Злоупотребление наркотическими, психотропными средствами и сильнодействующими веществами является острой социальной проблемой. В последнее время среди наркоманов стали популярны такие препараты, как нафазолин, тропикамид и циклопентолат. Они широко используются наркозависимыми людьми как фармакологическая добавка к героину. Кроме того, нафазолин способен изменять картину наркотического опьянения и удлинять его продолжительность, что приводит в случае передозировок к летальному исходу. Нафазолин используется наркоманами также в качестве средства, сужающего сосуды глаз и расширяющего зрачок, для скрытия следов употребления наркотических средств, в частности марихуаны, гашиша и конопли. Немедицинское употребление нафазолина, тропикамида и циклопентолата приобретает угрожающие масштабы. По результатам исследования 2009 г. [1], 80 из 100 респондентов отметили, что хотя бы раз использовали циклопентолат, тропикамид или нафазолин для разведения героина.

В последние годы обращает на себя внимание рост отравлений детей нафтизином и его гомологами (санорин, риназол, галазолин). Это связано с широким использованием препарата без назначения врача, передозировкой и небрежным хранением [2].

Методики химико-токсикологического анализа биологических объектов на присутствие нафазолина отсутствуют или не позволяют сделать заключение об использовании этого лекарственного препарата в немедицинских целях, в том числе при приеме совместно с наркотическими, психотропными средствами.

Цель исследования — разработка методик химико-токсикологического анализа нафазолина в вещественных доказательствах и биологических жидкостях при судебно-химическом и химико-токсикологическом исследовании.

Объекты исследования

— Нафтизин — 0,1% раствор, действующее средство нафазолин является неселективным альфа-адреномиметиком для местного применения. Химическое название: 2-(1-нафтелинилметил)-4,5-дигидро-1Н-имидазол, рКа 10,9. В доступной литературе не удалось разыскать сведений о его фармакокинетике и метаболизме.

— Кодеин, морфин выделены из токси-дисков системы ТОXI – LAB.

— Биологические жидкости (кровь, моча) от экспериментальных животных (крысы).

При проведении исследования в качестве рабочего стандартного образца (РСО) использовали нафазалин, выделенный из лекарственной формы — капли, раствор нафтизина 0,1%, подлинность и чистота которого были подтверждены химическими и физико-химическими методами анализа.

При разработке методик химико-токсикологического анализа нафазолина в вещественных доказательствах и биологических жидкостях применяли следующую аппаратуру:

— ультрафиолетовый спектрофотометр марки СФ 2000;

— высокоэффективный жидкостной хроматограф Waters 2695 с УФ-детектором;

— инфракрасный спектрофотометр марки Спекорд М-80;

— видеоденситометр для тонкослойной хроматографии ДенСкан;

— газовый хроматограф Agilent HP 6850 с масс-селективным детектором НР 5973N (оборудование фирмы «Hewlett Packard», США);

— пластинки Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ на алюминиевой подложке.

Для проведения цветных и осадочных реакций и физико-химических исследований использовали следующие реактивы и растворители: реактив Драгендорфа, реактив Марки, реактив Манделина, кислоту серную концентрированную, раствор железа (III) хлорида, раствор кислоты хлористоводородной 0,1 М, раствор аммония гидроксида 25%, буферные растворы, приготовленные из фиксаналов, pH 4,01 (ацетатный буферный раствор); рН 6,86 (фосфатный буферный раствор); рН 9,18 (боратный буферный раствор); рН 12,43 (гликолевый буферный раствор), натрия сульфат безводный. Растворители марки ХЧ и ЧДА: хлороформ, этанол 95%, ацетон, 2-пропанол, 1-бутанол, этилацетат, гексан, ацетонитрил.

Действующее вещество изолировали посредством жидкость-жидкостной экстракции при различных значениях рН среды: 2,0; 4,01; 6,86; 9,18; 12,43. Для изолирования применяли растворители: хлороформ, этилацетат, гексан, 2-пропанол — хлороформ (1:9). Полученные извлечения пропускали через натрия сульфат безводный в фарфоровые чашки и упаривали.

Процент извлечения нафазолина из водных растворов определяли методом УФ-спектроскопии в растворе кислоты хлористоводородной 0,1 М при длине волны 280 нм по заранее построенному калибровочному графику.

Установили, что максимальное количество нафазолина извлекается хлороформом (92%) и смесью растворителей 2-пропанол-хлороформ 1:9 (83%) с рН 9,18. Использование электролита натрия хлорида приводит к уменьшению процента извлечения (78%), как и использование в качестве экстрагентов этилацетата (41%) и гексана (10%).

