов только для тех компонент вторичной структуры, для которых наблюдаются значимые различия. Это позволяет наглядно оценить сдвиг во вторичной структуре в зависимости от кариесогенной ситуации в полости рта и внешней модуляции с применением внутрь таблеток с глицерофосфатом кальция (см. рис. 2, 3).

Рис. 2. Статистически значимые (p<0,05) межгрупповые различия в процентном весе (содержании) компонент вторичной структуры белков зубной биопленки между пациентами 1-й (норма) и 2-й (кариозная) групп на первом этапе эксперимента — без использования лекарственного препарата, предназначенного для минерализации зубной ткани человека (а), и на втором этапе — после применения лекарственного препарата, предназначенного для минерализации зубной ткани человека (б).

Рис. 3. Статистически значимые (p<0,05) внутригрупповые различия в процентном весе (содержании) компонент вторичной структуры белков зубной биопленки до (первый этап эксперимента) и после (второй этап эксперимента) использования модулятора для группы участников с нормальной кариесогенной ситуацией (а) и группы участников с кариозной патологией (активным кариесом) (б).

Сравнительный анализ двух наборов компонент (см. рис. 2), для которых были выявлены статистически значимые различия (сдвиги) в процентных весах при межгрупповых сравнениях (норма—кариес) показал, что использование модулятора (таблетки с глицерофосфатом кальция) статистически значимо отражается на как количественном, так и качественном составе компонент в наборах. Если на первом этапе эксперимента (до использования модулятора) статистически значимые различия в процентных весах при межгрупповых сравнениях обнаружены для 9 компонент (см. рис. 2, а), то после использования таблетки с глицерофосфатом кальция на втором этапе исследования (см. рис. 2, б) — для 7 компонент вторичной структуры. При этом для компонент Parallel β-strands + β-turn, Parallel β-strands, α-helix + δ(N—H) статистически значимые различия (сдвиги) в процентных весах при межгрупповых сравнениях (в норме и при кариесе эмали) регистрируются на обоих этапах исследования (до и после использования модулятора). Кроме того, сдвиг (различия) в процентном весе для этих компонент зависит от этапа исследования. Оба факта указывают на одновременное влияние на эти компоненты вторичной структуры протеинов зубной биопленки как кариесогенной ситуации в полости рта пациентов, так и модулятора — глицерофосфата кальция.

Не менее интересно то, что обнаруженная при межгрупповых сравнениях величина сдвига в процентном весе для компоненты Parallel β-strands фактически не изменяется при использовании таблетки с глицерофосфатом кальция (второй этап исследования; см. рис. 2, б) от той, которая зафиксирована на первом этапе исследования (см. рис. 2, а). Это указывает на то, что изменение процентного веса компоненты Parallel β-strands в полном амидном спектральном профиле происходит под влиянием только кариесогенной ситуации у пациентов, в то время как использование модулятора глицерофосфата кальция не оказывает воздействия.

Известно, что многие вещества, входящие в состав лекарственных препаратов, например свободные аминокислоты, могут влиять на поглощение в области амидных полос [25]. Анализ выявленных статистически значимых изменений в процентных весах при внутригрупповых сравнениях для пациентов в норме или при кариесе зуба до и после использования модулятора — глицерофосфата кальция — подтверждает это. Во-первых, у пациентов в группе без кариеса (в норме) использование таблетированного минерального комплекса с глицерофосфатом кальция приводит к изменению процентных весов практически всех компонент вторичной структуры (см. рис. 3, а). В то же время у пациентов с кариозными очагами эмали при использовании модулятора (глицерофосфата кальция) статистически значимые изменения в процентных весах зафиксированы лишь для части компонент (см. рис. 3, б). При этом можно заметить, что только для компонент β-turn, Parallel β-strands, β-sheet + β-turn не зафиксировано статистически значимых различий в их процентных весах одновременно при внутригрупповых сравнениях норма/кариес до и после применения модулятора — глицерофосфата кальция.

Ранее показано, что дать математическую оценку изменениям, происходящим в молекулярном составе биоаналитов, а также выполнить скрининг развития патологий в ротовой полости позволяет расчет коэффициентов, определяемых из соотношений интенсивностей колебательных полос, ассоциированных со специфическими молекулярными группами в ротовой и десневой жидкостях, и зубной биопленки [26, 27]. Это утверждение базируется на том научно доказанном факте, что, осуществляя проводящие, транспортные и буферные функции, биологические жидкости ротовой полости, а также зубная биопленка имеют характерный набор ионов, комплексов, белков и других молекул, сигнализирующих о развитии инфекций рта или патологических процессах в тканях зуба [10, 28].

