Баклофен [4-амино-3-(4-хлорфенил)-бутановая кислота] — лекарственный препарат, относящийся к группе веществ, влияющих на нервно-мышечную передачу. Основное проявление его фармакологической активности  — антиспастическое действие, он угнетает спинальные и висцеральные рефлексы, уменьшает мышечное напряжение (снижает тонус скелетных мышц), клонус, оказывает также аналгезирующее действие [1].

В литературе [2, 3] описаны случаи острых отравлений от передозировки баклофена, его концентрация в сыворотке крови 1,1—3,5 мкг/мл (токсическая концентрация). В случаях смертельных отравлений концентрация баклофена в сыворотке крови может достигать 17 мкг/мл, а в моче 760 мкг/мл [4, 5].

Для анализа баклофена используют методы газовой хроматографии, газовой хромато-масс-спектрометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым, флюоресцентным, масс-селективным или электрохимическим детектором [4, 6—9]. Анализ данных литературы показал, что систематического исследования баклофена в химико-токсикологическом и судебно-химическом плане не проводилось. Описанные в литературе [6, 7] методики определения баклофена предусматривают использование таких дорогостоящих и труднодоступных реагентов, как о-фталевый альдегид, ион-парные реагенты и др., которые повышают чувствительность методики, но сложны в использовании для рутинного анализа.

Цель исследования — подобрать и разработать более простые методики качественного и количественного определения баклофена в биологических объектах, пригодные для использования в судебно-химическом анализе.

Реактивы и материалы. Использовали баклофен («Sigma», США), фенибут (РУП БЕЛМЕДПРЕПАРАТЫ, Беларусь), трихлоруксусную кислоту (квалификация «чистый для анализа»), ацетонитрил («Pancreac», Испания), метанол («Sigma», США), ацетат аммония (квалификация «химически чистый»), наборы реагентов VetexQ Tox («Интерлаб», Россия).

Приготовление стандартных растворов. Навеску стандартного образца баклофена растворяли в 0,1% водном растворе муравьиной кислоты. Концентрация баклофена в рабочем растворе составляла 1 мкг/мл. В качестве внутреннего стандарта использовали водный раствор фенибута (4-амино-3-фенилбутановая кислота) с концентрацией 1 мкг/мл, приготовленный путем растворения медицинского препарата в 0,1% водном растворе муравьиной кислоты. Далее нерастворившиеся компоненты лекарственной формы удаляли фильтрованием.

Оборудование: газовый хроматограф Agilent 6890 с автосамплером Agilent Technologies 7683 В и масс-селективным детектором 5975 c кварцевой капиллярной колонкой НР-5MS (30 м × 0,25 мм × 0,25 мкм); жидкостный хроматограф UltiMate 3000 («Dionex», Германия) с масс-спектрометрическим детектором, тройной квадруполь с линейной ионной ловушкой QTRAP 5500 (AB Sciex, Канада), оснащенный колонкой Zorbax Eclipse XDB-C18 (5 мкм, 150 × 4,6 мм).

Подготовка биологических проб для анализа. Пробоподготовку образцов крови проводили по следующей методике. К 1 мл крови добавляли 50 мкл раствора внутреннего стандарта фенибута (концентрация 1 мкг/мл), 2—3 капли 50% раствора трихлоруксусной кислоты, выдерживали на шейкере 15 мин, затем центрифугировали 15 мин при скорости 4000 об/мин. Далее 20 мкл надосадочного слоя переносили в виалу и добавляли 980 мкл дистиллированной воды. Для построения градуировочного графика использовали трупную кровь, предварительно проверенную на отсутствие лекарственных веществ, в которую вводили расчетное количество рабочего раствора баклофена.

Пробоподготовку внутренних органов (печень, стенка желудка) проводили по методике QuEChERS, оптимизированной для судебно-химических исследований органов на наличие лекарственных и наркотических веществ [10] с использованием наборов VetexQ Tox. Навеску 5 г исследуемой печени или стенки желудка гомогенизировали, помещали во флакон вместимостью 15 мл, прибавляли 50 мкл раствора этилморфина концентрации 0,1 мг/мл (внутренний стандарт) и 5 мл ацетонитрила, перемешивали, встряхивали в течение 1 мин. Затем добавляли 0,1 мл концентрированного хлороводорода и смесь солей для экстракции из набора VetexQ Tox. Полученную смесь обрабатывали на ультразвуковой ванне в течение 20 мин и центрифугировали при скорости 4000 об/мин 20 мин. Надосадочный слой в количестве 3 мл переносили во флакон вместимостью 15 мл, содержащий набор солей для очистки из набора VetexQ Tox. Смесь встряхивали в течение 5 мин и центрифугировали 10 мин при скорости 2000 об/мин. По 1 мл экстрактов печени и стенки желудка выпаривали досуха во флаконе, к сухим остаткам добавляли по 0,2 мл смеси уксусного ангидрида с пиридином (3:2), флаконы закрывали, встряхивали в течение 30 с и помещали в термостат при температуре 70 °C на 30 мин. По окончании реакции избыток реактивов выпаривали досуха в токе воздуха при температуре не выше 50 °C. Сухие остатки растворяли в 0,2 мл обезвоженного этилацетата и исследовали методом ГХ/МС.