Нами предложена следующая методика изолирования анализируемого вещества из вещественных доказательств. К части раствора нафтизина в делительной воронке добавляют боратный буферный раствор с рН среды 9,18 и проводят экстракцию хлороформом трижды по 5 мл в течение 5 мин. Органический слой отделяют, пропускают через натрия сульфат безводный, вытяжки объединяют и выпаривают в токе теплого воздуха до сухого остатка.

Для идентификации нафазолина, выделенного из водного раствора, нами апробированы следующие методы: цветные и осадочные реакции, тонкослойная хроматография (ТСХ), УФ- и ИК-спектроскопия, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и газовая хроматография с масс-селективным детектором (ГХ/МС) [3].

Если обстоятельства проведения экспертизы или оснащение лаборатории не позволяют использовать сложную высокочувствительную аппаратуру, то проводят цветные и осадочные реакции в качестве одного из предварительных этапов исследования (табл. 1).

Тонкослойная хроматография на предварительном этапе служит основным источником информации в судебно-химическом и химико-токсикологическом анализе [4]. Хроматографическое исследование нафазолина проводили методом одномерной восходящей хроматографии в разных системах растворителей на пластинках Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ с алюминиевой подложкой, как и в случае качественного и количественного определения его методом хроматоденситометрии (табл. 2).

Результаты определения хроматографической подвижности нафазолина, тропикамида, кодеина, циклопентолата и морфина представлены в табл. 3.

Оптимальной системой растворителей для определения нафазолина методом тонкослойной хроматографии совместно с тропикамидом, циклопентолатом, кодеином и морфином является система этилацетат — этанол — раствор аммония гидроксида 25% (17:2:1) (табл. 4).

Хроматоденситометрию как еще один современный физико-химический метод, предназначенный для одновременного качественного и количественного определения состава проб, проводили с помощью видеоденситометра ДенСкан. Сначала была установлена линейная зависимость для РСО вещества и проведено его количественное определение в извлечениях из водных растворов (табл. 5).

Для идентификации нафазолина, выделенного из раствора, использовали ИК- и УФ-спектроскопию, а последнюю еще использовали для количественного определения его из биологических жидкостей [5].

ИК-спектры получали из образца нафазолина, выделенного из лекарственной формы препарата Нафтизин (спрессованные таблетки нафазолина с бромидом калия). Спектры снимали на спектрофотометре Спекорд М-80 в пределах 400—4000 см^-1 [6]. В ИК-спектре исследуемого вещества наблюдали полосы валентных колебаний С=С связей ароматических колец в области 1600 см^-1, NH-групп 3300 см^-1 и валентные колебания CH3-групп в области 2800—2920 см^-1. В УФ-спектрах в растворе кислоты хлористоводородной 0,1 М максимумы поглощения нафазолина обнаружили при длине волны 270, 280, 287 и 291 нм. Записанные спектры оказались идентичны спектрам, приведенным в литературе.

Для исследования нафтизина, содержащего нафазолин, совместно с тропикамидом и циклопентолатом методом ГХ/МС использовали оборудование фирмы «Hewlett Packard» (США): газовый хроматограф Agilent HP 6850 с масс-селективным детектором НР 5973N; капиллярную колонку НР — 5 MS (5% фенилметилсилоксан) с внутренним диаметром 0,25 мм и длиной 30 м (НР — 5 MS); газ-носитель — гелий; скорость газа-носителя 0,8 мл/мин; начальная температура 80 °С (0,5 мин), конечная — 290 °C; объем пробы 1 мкл.

Для хроматографирования взяли сухой остаток хлороформного извлечения, который растворяли в 100 мкл метанола. При времени удерживания для нафазолина 12,45 мин в масс-спектре наблюдали характерные пики ионов с m/z 208, 209, 210, 141, 115, 153, 195, 181. Полученный спектр совпадал с данными библиотек. Для циклопентолата и тропикамида время удерживания этим методом в данных условиях составило 7,95 и 16,3 мин.

Идентификацию и количественное определение нафазолина проводили методом ВЭЖХ, позволяющим выделить вещество из сложных смесей органических соединений и одновременно проанализировать его качественно и количественно.

Использовали оборудование фирмы «Waters»: жидкостный хроматограф Waters 2695 с ДМД; колонку Nova-Pak C18 4 мкм 3,9×150 мм; скорость подачи подвижной фазы 400 мкл/мин; время регистрации хроматограммы 20 мин; подвижная фаза: ацетонитрил, фосфатный буфер с рН 3,0 (60:40); температура термостата колонки 30 °C; изократический режим и РСО нафазолина. Фиксировали для нафазолина время удерживания 3,22 мин.