Учитывая выявленные особенности во вторичной структуре белковой сети зубной биопленки в норме, при кариесе зуба, а также с учетом применения таблетированного минерального комплекса с глицерофосфатом кальция, можно убедиться, что идеальным кандидатом для скрининга развития заболевания является компонента Parallel β-strands. Изменение частоты и процентного содержания этой компоненты в спектрах зубной биопленки является следствием содержания в ней кариесогенных бактерий Streptococcus mutans, ответственных за возникновение кариеса, а также продуктов их метаболизма — полимеров глюкана [21]. Ввиду того что процентное содержание α-helix во вторичной структуре белков биопленки остается фактически неизменным, расчет важного для белков соотношения будет отражать изменения во вторичной структуре протеинов биопленки, наблюдаемые при развитии кариеса эмали (см. рис. 2). Вычисления показывают, что с учетом модулирующего фактора (использование таблетированного комплекса для минерализации зубной ткани человека) в случае без кариеса зуба (1-я группа пациентов) это соотношение лежит в пределах R~2,5—2,9, в то время как у пациентов с кариесом эмали (2-я группа) — R~3,9—4,2, т.е. увеличено более чем в 1,5 раза. В самом деле, соотношение α-helix/β-sheet, как это уже демонстрировалось ранее J. Titus и соавт. [14], является статистически значимым маркером развития патологических процессов. В работе Y.-T. Huang и соавт. [29] на примере альбумина сыворотки крови человека было доказано, что возникновение внутримолекулярных структур β-sheet связано с агрегацией белковых молекул, а это отрицательно влияет на функционирование белка. Таким образом, представленное эмпирическое соотношение R, найденное из результатов анализа трансформаций вторичной структуры белков зубной биопленки, может быть использовано для экспресс-скрининга и мониторинга развития кариесогенной ситуации в полости рта у пациентов на новом прецизионном диагностическом уровне, в том числе на этапах эндогенной профилактики деминерализации эмали зубов.

Заключение

На основе деконволюции ИК-спектрального профиля полос Amide I и Amide II изучены изменения, происходящие во вторичной структуре белков зубной биопленки. На большом наборе спектров показано, что на прогнозирование вторичной структуры белковой сети биопленки влияет как кариесогенная ситуация в полости рта (при начальных кариозных поражениях эмали), так и применение пациентами модулятора — глицерофосфата кальция (таблетированного минерального комплекса с глицерофосфатом кальция). Несмотря на то что оба фактора не привели к качественному изменению компонентного белкового состава, они нашли отражение в различных количественных характеристиках (изменение частот, FWHM и интегральных интенсивностей) соответствующих компонент вторичной структуры белков зубной биопленки.

Исходя из трансформации полного спектрального профиля полос Amide I и Amide II, были установлены статистически значимые внутри- и межгрупповые различия во вторичной структуре протеинов зубной биопленки для пациентов в норме и при кариесогенной ситуации во рту, в том числе после применения таблетированного минерального комплекса с глицерофосфатом кальция. Это позволило дать математическую оценку сдвигам во вторичной структуре белков в зависимости от активности кариеса и внешней модуляции. Показано, что только для компоненты Parallel β-strands в амидном профиле биопленки зафиксировано статистически значимое (p<0,05) изменение ее процентного содержания (веса) под влиянием кариесогенной ситуации в полости рта. При этом не зафиксировано статистически значимых различий в норме и при кариесе эмали до и после применения модулятора — глицерофосфата кальция. Изменение частоты и процентного содержания Parallel β-strands в спектрах зубной биопленки является следствием содержания в ней кариесогенных бактерий Mutans streptococci, а также продуктов их метаболизма — полимеров глюкана. При этом прогностически достоверным и спектроскопически регистрируемым маркером развития кариозной патологии в ротовой полости может выступить соотношение в амидном профиле.

Полученные в работе результаты могут лечь в основу методики спектроскопической диагностики изменений (сдвигов) в микробиоме рта, приводящих к развитию кариеса зуба зубов, а также стать основой для выбора оптимальных терапевтических путей лечения кариеса эмали, в том числе за счет профилактических мер, направленных на восстановление микрофлоры ротовой полости пациента.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ №23-15-00060.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.