Условия анализов методами ГХ/МС и ВЭЖХ/МС-МС

Метод ГХ/МС. Режим программирования температуры колонки: начальная температура термостата колонки 80 °C, экспозиция при начальной температуре 1 мин, далее нагрев до температуры 200 °C со скоростью 40 °С/мин и до температуры 300 °C со скоростью 12,5 °С/мин, экспозиция 10 мин при конечной температуре. В качестве газа-носителя использовали гелий (марка А); скорость потока газа-носителя 1,2 мл/мин (режим постоянного потока). Температура инжектора — 250 °C. Ввод пробы осуществляли с помощью автосамплера в режиме без деления потока (Splitless); объем пробы 1 мкл. Ионизация электронным ударом (70 эВ). Время задержки растворителя 3,5 мин, режим сканирования ионов в диапазоне от 40 до 600 а.е.м. Идентификацию масс-спектров проводили с использованием библиотек масс-спектров NIST 11, MPWTOX7 и Wiley7.

Метод ВЭЖХ/МС-МС. Температура термостата колонки 37 °C, элюент — ацетонитрил-метанол-0,65 мM раствор ацетата аммония (15:15:70), изократический режим, скорость потока элюента 1 мл/мин. Объем вводимой пробы 20 мкл. Масс-спектрометр работал в режиме регистрации положительных ионов, ионизация электроспреем. Условия работы источника ионов: температура источника ионов 500 °C, напряжение на капилляре (IS) 5,5 кВ, давление газа на небулайзере (Gas 1) 50 psi, давление осушающего газа (Gas 2) 50 psi, давление газа-завесы (CUR) 25 psi. Программа обработки данных Analyst 1.5.2 («Applied BioSystem», США), с помощью которой были подобраны параметры MRM переходов (табл. 1).

Для исследования в судебно-химическое отделение Красноярского краевого бюро судебно-медицинской экспертизы доставлены кровь и внутренние органы (печень, желудок) от трупа гражданки В. 1988 г. р., обнаруженной в ванне без признаков насильственной смерти с выраженными гнилостными изменениями. Выпила 50 таблеток баклофена по 25 мг.

При исследовании экстрактов органов методом ГХ/МС на хроматограмме идентифицировали два пика: 4-(4-хлорфенил)-2-пирролидинон и N-ацетил-4-(4-хлорфенил)-2-пирролидинон (рис. 1).

Время удерживания 4-(4-хлорфенил)-2-пирролидинона 7,26 мин, N-ацетил-4-(4-хлорфенил)-2-пирролидинона — 7,43 мин (рис. 2).

Идентифицированые вещества представляют собой продукты внутренней циклизации баклофена с выбросом молекулы воды. Они образуются как в результате действия таких водоотнимающих веществ, как уксусный ангидрид, так и при термическом воздействии в инжекторе газового хроматографа. Обнаруженные соединения являются маркерами присутствия баклофена в экстрактах при анализе их методом ГХ/МС.

Методика экстракции из внутренних органов с использованием наборов VetexQ Tox и анализ экстрактов методом ГХ/МС подходят для обнаружения и качественного определения баклофена в органах, при этом количественное определение баклофена невозможно, так как из одного соединения образуется два артефакта с переменным их соотношением.

Для количественного подсчета баклофена в крови использовали метод ВЭЖХ/МС-МС, селективность и чувствительность которого позволяют выявлять малые количества исследуемых веществ. При параметрах анализа, приведенных ранее, время удерживания баклофена составило 3,59 мин, внутреннего стандарта фенибута — 2,95 мин (рис. 3).

Провели валидацию методики количественного определения баклофена в крови по показателям линейности, специфичности, правильности, повторяемости и предела обнаружения.

Линейность градуировочного графика доказана в диапазоне концентраций от 50 до 4000 нг/мл. Уравнение зависимости аналитического сигнала от концентрации баклофена в крови имеет вид: y=0,0232 x + 0,0931, коэффициент корреляции 0,9997.

Специфичность методики подтверждали, исследуя образцы крови, содержащей баклофен, и в его отсутствие. На хроматограммах образцов крови, не содержащих баклофена, пики отсутствовали. Таким образом, методика отличается высокой специфичностью, что подтверждается отсутствием пиков эндогенных соединений в месте элюирования баклофена.

Правильность и повторяемость методики устанавливали методом «введено—найдено» по 11 концентрационным уровням градуировочного графика в трех параллельных измерениях (табл. 2). Согласно статистической обработке результатов экспериментов по определению правильности и повторяемости методики, отклонение от истинного значения не превышает 5%, а относительное стандартное отклонение в пределах 0,2—2,1%.

Предел обнаружения баклофена в крови составил 5 нг/мл, который рассчитывали как наименьшую концентрацию баклофена, при которой отношение сигнал—шум составляло 10:1.

Таким образом, разработанная методика количественного определения баклофена в крови характеризуется специфичностью, линейностью, правильностью, повторяемостью, низким пределом обнаружения и небольшим временем проведения анализа.

Концентрация баклофена в крови гр-ки В. при первичном анализе оказалась выше аналитической области разработанной методики, поэтому повторный анализ провели из 0,2 мл исследуемой крови, разбавленной дистиллированной водой до объема 1 мл.

Концентрация баклофена в крови гр-ки В. была определена по градуировочному графику с учетом разбавления исследуемой крови в 50 раз и составила 6650 нг/мл (6,65 мкг/мл), что превышает токсическую концентрацию [2—4].

1. Предложена методика количественного определения баклофена в крови методом ВЭЖХ-МС/МС, которая имеет очень низкий предел обнаружения и удовлетворяет требованиям валидации. В связи с этим данная методика пригодна не только для применения в судебно-химическом анализе, но и в клиническом токсикологическом и терапевтическом мониторинге.

2. Методика пробоподготовки QuEChERS, оптимизированная для судебно-химических исследований органов на наличие лекарственных и наркотических веществ, может быть использована для обнаружения баклофена в органах при исследовании экстрактов методом ГХ/МС.