Таким образом, для установления наличия нафазолина в объектах исследования, доставленных на судебно-химическую экспертизу или химико-токсикологическое исследование с места происшествия в качестве вещественных доказательств, следует использовать методы ТСХ, ВЭЖХ, ГХ/МС и УФ- и ИК-спектроскопию, а также цветные и осадочные реакции.

Определение нафазолина в биологических объектах. Для определения процента извлечения из биологических жидкостей готовили модельные комплексы. Использовали образцы мочи и крови от здоровых добровольцев, не принимавших лекарственные препараты в течение 1 мес до отбора проб. Модельные смеси мочи и крови готовили путем добавления рабочего стандартного раствора с концентрацией 1 мг/мл к биожидкостям до получения концентраций 10,0; 50,0; 100,0 мкг/мл. Приготовленные модельные смеси инкубировали при температуре 37 °С в течение 2 ч.

К 5 мл биологической жидкости (кровь, моча) добавляли 5 мл воды очищенной, вносили в пенициллиновый флакон, содержащий 0,3 мл кислоты хлористоводородной концентрированной. Флакон закрывали резиновой пробкой и помещали в металлический контейнер и нагревали 30 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения содержимое флакона центрифугировали и фильтровали. Затем фильтрат помещали в делительную воронку, доводили до значения рН 9,18 буферным раствором и экстрагировали 3 раза хлороформом порциями по 5 мл. Хлороформные извлечения объединяли, пропускали через слой натрия сульфата безводного в фарфоровые чашки и упаривали в токе теплого воздуха. При определении процента извлечения нафазолина использовали УФ-спектроскопию (табл. 6).

Разработанные методики химико-токсикологического анализа нафазолина в биологических жидкостях были апробированы на экспериментальных животных, поскольку они в определенной степени воспроизводят процессы, происходящие с ксенобиотиками при введении последних в живой организм.

Исследование проводили на 15 экспериментальных животных — белых беспородных крысах-самцах массой 180—220 г. Раствор препарата нафтизин вводили однократно внутрибрюшинно в количестве 1—2 мг действующего вещества с последующим введением водной нагрузки. Контрольную группу составили 5 животных, которым внутрибрюшинно вводили воду для инъекций. Забор крови производили из десны через 1, 2, 4, 6 и 24 ч, забор мочи — в течение 24 ч. Для установления элиминации нафазолина забор мочи осуществляли после введения препарата в течение 24 ч. Для анализа брали по 4—5 мл крови и мочи от каждого животного.

Изолирование нафазолина из биологических жидкостей животных проводили по разработанной нами методике.

Для анализа извлечений из биологических жидкостей после очистки использовали ТСХ, УФ- и ИК-спектроскопию, ВЭЖХ и ГХ/МС.

В извлечении из крови нафазолин был обнаружен через 1 и 2 ч, а через 4 ч препарат не обнаружили. При исследовании извлечения из мочи, собранной в течение 24 ч, выявили нафазолин и его метаболит, структура которого не установлена.

С помощью ТСХ наблюдали пятна по значению Rf, окраске и флюоресценции соответствующие РСО нафазолина, выделенного из раствора препарата нафтизин. По данным ВЭЖХ (кровь — 3,22; моча — 3,25) и ГХ/МС (кровь — 12,50; моча — 12,46), значения времени удерживания и масс-спектр вещества, выделенного из биожидкостей, совпадали с таковыми, полученными при анализе нафазолина, выделенного из раствора нафтизина.

К сожалению, не удалось очистить анализируемое вещество от компонентов биологической матрицы, поэтому использование ИК-спектроскопии наиболее оправдано при анализе вещественных доказательств — капли нафтизин.

Количественное определение нафазолина, выделенного из биологических жидкостей, проводили параллельно методами ВЭЖХ, хроматоденситометрии и УФ-спектрометрии (табл. 7).

Сравнивая результаты трех методов, можно судить об их сопоставимости. Относительная погрешность определения составляет 2% для денситометрии, 0,68% для спектрофотометрического метода и 1,6% для ВЭЖХ, т.е. результаты методов можно считать достоверными с вероятностью 95%.

1. Изолирование из вещественных доказательств анализируемого вещества следует проводить с помощью жидкость-жидкостной экстракции хлороформом при рН 9,18, а из биожидкостей в тех же условиях — после кислотного гидролиза для мочи и для крови.

2. Установлено, что ТСХ, ГХ/МС, ВЭЖХ, УФ-спектроскопия позволяют идентифицировать компонент препарата нафтизин в вещественных доказательствах и биологических жидкостях.

3. Разработаны условия для количественного определения нафазолина, выделенного из биологических жидкостей, методами высокоэффективной жидкостной хроматографии, УФ-спектрофотометрии и денситометрии.